Комплексная оценка системного и локального иммунитета, факторов воспаления и клинических показателей у больных раком желудка

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лабораторные методы

Анализ показателей субпопуляций лимфоцитов периферической крови и опухолевой ткани осуществлялся методом проточной цитометрии в целях определения структуры иммунных клеток: степени инфильтрации опухолевой ткани лимфоцитами (CD45+CD14-TILs), число Т-клеток (CD3+CD19-TILs), В-клеток (CD3-CD19+TILs), NK-клеток (CD3-CD16+CD56+TILs), эффекторных клеток CD16 (CD16+Perforin +TILs), CD8 (CD8+Perforin +TILs)

и их цитотоксического потенциала — CD16ЦТПTILs и CD8ЦТПTILs, субпопуляций регуляторных Т-клеток — NKT-клеток (CD3+CD16+CD56+TILs), регуляторных CD4 (CD4+CD25+CD127-TILs) и CD8 (CD8+CD11b-CD28-TILs) клеток и данных показателей клеточного иммунитета. В целях определения пространственного распределения интратуморальных (iTILs) и стромальных (sTILs) субпопуляций лимфоцитов методом иммуногистохимии исследовались показатели субпопуляций CD4+TILs, CD8+TILs и соотношения CD4+/CD8+TILs. Для выявления прогностической ценности клинических маркеров воспаления был проведен расчет следующих соотношений (по результатам клинического анализа крови на этапе исходной оценки): 1) нейтрофильно-лимфоцитарный индекс (НЛИ); 2) тромбоцитарно-лимфоцитарный индекс (ТЛИ).

Проточно-цитометрический анализ

Структуру субпопуляций иммунокомпетентных клеток оценивали по связыванию с моноклональными антителами различной специфичности методом многопараметро-вого количественного анализа на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences). Для каждого образца анализировали не менее 500–5000 клеток в CD45+гейте. Использовали DotPlot-анализ цитограмм с коммерческим программным обеспечением BD CellQuest PRO software (BD Biosciences). Дальнейшую обработку FSC-файлов первичных цитометрических данных проводили с использованием программного пакета WinMDI, версия 2.8.

Иммуногистохимический анализ

На образцах из парафиновых тканей, фиксированных формалином, использовались следующие первичные моноклональные антитела: клон анти-CD4 113 (разведение 1:200; Sino Biological, BDA, Beijing, PR China) и клон анти-CD8SP16 (разведение 1:150; Thermo Scientific, Fremont, CA). Количество иммунных клеток определяли отдельно в интратуморальной и перитуморальной ткани. С помощью микроскопического исследования (×400; BX51; Olympus, Токио, Япония) каждое сечение оценивали на наличие иммунных клеток. Количество иммунных клеток в 10 полях накапливалось и затем усреднялось для расчета среднего числа для 1 компьютеризированного 400-кратно увеличенного микроскопического поля (0,1590 мм ² /поле).

Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка материала и расчеты показателей проведены с использованием статистического пакета программ Statistica for Windows v. 10 и SPSS v21. Достоверность различий между количественными показателями вычисляли по критерию t Стьюдента для нормально распределенных величин или по непараметрическим критериям Манна–Уитни и Вилкоксона. Для сравнения качественны × 2 параметров применяли точный критерий Фишера и χ2. Различия считали значимыми при p <0,05 (95% точности). Степень взаимосвязи параметров оценивали с помощью корреляционного анализа по Спирмену.

Статистическая обработка материала и расчеты показателей проведены с использованием статистического пакета лицензионных программ Statistica для Windows v. 10 (однофакторный анализ, корреляционный анализ по Спирмену, описательная статистика сравнения количественных показателей по Манну–Уитни, анализ Каплана–Майера) и SPSS v21 (ROC-кривые, многофакторный анализ). Количественные переменные отклонялись от нормального распределения (тест Колмогорова–Смирнова) и представлены медианой с указанием 25-го и 75-го квартилей. Категориальные переменные выражали в процентах и абсолютных значениях.

Статистическую значимость различий между количественными показателями вычисляли по t-критерию Стьюдента по непараметрическим критериям Манна–Уитни и Вилкоксона. Для сравнения качественных параметров применяли точный критерий Фишера и χ ² . Различия считали значимыми при p <0,05 (допустимый уровень α-ошибки 5%). Степень взаимосвязи параметров оценивали с помощью корреляционного анализа по Спирмену. Определение границ с оптимальным соотношением чувствительности и специфичности выполняли методом построения ROC-кривой.

Основные оцениваемые параметры

Основными конечными точками в данном исследовании были ОВ и ВБП. ОВ определяли как время от момента постановки диагноза РЖ до момента смерти пациента от любой причины либо до даты последнего контакта с больным. ВБП определяли как время от начала лечения заболевания до времени регистрации роста имеющихся проявлений болезни либо появления новых метастатических очагов. Сравнение кривых выживаемости — с использованием log-rank-теста. Показатели выживаемости рассчитывали из реальных данных о длительности жизни каждого больного на момент завершения исследования с использованием методики Каплана–Мейера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика пациентов

В исследование было включено 45 пациентов РЖ — 19 (42,2%) мужчин и 26 (57,8%) женщин. Возраст пациентов варьировал от 37 до 80 лет (средний возраст 60,9±10,9 года, медиана 62 года). В зависимости от разбиения пациентов на возрастные группы — до 45 лет, 46–60 лет и старше 60 лет — пациенты преимущественно относились к III группе (18 (72,0 %) и 9 (45%) к I и II группам, соответственно. Двадцать пять (55,6%) пациентов с локализованным РЖ получили на первом этапе хирургическое лечение (из них 16 (64%) пациентов получали адъювантную терапию) и 20 (44,4%) пациентов с IV стадией получили химиотерапию (II группа) в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» в 2017–2018 гг. Среднее время наблюдения за больными составило 16,4±6,2 мес. (от 0,7 до 23,6 мес, медиана 18,5 мес). В I и II группах, по гистологическому строению опухоль была преимущественно низкодифференцированной (56% и 60%) и представлена кишечным типом Lauren (64% и 60%). В хирургической группе у 2 пациентов (4%) имел место высокий уровень MSI.

Исследование клеточного иммунитета в периферической крови

Полученные результаты представлены в табл. 1.

Показатели клеточного иммунитета в крови	Хирургическая группа (I) (n= 25)		Химиотерапевтическая группа (II) (n= 20) p		P
	медиана	квартили	медиана	квартили
CD3 +CD19 -	74,3	71,4–84,7	72,5	64,2–81,8	0,560
CD3-CD19 +	1,6	1,3–2,2	1,0	0,6–1,5	0,017
CD3-CD16 +CD56 +	11,8	7,3–25,0	21,3	9,4–30,4	0,140
CD3 +CD4 +	39,7	29,6–45,5	37,3	32,0–49,1	0,828
CD3 +CD8 +	32,8	23,0–41,2	24,7	20,5–33,6	0,074
CD16 +Perforin+	12,1	8,5–18,7	19,1	14,6–27,2	0,016
CD16ЦТП	66,7	42,5–75,5	81,9	63,0–90,3	0,010
CD8 +Perforin+	19,0	14,6–25,3	23,5	12,8–27,3	0,515
CD8ЦТП	55,6	42,9–66,3	64,3	52,0–72,7	0,084
CD3 +CD16 +CD56 +	15,9	8,7–25,1	11,1	8,7–18,4	0,167
CD4 +CD25 +CD127 -	7,7	6,2–9,1	6,9	5,4–8,4	0,134
CD8 +CD11b-CD28 -	9,5	6,2–13,7	11,3	7,7–13,2	0,457

Показатели клеточного иммунитета в ткани Хирургическая группа (I) (n= 25) Химиотерапевтическая группа (II) (n= 20) р медиана квартили медиана квартили CD45 +CD14-TILs 6,8 1,9–14,0 3,4 1,9–10,5 0,001 CD3 + CD19-TILs 76,6 65,3–85,9 86,3 72,2–89,9 0,112 CD3-CD19 +TILs 6,0 1,6–25,6 4,2 1,7–17,7 0,343 CD3-CD16 +CD56 +TILs 3,2 1,4–5,2 6,9 3,2–9,8 0,019 CD3 +CD4 +TILs 37,4 27,8–49,6 37,0 26,6–55,6 0,954 CD3 +CD8 +TILs 30,6 22,4–43,2 39,0 27,2–54,7 0,204 CD16 +Perforin+TILs 0,5 0,0–1,2 4,3 1,9–6,0 0,002 CD16ЦТПTILs 17,9 0,0–30,8 42,3 15,3–56,3 0,181 CD8 +Perforin+TILs 1,8 0,7–3,1 7,7 3,0–28,6 0 0,002 CD8ЦТПTILs 4,6 2,6–9,2 16,7 5,7–65,1 0,034 CD3 +CD16 +CD56 +TILs 5,1 2,3–7,5 11,2 6,1–13,8 0 0,002 CD4 +CD25 +CD127-TILs 15,4 6,6–20,9 9,7 4,7–16,2 0,228 CD8 +CD11b-CD28-TILs 53,8 43,2–60,3 41,9 33,3–69,6 0,262 сравнению с I–III (1,0 против 1,6; p =0,017). Напротив, по сравнению с I группой у пациентов II группы содержание CD16+Perforin +эффекторных лимфоцитов и их цитотоксического потенциала оказалось выше 19,1 % против 12,1 %, (р =0,016); 81,9% и 66,7%, (р =0,010) соответственно.

Исследование клеточного состава опухолевой ткани методом проточной цитометрии

Полученные результаты представлены в табл. 2.

Подгрупповой анализ опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TILs) у 45 пациентов РЖ показал, что медиана процентного содержания TILs (CD45+CD14-TILs) достоверно выше у пациентов с I–III стадиями заболевания по сравнению с мРЖ — 6,8% против 3,4% (р =0,001). Напротив, медиана процентного содержания NK-клеток (CD3-CD16+CD56+TILs) повышается по мере увеличения стадии заболевания с 3,2% в I группе до 6,9% во II группе (р =0,019). Медиана процентного содержания эффекторных CD16 (CD16+Perforin +TILs)

у пациентов мРЖ достоверно выше по сравнению с пациентами с локализованными формами РЖ 4,3–0,5%, (р =0,002). Схожая закономерность выявлена и для клеток-эффекторов CD8 (CD8+Perforin + TILs) и CD8ЦТП, составив 7,7–1,8% (р =0,002) и 16,7–4,6% (р =0,034), соответственно. Высокое содержание NKT-клеток (CD3+CD16+CD56+TILs) отмечено у больных мРЖ по сравнению с I–III стадиями заболевания (11,2% и 5,1%, р =0,002).

Исследование клеточного состава опухолевой ткани методом иммуногистохимии

Полученные результаты представлены в табл. 3.

При проведении подгруппового анализа субпопуляций лимфоцитов CD4+TILs, CD8+TILs, соотношения CD4+/CD8+TILs методом иммуногистохимии выявлено, что число стромальных TILs статистически значимо выше в I группе по сравнению со II, у пациентов которой данные субпопуляции sTILs не встречались (медианы 21,9 про-

Показатели клеточного иммунитета в ткани		Хирургическая группа (I) (n= 25)		Химиотерапевтическая группа (II) (n= 20)		p
		Медиана	Квартили	Медиана	Квартили
CD4+ TILs (кл/п. зр.)	CD4 +TILs	22,2	10,5–38,5	0,4	0–1,1	0,001
	CD4 +iTILs	1,1	0,4–7,4	0,2	0–1,1	0,021
	CD4 +sTILs	21,9	7,7–26,5	0	0–0	0,003
CD8+ TILs (кл/п. зр.)	CD8 +TILs	53,5	39,1–106,9	3,0	0–9,0	0,002
	CD8 +iTILs	24,1	4,9–37,3	3,0	0–9,0	0,0027
	CD8 +sTILs	38,0	11,7–54,9	0	0–0	0,004
CD4+/CD8+ TILs	CD4+/CD8+TILs	0,35	0,19–0,54	0,04	0–0,32	0,001
	CD4+/CD8+iTILs	0,06	0,007–0,59	0,04	0–0,27	0,157
	CD4+/CD8+sTILs	0,48	0,20–0,61	0	0–0	0,002

Показатели клинических маркеров воспаления Хирургическая группа (I) (n= 25) Химиотерапевтическая группа (II) (n= 20) р медиана квартили медиана квартили Показатели периферической крови (109/л) нейтрофилы 4,90 3,17–8,84 3,63 3,04–5,17 0,147 тромбоциты 265,0 222,0–311,0 270,0 221,0–348,5 0,793 лимфоциты 2,13 1,65–2,75 1,68 1,44–2,40 0,337 Относительные индексы НЛИ 2,29 1,36–4,99 2,19 1,55–2,85 0,954 ТЛИ 120,19 92,11–168,56 154,0 113,0–228,76 0,278 тив 0, р =0,0003; 38,0 против 0, р =0,000004; CD4+/CD8+, р =0,00001, соответственно). Достоверная связь наименьшего значения CD4+iTILs и CD8+iTILs реже отмечалась у пациентов мРЖ (р =0,02, rs =0,70; р =0,0027, rs =0,65) по сравнению с локализованными стадиями заболевания.

Исследование показателей клинических маркеров воспаления

Полученные результаты представлены в табл. 4.

За время наблюдения с медианой 18,5 (15,2–20,4) месяцев от прогрессирования основного заболевания умерли 3 (12%) из 25 больных I группы и 10 (50%) из 20 пациентов II группы (р =0,007). Прогрессирование заболевания зарегистрировано у 29 (62,2%) пациентов: у 20 (100%) во II группе и у 9 (36%) в 1-й. В I группе 1-годичная ОВ составила 92,0 ± 5,4%, во II-й — 70,0 ± 10,2%; 1-годичная ВБП — 64,0 ± 9,6% и 10,0 ± 6,7%, соответственно.

Для определения независимых прогностических признаков, влияющих на показатели ВБП и ОВ, выполнен последовательный регрессионный анализ Кокса. В него были включены показатели системного и локального иммунитета, а также показатели системного воспаления, определенные методом проточной цитометрии и иммуногистохимии.

Для оценки прогностической ценности индексов на выживаемость, мы использовали:

— НЛИ <1,43 — низкий, НЛИ =1,43–3,05 — нормальный и НЛИ >3,05 — высокий уровень;

— ТЛИ <111,6 — низкий, ТЛИ = 111,6–208,7 — нормальный и ТЛИ >208,7 — высокий уровень.

По данным однофакторного анализа (ОФА) для ОВ I группы достоверно значимыми оказались CD3+TILs (относительный риск (ОР) 0,894; 95% доверительный интервал (ДИ) 0,813–0,983; р =0,021), CD3+CD8+TILs (ОР 0,782; 95%ДИ0,631–0,970; р =0,026) и CD8+CD11b-CD28-TILs (ОР 0,935; 95%ДИ0,885–0,989; р =0,018), соответственно (рис. 1).

Для ВБП больных I группы достоверно значимыми оказались CD3+TILs (ОР 0,915, 95%ДИ0,862–0,971, р =0,003), CD3-CD16+CD56+TILs (ОР 1,195; 95%ДИ 1,042–1,369; р =0,011), ТЛИ по диапазонам (ОР 0,21; 95%ДИ 0,06–0,72; р =0,013), CD4+/CD8+iTILs (ОР 3,26; 95%ДИ 1,09–9,78; р =0,035), соответственно (рис. 1, 2).

По данным однофакторного анализа для ОВ II группы достоверно значимыми оказались уровни нейтрофилов (ОР 1,33; 95%ДИ 1,08–1,65; р =0,008), тромбоцитов (ОР 1,01; 95%ДИ 1,00–1,02; р =0,006), CD3+CD19- (ОР 0,91; 95%ДИ 0,085–0,97; р =0,007) и CD3-CD16+CD56+ (ОР 1,09; 95%ДИ 1,02–1,16; р =0,007) периферической крови, а также CD3-CD16+CD56+TILs (ОР 1,202; 95%ДИ 1,011–1,429;

СПЗ+TILs

CD3+CD8+TILS

CD8-KD1 1Ь-CD28-TILS

А. Общая выживаемость

CD3+TlLs

CD4+/CD8+iTILs

ТЛИ по диапозонам

CD3-CD16+CD56+TILS

Б. Выживаемость без прогрессирования

Рисунок 1. Величина рисков, влияющих на ОВ и ВБП у больных I группы.

Рисунок 2. Влияние тромбоцитарно-лимфоцитарного индекса на ВБП у больных I группы.

р =0,037) и CD3+CD16+CD56+TILs (ОР 1,112; 95%ДИ 1,012– 1,221; р =0,027) опухолевой ткани (рис. 3).

Для ВБП II группы достоверно значимыми оказались возраст пациентов (ОР 1,06; 95%ДИ 1,01–1,12; р =0,012), уровень нейтрофилов (ОР 1,34; 95%ДИ 1,07–1,67; р =0,010), тромбоцитов (ОР 1,01; 95%ДИ 1,01–1,02; р =0,0006), НЛИ (ОР 2,80; 95%ДИ 1,36–5,75; р =0,005), CD3-CD16+CD56+ (ОР 1,05; 95%ДИ 1,01–1,10; р =0,023) и ЦТПCD16 (ОР 1,06; 95%ДИ 1,01–1,11; р =0,018) периферической крови, а также CD45+CD14-TILs (ОР 1,003; 95%ДИ 1,000–1,006; р =0,041), CD3+CD19-TILs (ОР 0,952; 95%ДИ 0,908–0,998; р =0,041), CD3-CD19+TILs (ОР 1,058; 95%ДИ 1,001–1,117; р =0,045) опухолевой ткани (рис. 3–6).

Выполнение многофакторного регрессионного анализа по Коксу для ОВ I группы не позволило построить значимую математическую модель с независимыми факторами. Однако многофакторный регрессионный анализ по Коксу

выживаемость

Рисунок 3. Величина рисков, влияющих на ОВ и ВБП у больных II группы.

Б. Выживаемость без прогрессирования

для ВБП показал, что увеличение относительного содержания Т-клеток (CD3+CD19-TILs) является благоприятным фактором прогноза у больных I группы (ОР 0,865, 95% ДИ 0,782–0,957, р =0,005). Напротив, повышение NK-клеток (CD3-CD16+CD56+TILs) ухудшает показатель ВБП (ОР 1,382, 95% ДИ 1,087–1,758, р =0,008).

Многофакторный регрессионный анализ по Коксу для ОВ II группы показал, что увеличение уровня нейтрофилов в периферической крови (ОР 1,64, 95% ДИ 1,12–2,40, р =0,011), а также увеличение инфильтрации опухолевой ткани NK-клетками (CD3-CD16+CD56+TILs) (ОР 1,42, 95%ДИ 1,06–1,89, р =0,017) являются факторами неблагоприятного прогноза для ОВ у больных мРЖ.

Многофакторный регрессионный анализ по Коксу для ВБП II группы продемонстрировал, что увеличение возраста (ОР 1,106, 95%ДИ 1,020–1,199, р =0,015), уровня нейтрофилов (ОР 1,714, 95%ДИ 1,063–2,764, р =0,027) и тромбоцитов (ОР 1,017, 95%ДИ 1,006–1,029, р =0,003) ухудшают показатель выживаемости без прогрессирования у больных мРЖ.

Рисунок 4. Влияние уровня нейтрофилов (норма/не норма) на показатели выживаемости: А — ОВ; Б — ВБП у больных II группы

0,0

Cum^a’w Proportion SurvMng (Kaplan-Meter) о Прогрессирование ♦ Без прогрессмроавамия

VO

0.9

0.8

0.7

0.4

0.3

0.2

0.1

£ 0.6

Время наРлодемя, мае

Рисунок 5. Влияние уровня тромбоцитов (норма/не норма) на показатели выживаемости: А — ОВ; Б — ВБП у больных II группы

uumuiaiive иоролюп surviving (карап-ме-ег) о Прогрессиревание ♦ Без прогрессирования

ОБСУЖДЕНИЕ

Развитие злокачественной неоплазии является сложным процессом, зависящим от взаимодействия отдельных клеток в опухоли, микроокружения и иммунной системы, которые могут как стимулировать, так и подавлять рост и инвазию опухоли [12]. Результаты данного исследования, где содержание Т-клеток является фактором благоприятного прогноза для ОВ больных мРЖ, а увеличение NK-клеток ухудшает показатели ОВ и ВБП у больных мРЖ согласуются с исследованием Bass et al. [13]. Исследование сопряженности 2-х групп (Т-клеток и NK-клеток) 152 образцов периферической крови больных РЖ показало, что у пациентов группы Т-клеток в сравнении с группой NK-клеток значимо чаще наблюдается инвазия опухоли в пределах слизистой (Т1) — 32,6% против 14,3% (р =0,03) — и чаще диагностируется I стадия заболевания:

Рисунок 6. Влияние нейтрофильно-лимфоцитарного индекса на ВБП у больных II группы.

36,8% против 19%, (р =0,01). У пациентов группы NK-клеток чаще наблюдаются метастазы в лимфатические узлы второго порядка — 38% против 17,6% (р = 0,02) — и отдаленные метастазы (19,5% против 4%, р =0,03) в сравнении с противоположной группой [13]. С одной стороны, приведенные выше данные позволяют предположить, что существуют процессы взаиморегуляции между указанными направлениями дифференцировки предшественников Т-и NK-клеток. Возможно, подобный баланс является одним из механизмов адаптации при развитии стресс-реакции. С другой стороны, такая сопряженность может говорить об обратном: указанные клетки близки по происхождению, но их лимфопоэз идет независимо, поэтому факторы, вызывающие угнетение Т-клеток, не влияют на NK-клетки, которых продуцируется «нормальное» количество, и их становится «относительно» больше (и наоборот).

Полученные нами результаты свидетельствуют о возможности использования показателей клеточного иммунитета опухолевой ткани, системного иммунитета и воспалительного ответа у больных РЖ в качестве дополнительных прогностических маркеров оценки ВБП и ОВ.