Комплексная стимуляция регенерации периферического нерва после отсроченной нейрорафии

¹Введение. Лечение и реабилитация пациентов с повреждениями периферических нервов является одной из наиболее актуальных проблем современной медицины в связи с высокой инвалидизацией данного контингента больных [1].

Хирургическое лечение травм периферических нервов представляет собой обязательный и неотъемлемый компонент структурно-функционального восстановления нервно-мышечного аппарата, критически важный для обеспечения направленной регенерации нервных волокон. Вместе с тем даже безупречно выполненная нейрорафия не всегда обеспечивает полное восстановление проводимости поврежденных нервных стволов. Среди факторов, препятствующих эффективной реиннервации, особо следует отметить медленное прорастание нервных волокон через зону шва из-за непродолжительного периода активного течения регенеративных процессов с формированием дистрофических изменений в денервированных мышечных волокнах [1]. Кроме того, травма периферического нерва обусловливает нарушение вегетативной иннервации и развитие денервационной гиперчувствительности, сопровождающиеся спазмом сосудов микроциркуляторного сосудистого русла [2, 3]. Система микроциркуляции находится в тесном физиологическом и патогенетическом сопряжении с параметрами тканевого гомеостаза как в условиях нормы, так и при различных пато- и саногенетических процессах [3, 4]. В связи c этим нарушение функции микроциркуляторного русла, обусловленное денервационной гиперчувствительностью, оказывает выраженное негативное влияние на протекание репаративных процессов [3, 4]. Следует также отметить, что выполнение нейрорафии не всегда возможно непосредственно после травмы, и в этих случаях производят отсроченное наложение швов на поврежденный периферический нерв, что необходимо учитывать при моделировании условий регенерации нервных волокон в эксперименте [1].

Для решения комплекса проблем, возникающих при регенерации периферических нервов, весьма перспективными представляются различные виды стимуляции. В частности, было показано положительное влияние электростимуляционного воздействия на регенерацию нервных волокон как в условиях эксперимента, так и в клинике [1]. В настоящее время активно ведется поиск различных биологических стимуляторов регенерации нервных волокон, факторов роста, стволовых клеток и др. [1]. Кроме того, источником веществ, стимулирующих регенерацию, могут выступать и собственные ткани организма. Так, кратковременная ишемия и реперфузия в тканях вызывает образование биологически активных веществ, которые при попадании в кровоток оказывают дистантное протекторное действие на удаленные органы и могут улучшать регенерацию [5]. Стимулирующее влияние на метаболические и репаративные процессы продемонстрировано при трансплантации аллотканей [6, 7]. Однако при использовании аллот-каней возникает риск развития инфекционных и иммунных осложнений, что обусловливает преимущества использования для биостимуляции аутотканей [8, 9]. Следует отметить, что в доступной литературе крайне мало сведений о применении аутотрансплан-

тации тканей для стимуляции регенерации нервов и возможностей сочетания подобных способов лечения с физиотерапией, в частности с воздействием электрических импульсов.

Цель: изучение влияния комплексной стимуляции, включающей аутотрансплантацию полнослойного кожного лоскута и прямую электростимуляцию седалищного нерва, на микроциркуляторные, электрофизиологические и морфологические изменения после отсроченной нейрорафии у крыс.

Материал и методы. Исследования выполнены на 50 белых беспородных крысах-самцах массой 200–250 г, разделенных на три группы: 1) контрольная группа включала 15 интактных белых крыс; 2) группа сравнения содержала 20 крыс с полным поперечным пересечением седалищного нерва и его нейрорафией на 21 сутки после пересечения (отсроченная нейрорафия); 3) опытная группа состояла из 15 животных, которым одновременно с наложением отсроченного шва устанавливали электроды в зону нейрорафии для последующего проведения курса прямой электростимуляции (ПЭС) и выполняли аутотрансплантацию полнослойного кожного лоскута (АТПКЛ) в межлопаточную область.

При проведении экспериментов соблюдали этические принципы в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975 г. и ее пересмотром в 1983 г., при работе с экспериментальными животными руководствовались требованиями приказа Министерства здравоохранения РФ от 23 августа 2010 г. №708н «Об утверждении Правил лабораторной практики». Всех животных за 5 минут до проведения манипуляций наркотизировали введением внутримышечно комбинации золетила (Virbac Sante Animale, Франция) в дозе 0,1 мл/кг и ксилазина (Interchemie, Нидерланды) в дозе 1 мг/кг.

Пересечение и нейрорафию седалищного нерва производили на уровне средней трети бедра. Электроды подводили к проксимальному и дистальному отделам сшитого нерва, так что расстояние между ними составляло 20 мм. Наложение эпиневраль-ных швов при нейрорафии и фиксацию электродов к эпиневрию осуществляли с применением микрохирургической техники, атравматических игл и шовного материала 8/0 USP. Электростимуляцию проводили в период с 3-х по 21-е сутки после выполненной нейрорафии при помощи аппарата «Миоволна» (ООО «Трима», Россия) с амплитудой стимулирующего тока 0,5–2,0 мА, частотой 25–30 Гц, длительностью 0,1 мс биполярными электрическими импульсами прямоугольной формы в течение 20 минут 3 раза в день.

АТПКЛ выполняли в межлопаточной области на депилированном участке кожи в асептических условиях. Предварительно иссекали полнослойный кожный лоскут размером 0,1% от площади поверхности тела, затем лоскут помещали в сформированный в ране подкожный карман, для фиксации лоскута рану ушивали.

Микроциркуляцию в оперированной конечности исследовали методом лазерной допплеровской фло-уметрии (ЛДФ) с помощью анализатора «ЛАКК-ОП» (производство НПП «Лазма», Россия) и программы LDF 3.0.2.395. Регистрацию ЛДФ-грамм выполняли у сравнительной и опытной групп на 21-е сутки после отсроченной нейрорафии, располагая световодный зонд на коже тыльной поверхности стопы. В качестве контроля использовали ЛДФ-граммы интактных животных. При исследовании микроциркуляции

Таблица 1

Изменения микроциркуляции в тканях оперированной конечности под влиянием комплексной стимуляции после отсроченной нейрорафии седалищного нерва

Группа	М, перф. ед.	Нормированная амплитуда колебаний, отн. ед.
		эндотелиальных	нейрогенных	миогенных
Контроль (n=15)	11,6 (10,1;13,3)	13,01 (10,33;17,93)	11,3 (10,52;12,62)	6,55 (5,00;7,88)
Отсроченная нейрорафия	7,5 (6,4;8,3)	17.99 (11,08;21,58)	8,61 (6,33;9,39)	6,31 (4,41;7,30)
(n=10)	p1=0,001175	p1=0,174143	p1=0,000646	p1=0,304800
Отсроченная нейрорафия и	11,7 (8,8;15,2)	17,41 (16,09;20,46)	12,74 (9,96;15,08)	5,23 (3,69;6,52)
комплексная стимуляция	p =0,864395;	p =0,006767;	p =0,317167;	p =0,112777;
(n=10)	р1 =0,004578	р1=0,817483	р1 =0,001099	р1=0,575157

П р и м еч а н и е : в каждом случае приведены медиана, верхний и нижний квартили; p1, p2 — по сравнению с контролем и группой животных, которым не выполнялась стимуляция после отсроченной нейрорафии.

определяли показатель перфузии в перфузионных единицах и с помощью вейвлет-анализа рассчитывали нормированные амплитуды эндотелиальных, нейрогенных и миогенных колебаний, позволяющих оценить состояние соответствующих активных механизмов модуляции микрокровотока.

Для оценки динамики проводимости нервных волокон через зону нейрорафии седалищного нерва, а также активности процессов реиннервации в мышцах оперированной конечности на 21-е сутки эксперимента проводили электронейромиографию (ЭНМГ) с помощью электромиографа Keypoint (Alpain Biomed ApS, Дания) с набором стандартных стимулирующих и регистрирующих электродов. Для выделения у животных вызванных потенциалов нерва (ВП) регистрирующий электрод располагали на седалищном нерве выше и ниже места повреждения. Для регистрации вызванного мышечного ответа (М-ответа) игольчатый электрод располагали в икроножной мышце. Нерв раздражали прямоугольными импульсами длительностью 0,1 мс и частотой 1 Гц. При ЭНМГ регистрировали латентный период (ЛП) и амплитуду ВП.

Выведение животных из эксперимента осуществляли путем передозировки препаратов для наркоза. Для определения степени тяжести и течения регенеративно-дегенеративных процессов в оперированном нерве готовили гистологические препараты. Участок нерва длиной от 15 до 20 мм, включавший зону нейрорафии с маркировкой проксимального и дистального отрезков, фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина (ООО «Биовитрум», Россия), обезвоживали в спиртах восходящей плотности, заливали в парафин. Срезы проксимальных (выше шва) и дистальных (ниже шва) отделов толщиной 5–7 мкм окрашивали гематоксилином Майера и эозином (ООО «Биовитрум», Россия). Для покрытия срезов применяли монтирующую среду Bio-Mount (BioOptica, Италия).

Препараты исследовали при помощи микроскопа AxioImager Z2 (Carl Zeiss, Германия). На серии окрашенных поперечных срезов проксимального и дистального участков сшитого седалищного нерва животных определяли среднее число неизмененных, регенерирующих и дистрофически измененных нервных волокон в поле зрения при увеличении объектива 100х и окуляра 10х (Ув. х 100).

Статистическую обработку полученных данных осуществляли при помощи пакета программ Statistica 10.0. Проверяли гипотезы о виде распределений вариационных рядов (критерий Шапиро — Уилкса). Большинство наших данных не соответствовали закону нормального распределения, поэтому для сравнения значений использовался U-критерий Манна — Уитни, на основании которого рассчитывали Z-критерий и показатель достоверности различия р. Различия считали значимыми при р<0,05.

Результаты.

• 1.    Изменения микроциркуляции в оперированной конечности под влиянием комплексной стимуляции после отсроченной нейрорафии седалищного нерва у крыс. В результате проведенных исследований установлено, что на 21-е сутки после отсроченной нейрорафии (42-е сутки после перерезки седалищного нерва) снижение перфузионного показателя кожи тыльной поверхности стопы у животных достигало в среднем 35% (табл. 1). Снижение перфузионного показателя сопровождалось повышением нейрогенного тонуса микрососудов, что проявлялось уменьшением нормированной амплитуды нейрогенных колебаний. Величины нормированных амплитуд эндотелиальных и миогенных колебаний на 21-е сутки после отсроченной нейрорафии не имели статистически значимых отличий от уровня контроля, однако отмечалась тенденция к увеличению среднего значения нормированных амплитуд эндотелиальных колебаний (см. табл. 1).

• 2.    Изменения электрофизиологических параметров под влиянием комплексной стимуляции после отсроченной нейрорафии седалищного нерва у крыс. С помощью ЭНМГ установлено, что на 21-е сутки после отсроченной нейрорафии у животных группы сравнения регистрируется низкоамплитудный ВП нерва ниже зоны наложения швов, что свидетельствует о частичном восстановлении проводимости через область нейрорафии. В то же время амплитуда вызванного потенциала нерва у крыс группы сравнения составляет только 3% от его величины у интактных животных, а латентный период превышает таковой в контрольной группе в 8 раз (табл. 2), отражая низкую скорость проведения возбуждения по поврежденному нерву. На 21-е сутки после отсроченной нейрорафии получить М-ответ икроножной мышцы у животных группы сравнения не удалось (см. табл. 2), что свидетельствовало об отсутствии процессов реиннервации мышечных волокон.

• 3.    Морфологические изменения оперированного нерва под влиянием комплексной стимуляции после отсроченной нейрорафии седалищного нерва у крыс. Для верификации нарушений, обнаруженных в ходе функциональных исследований, проведен анализ морфологических изменений в проксимальном и дистальном отделах оперированного нерва на 21-е сутки после отсроченной нейрорафии. В проксимальном отделе оперированного нерва у животных группы сравнения обнаруживали в среднем 38 (30; 45) нервных волокон в поле зрения при увеличении 1000, из которых более половины имели дистрофические изменения. В среднем только 16% нервных волокон в проксимальном отделе имели нормальную гистологическую структуру (табл. 3).

У животных, подвергавшихся комплексной стимуляции, включающей АТПКЛ и ПЭС, на 21-е сутки после отсроченной нейрорафии перфузионный показатель находился на уровне контрольных значений (табл. 1). При этом перфузионный показатель был статистически значимо выше, чем у животных группы сравнения. У животных при выполнении им комплексной стимуляции происходила выраженная перестройка активной модуляции микрокровотока в конечности. На 21-е сутки после отсроченной нейрорафии амплитуды эндотелиальных колебаний статистически значимо превышали контрольный уровень, однако вариабельность эндотелиальных колебаний перекрывала квартиль-диапазон соответствующего показателя группы сравнения. Нормированные амплитуды нейрогенных колебаний кровотока у животных опытной группы были статистически значимо выше, чем у крыс группы сравнения, и находились в пределах вариабельности значений контроля (см. табл. 1). Нормированная амплитуда миогенных колебаний при этом не имела статистически значимых отличий как от контрольного уровня, так и от группы сравнения.

Таким образом, комплексная стимуляция, включающая АТПКЛ и ПЭС, оказывает выраженное нормализующее влияние на микроциркуляцию в тканях оперированной конечности после отсроченной нейрорафии седалищного нерва у крыс. Восстановле- ние адекватного уровня перфузии оперированной конечности при комплексной стимуляции сопровождается резкой интенсификацией активной модуляции кровотока прежде всего за счет нейрогенных и эндотелиальных механизмов, что свидетельствует об эффективной редукции явлений денервационной гиперчувствительности сосудов микроциркуляторно-го русла.

При ЭНМГ-тестировании седалищного нерва на 21-е сутки после отсроченной нейрорафии у животных, подвергнутых комплексной стимуляции, также регистрировали низкоамплитудные невральные потенциалы ниже зоны наложения швов. При этом амплитуда ВП нерва опытной группы значимо превышала аналогичный показатель группы сравнения, достигая в среднем 13% величины контрольных значений (см. табл. 2). У животных опытной группы также отмечали сокращение ЛП ВП седалищного нерва в среднем в 2 раза относительно группы сравнения, что свидетельствует о выраженном увеличении проводимости через зону нейрорафии под влиянием комплексной стимуляции, включающей АТПКЛ и ПЭС.

Важным отличием опытной группы от группы сравнения являлось наличие низкоамплитудного мышечного ответа, регистрируемого с икроножной мышцы при стимуляции нерва выше места пересечения (см. табл. 2). Появление М-ответа отражает начало процесса реиннервации мышечных волокон у животных опытной группы и переход процесса регенерации в импульсную стадию, чего не отмечалось у животных группы сравнения.

Таким образом, электрофизиологические показатели животных, которым выполняли АТПКЛ в сочетании с ПЭС после отсроченной нейрорафии, свидетельствуют о выраженном положительном влиянии комплексной стимуляции на функциональное состояние оперированного нерва. Увеличение скорости проведения возбуждения и появление признаков реиннервации мышц у животных опытной группы отражают стимулирующее действие комплекса АТПКЛ и ПЭС на регенерацию нервных волокон после отсроченной нейрорафии седалищного нерва у крыс.

В дистальном отделе оперированного седалищного нерва среднее количество нервных волокон статистически значимо снижалось и составило 29 (23; 33) в поле зрения при увеличении 1000 (см. табл. 3). Так же как и в проксимальном сегменте, преобладали дистрофически измененные волокна, но в отличие от проксимального отдела полностью отсутствовали неизмененные нервные волокна (см. табл. 3). Наличие регенерирующих нервных волокон в дистальном сегменте подтверждает результаты функционального исследования седалищного нерва. Характер морфологических изменений свидетельствует о выраженных дегенеративных процессах, развивающихся в оперированном нерве как в проксимальном, так и в дистальном его отделах. При этом более интенсивно данные процессы протекают в дистальном отделе.

При исследовании гистологических препаратов опытной группы установлено, что в проксимальном отделе седалищного нерва животных, подвергнутых комплексной стимуляции, на 21-е сутки после отсроченной нейрорафии среднее количество нервных волокон в 2 раза превысило аналогичный показатель в группе сравнения и составило 78 (74; 92) в поле зрения (см. табл. 3). При этом количество регенерирующих нервных волокон также было вдвое больше, чем в группе сравнения. Кроме того, значительно возрас-

Таблица 2

Изменения электрофизиологических параметров под влиянием комплексной стимуляции после отсроченной нейрорафии седалищного нерва

Группа	ЛП нерва (мс)	Амплитуда ВП нерва (мкв)	ЛП М-ответа (мс)	Амплитуда М-ответа (мкв)
Контроль (n=12)	1,8 (1,45; 2,7)	222,5 (199; 297)	3,5 (3,2; 4,85)	19608 (14163; 21372)
Отсроченная нейрорафия	14,8 (12,8;16,2)	7,6 (4; 14)
(n=20)	p =0,000003	p =0,000003	–	–
	p12=0,000833	p12=0,006665
Отсроченная нейрорафия и	7 (6;10)	29 (19,3;43,4)	14,1 (13;14,8)	94,4 (76;102)
комплексная стимуляция	p =0,000453;	p =0,000453;	p1=0,001874	p1=0,000453
(n=10)	p1 =0,000107	p1 =0,000462

Примечание: в каждом случае приведены медиана, верхний и нижний квартили; p1, p2 — по сравнению с контролем и группой животных, которым не выполнялась стимуляция после отсроченной нейрорафии.

Таблица 3

Изменения морфологических параметров под влиянием комплексной стимуляции после отсроченной нейрорафии седалищного нерва

Группа	Сегмент нерва	Количество нервных волокон в поле зрения (Ув. 1000)
		неизмененных	дистрофи-чески измененных	регенери-рующих	Всего
Отсроченная нейрорафия (n=15)	Проксимальный Дистальный	6 (3; 19) 0 (0; 0) p1=0,000001	18 (13; 24) 15 (8; 21) p1=0,433082	7 (3; 11) 10 (5; 15) p1=0,427208	38 (30; 45) 29 (23; 33) p1=0,001346
Отсроченная нейрорафия и комплексная стимуляция (n=15)	Проксимальный Дистальный	62 (52; 69) p2=0,000001 0 (0; 0) p =0,000001; p1 =0,587594	5 (4; 8) p2=0,0000011 4 (2; 10) p =0,394560; p1 =0,000677	13 (8; 18) p2=0,014130 27 (18; 40) p =0,000162; p1 =0,000002	78 (74; 92) p2=0,000001 35 (33; 50) p =0,000004; p1 =0,001800

П р и м еч а н и е : в каждом случае приведены медиана, верхний и нижний квартили; p1 — по сравнению с проксимальным отделом нерва, р2 — по сравнению с аналогичным сегментом нерва группы животных, которым не выполнялась стимуляция после отсроченной нейрорафии.

тала доля неизмененных нервных волокон, достигая 79% (табл. 3).

В дистальном отделе оперированного нерва животных опытной группы среднее количество нервных волокон относительно проксимального отдела значимо снижалось и составило 35 (33; 50) в поле зрения. При этом общее количество нервных волокон в дистальном сегменте оперированного нерва статистически значимо превышало значения группы сравнения (см. табл. 3). Число дистрофически измененных нервных волокон в проксимальном сегменте оперированного нерва у животных опытной группы было статистически значимо ниже, чем у крыс группы сравнения. Регенерирующие нервные волокна составили 77% от общего количества нервных волокон в дистальном сегменте оперированного нерва у животных, подвергнутых комплексной стимуляции после отсроченной нейрорафии.

Таким образом, комплексная стимуляция, включающая АТПКЛ и ПЭС, снижает выраженность дегенеративных изменений в седалищном нерве после отсроченной нейрорафии, а также стимулирует прорастание нервных волокон в дистальный сегмент оперированного нервного ствола, что согласуется с результатами электронейромиографии, свидетельствующими об ускорении репаративных процессов у животных опытной группы.

Обсуждение. Интенсификация прорастания нервных волокон в дистальный сегмент оперированного нервного ствола, увеличение скорости проведения возбуждения через зону наложения шва и ускорение реиннервации, обнаруженные у животных опытной группы, свидетельствуют о регенеративном эффекте комплексной стимуляции, включающей АТПКЛ и ПЭС, после отсроченной нейрорафии седалищного нерва у крыс. Восстановление адекватного уровня перфузии тканей оперированной конечности у животных опытной группы, в отличие от группы сравнения, позволяют выделить стимулирующее действие комплекса АТПКЛ и ПЭС на микроциркуляцию после отсроченной нейрорафии. Нормализующее влияние комплексной стимуляции на микроциркуляцию в оперированной конечности после отсроченной нейрорафии может являться одним из ключевых механизмов, обеспечивающих восстановление структуры и функции нервных волокон, так как уменьшение выраженности денервационной гиперчувствительности сосудов обеспечивает оптимальную трофику при репаративных процессах [4]. Восстановление адекватной перфузии конечности после отсроченной нейрорафии седалищного нерва может быть реализовано за счет дистантного стимулирующего действия АТПКЛ на микроциркуляцию, которое выявлено в условиях сохраненной и нарушенной иннервации и описано в предшествующих работах [8, 9]. Вместе с тем данные литературы свидетельствуют о стимулирующем влиянии воздействия электрических импульсов на микрокровоток [1, 10]. В связи с этим, вероятно, взаимопотенцирование активирующего действия АТПКЛ и ПЭС на микроциркулятор-ное русло объясняет обнаруженное в данной работе эффективное восстановление перфузии тканей оперированной конечности под влиянием комплексной стимуляции после отсроченной нейрорафии седалищного нерва.

Увеличение темпов регенерации нервных волокон у животных опытной группы может быть объяснено не только восстановлением трофики, но и прямым влиянием электрической стимуляции на нервную ткань. Согласно данным литературы, электростимуляция приводит к увеличению внутриклеточного уровня цАМФ, повышению экспрессии нейротрофических факторов и экспрессии генов, регулирующих регенерацию, что способствует усилению аксонального транспорта тубулина, актина и белка GAP-43 [1]. Кроме того, недавно проведенные исследования свидетельствуют о стимуляции и пролонгации продукции нейротрофина-3 при АТПКЛ на фоне нейрорафии седалищного нерва у крыс, выполненной непосредственно после его перерезки [10], что, вероятно, также вносит вклад в ускорение темпов регенерации у животных опытной группы. Вместе с тем следует отметить, что реиннервация сосудов, в свою очередь, обеспечивает поддержание адекватной перфузии тканей конечности, и обнаруженное увеличение амплитуды нейрогенных колебаний может отражать восстановление функции вегетативных волокон, обеспечивающих реализацию данного механизма.

Таким образом, совокупность собственных исследований и данных литературы свидетельствуют, что комплекс АТПКЛ и ПЭС, синергично действуя на взаимосвязанные саногенетические процессы восстановления кровотока и прорастания аксонов нейронов с реиннервацией органов-мишеней (скелетных мышц и гладких мышц сосудов), обеспечивают выраженный регенеративный эффект после отсроченной нейрорафии седалищного нерва.

Заключение. Представленные результаты проведенных экспериментов позволяют заключить, что комплексное воздействие, включающее АТПКЛ и ПЭС, обеспечивает стимулирующее действие на механизмы модуляции микрокровотока и восстановление адекватного уровня перфузии тканей оперированной конечности, интенсификацию прорастания нервных волокон в дистальный сегмент поврежденного нервного ствола, облегчая проведение возбуждения через зону наложения шва и ускоряя реиннервацию при отсроченной нейрорафии седалищного нерва у белых крыс. Полученные данные экспериментально обосновывают целесообразность клинической апробации комплексной стимуляции, включающей АТПКЛ и ПЭС у пациентов с травмами периферических нервов.