Комплексное воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения и пептидного ингибитора калиевых каналов на выживаемость клеток меланомы

Введение. Меланома характеризуется агрессивным течением и наличием большого количества метастазов уже на момент установления диагноза. В большинстве случаев для лечения рака кожи различных локализаций и на любых стадиях используют фотодинамическую терапию (ФДТ). ФДТ вызывает накопление фотосенсибилизаторов в злокачественной опухоли. Однако их значимое количество также отмечается в коже, слизистых оболочках и органах с высоким уровнем метаболической активности [1]. В связи с этим появляется необходимость в разработке новых методов, которые позволят избежать систем- ного действия фотосенсибилизаторов, ведущего к тяжелым побочным эффектам.

Недостатки методов терапии меланомы возможно устранить, используя комплексное воздействие лазерного излучения и местного применения ингибиторов клеточных процессов. Лазерное излучение оказывает влияние на процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях, индукции внутриклеточного окислительного стресса и увеличения синтеза АТФ. Установлено, что лазерное облучение с длиной волны 1260–1270 нм увеличивает концентрацию активных форм кислорода (АФК), которые играют ключевую роль в запуске апоптоза опухолевых клеток [2, 3]. В свою очередь в процессе клеточной гибели существенную роль играют ионные (Ca2+, Na+, Cl-, К+) каналы, регулирующие пролиферацию клеток. Наиболее значимыми для развития меланомы являются калиевые каналы, которые принимают активное участие в ангиогенезе и метастазировании опухоли [4]. Поэтому их ингибирование коррелирует с дефицитом питательных веществ и кислорода, поставляемых к опухолевым клеткам, что приводит к деградации последних. Кроме того, калиевые каналы контролируют гомеостатические параметры, к которым относится внутриклеточная концентрация ионов, pH в цитозоле клеток и их объем [5]. Для подавления течения физиологических и физико-химических процессов с участием калиевых каналов клеток меланомы появилась возможность использовать таргетные лекарственные препараты с последовательностью природных пептидов – токсинов членистоногих. В настоящее время именно они являются перспективным и многообещающим средством в терапии многих заболеваний, в число которых входят и онкологические [6].

Селективное ингибирование калиевых каналов при патологических процессах можно расценить как важное дополнение к комплексной терапии поверхностных злокачественных новообразований. Совместное использование токсина и облучения лазером позволит потенцировать их действие и избежать основных недостатков, сопряженных с применением ФДТ. Кроме того, такой подход сохраняет все преимущества, связанные с местным применением и точным воздействием на злокачественную опухоль.

Цель исследования. Изучить воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) и биотоксина Kappa-theraphotoxin-Gr1b (Kappa-TRTX-Gr1b) на выживаемость опухолевых клеток меланомы A875.

Материалы и методы. В экспериментах использовали клеточную линию меланомы человека A875 (RRID:CVCL_4733). Культивирование клеток проходило в СO2-инкубаторе МСО-18AIC СО2 (Helicon, Япония), в котором поддерживалась температура 37 °С, концентрация СО2 5 % и влажность 98 %. Для клеток использовали среду RPMI-1640 с L-глутами- ном («ПанЭко», Россия) с 10 % эмбриональной бычьей сывороткой (Biosera, Франция) и 5 мкг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия). За сутки до проведения эксперимента клетки сеяли в 8-луночные слайд-флаконы (SPL Lifesciences, Южная Корея) в концентрации 4·104 на ячейку. Облучение клеток меланомы производили в логарифмической фазе роста в камере настольного инкубатора UNO H501-T (Okolab, Италия). Клетки подвергали воздействию лазерного излучения (лазер Yenista optics osics) с длиной волны 1265 нм в течение 30 мин. Мощность дозы составляла 4,2 мВт при фокусном расстоянии 1,5 см. Высота водяного столба над клетками составляла 0,5 мм.

Наличие апоптоза и некроза определяли с использованием флуоресцентного красителя YO-PRO (Thermo Fisher Scientific, США). Результат окрашивания оценивали с помощью инвертированного микроскопа Nikon Ti-S (Nikon, Япония) и ПК с программой Nikon NIS-elements 4.0. Обработку полученных изображений осуществляли в компьютерной программе ImageJ (Национальный институт здоровья, США). Скорректированную интегральную флуоресценцию клетки (СИФК) вычисляли по формуле СИФК (CTFC) = интегральная плотность – (площадь выделенной клетки × фоновое значение флуоресценции) [7].

Математическое моделирование пептида осуществляли с использованием электронного ресурса PatchDock [8]. Аминокислотные последовательности биотоксина отбирали с помощью открытой базы данных UniProt [9]. Синтез пептида выполняли на автоматическом пептидном синтезаторе ResPep SL (Intavis, Германия) на основе твердофазного синтеза с использованием защитной Fmoc-группы на смоле TentaGel в соответствии со стандартным протоколом производителя. Очистку и анализ последовательностей производили методом ВЖЭХ на хроматографе NGC Quest™ 10 Chromatography System (Bio-Rad, США). Масс-спектрометрический анализ осуществляли на программно-аппаратном комплексе MALDI-TOF MS серии FLEX (Bruker, США).

Для оценки цитотоксического ответа клеток меланомы А875 использовали E-планшеты системы xCELLigence. Биотоксин Kap-pa-theraphotoxin-Gr1b и менадион, который использовали в качестве положительного контроля [10], добавляли после 25 ч с момента пассажа клеток. Нормализованный клеточный индекс вычисляли по формуле NCIti= =CIti/CInml_time, где CIti – клеточный индекс в реальном времени, CInml_time – клеточный индекс в момент нормализации времени. Нормализованный клеточный индекс во время точки нормализации равен единице [11].

Результаты. Чистота раствора синтезированного пептида Kappa-TRTX-Gr1b показана на хроматограмме (рис. 1). Наличие в растворе нежелательных примесей указывает на необходимость его очистки. Как правило, она проводится, если хроматографический анализ показал, что чистота пептида составила менее 95 %.

На рис. 1 показано, что чистота пептида Kappa-TRTX-Gr1b равна 95,7 %. Очистка исследуемого пептида не проводилась. Кроме того, анализ пиков хроматограммы биотоксина Kappa-TRTX-Gr1b (табл. 1), в котором учитывались данные их параметров (площадь, высота, процентное соотношение площадей), также говорит об отсутствии необходимости очистки.

Рис. 1. Хроматограмма синтезированного токсина Kappa-TRTX-Gr1b

Fig. 1. Synthesized toxin Kappa-TRTX-Gr1b chromatogram

Таблица 1

Table 1

Параметры пиков токсина Kappa-TRTX-Gr1b

Kappa-TRTX-Gr1b toxin peak parameters

№	Время уд. (мин) Retention time (min.)	Момент начала (мин) Beginning (min.)	Момент завершения (мин) Ending (min.)	Площадь (мОП с) Area (mAU sec.)	Высота (mОП) Height (mAU sec.)	Площадь (%) Area (%)
11	8,538	8,183	8,957	8,643	0,490	4,3
22	10,887	9800	11,727	190,512	13,468	95,7
	Суммарное значение Total value			199,155	13,958	100

Масс-спектрограмма синтезированного токсина Kappa-TRTX-Gr1b представлена на рис. 2. Показано, что молекулярная масса ис-след уемого пептида меньше теоретической массы на 6 DA.

Такая разница в массе указывает на правильную конформацию пептида, которая заключается в образовании трех дисульфидных мостиков. Таким образом, данные, полученные при анализе синтезированного токсина Kappa-TRTX-Gr1b, подтверждают его высокий уровень стабильности и чистоты.

Цитотоксический ответ клеток A875 после воздействия на них биотоксина Kappa-TRTX-Gr1b и менадиона представлен на рис. 3.

Рис. 2. Масс-спектрограмма биотоксина Kappa-theraphotoxin-Gr1b (м/з – отношение массы к заряду; интенсивность – интенсивность сигнала ионов)

Fig. 2. Mass spectrogram of Kappa-theraphotoxin-Gr1b biotoxin (m/ch – mass-to-charge ratio; intensity – ion signal intensity)

Время ( ч.) Time ( h.)

Рис. 3. Цитотоксический ответ клеток меланомы А875 на воздействие токсина Kappa-TRTX-Gr1b и менадиона (К – контрольная группа; Т – токсин Kappa-TRTX-Gr1b; Т+М – комплекс токсина Kappa-TRTX-Gr1b и менадиона; М – менадион, * – достоверное отличие между экспериментом и контролем (p<0,05))

Fig. 3. Cytotoxic response of A875 melanoma cells to Kappa-TRTX-Gr1b toxin and menadione

(C – control group; T – Kappa-TRTX-Gr1b toxin; T+M – complex of Kappa-TRTX-Gr1b toxin and menadione; M – menadione, * – the difference is significant between experiment and control groups (p<0.05))

В ходе эксперимента отмечено, что комплексное воздействие токсина Kappa-TRTX-Gr1b и менадиона на клетки А875 провоцирует рост, а через 3 ч инкубации спад нормализованного клеточного индекса. Полученные данные говорят о том, что данный комплекс вызывает гибель клеток путем некроза, так как рост нормализованного клеточного индекса (НКИ) свидетельствует об увеличении объема клеток. Инкубация с одним менадионом уменьшала объем клеток и вызывала снижение НКИ. Следовательно, клеточная гибель была реализована путем апоптоза. Значимых различий между клетками контрольной группы и клетками, к которым добавлен токсин Kappa-TRTX-Gr1b, не обнаружено. Таким образом, воздействие токсина Kappa-TRTX-Gr1b на опухолевые клетки, которое запускает процесс клеточной гибели, можно усилить, ис- пользуя дополнительные стимулы. В качестве таких стимулов для опухолевых клеток меланомы целесообразнее применять лазерное излучение.

Оценка апоптоза в культуре клеток меланомы человека A875 после воздействия на них токсина Kappa-TRTX-Gr1b и лазерного излучения показана на рис. 4.

При применении лазерного излучения с длиной волны 1265 нм наибольшее количество клеток с признаками апоптоза отмечено в группах Т/Л, Л и Т (рис. 4). В группе, в которой клетки сначала облучены лазером, а затем проинкубированы с токсином Kappa-TRTX-Gr1b, отмечен низкий уровень апоптоза.

Оценка некроза в культуре клеток меланомы человека A875 после воздействия на них токсина Kappa-TRTX-Gr1b и лазерного излучения показана на рис. 5.

Рис. 4. Оценка апоптоза в культуре клеток меланомы человека A875 после воздействия токсина Kappa-TRTX-Gr1b и лазерного излучения с длиной волны 1265 нм

(Л (лазер) – клетки, которые облучены лазером, Т (токсин) – клетки, которые подвергались воздействию токсина Kappa-TRTX-Gr1b, Л/Т (лазер/токсин) – клетки, которые облучены лазером, а затем инкубировались с токсином Kappa-TRTX-Gr1b, Т/Л (токсин/лазер) – клетки, которые подвергались воздействию токсина Kappa-TRTX-Gr1b, а затем облучению лазером; СИФК – отношение значения скорректированной интегральной флуоресценции эксперимента к контролю, * – достоверное отличие между экспериментом и контролем (p<0,05). На рис. 5 обозначения те же)

Fig. 4. Evaluation of apoptosis in A875 human melanoma cell culture after exposure to Kappa-TRTX-Gr1b toxin and 1265 nm laser radiation

(L (laser) – laser-irradiated cells, T (toxin) – Kappa-TRTX-Gr1b toxin-exposed cells,

L/T (laser / toxin) – cells initially irradiated with laser and then incubated with Kappa-toxin TRTX-Gr1b, T/L (toxin/laser) – cells exposed to Kappa-TRTX-Gr1b toxin and then laser irradiation;

CIFС – ratio of corrected integral fluorescence (in the experiment) to the control, * – the difference is significant between experiment and the control groups (p<0.05). In Fig. 5 designations are the same)

Рис. 5. Оценка некроза в культуре клеток меланомы человека A875

после воздействия токсина Kappa-TRTX-Gr1b и лазерного излучения с длиной волны 1265 нм

Fig. 5. Evaluation of necrosis in A875 human melanoma cell culture after Kappa-TRTX-Gr1b toxin exposure and laser radiation (wavelength 1265 nm)

Максимальное количество клеток с признаками некроза выявлено в группе, в которой клетки подвергались воздействию токсина Kappa-TRTX-Gr1b, а затем лазерного излучения (рис. 5). Незначительная разница в количестве некротических клеток имела место в группах, где клетки подвергались только облучению или действию токсина Kappa-TRTX-Gr1b. Самый низкий уровень некроза отмечен в группе, в которой клетки после облучения инкубировали с токсином Kappa-TRTX-Gr1b. Таким образом, проведенные эксперименты показали, что на жизнеспособность клеток меланомы A875 значительный эффект оказывает комбинация пептида Kappa-TRTX-Gr1b с последующим воздействием лазерного излучения.

Обсуждение. Увеличение числа апопто-тических и некротических клеток отмечено во всех экспериментальных группах. Однако их максимальное количество было зафиксировано в группе, где использовали комбинацию токсина Kappa-TRTX-Gr1b с последующим облучением лазером опухолевых клеток А875. Данные, полученные в работе L. Leanza et al., показали, что ингибирование калиевых каналов митохондрий с использованием фармакологических препаратов индуцирует апоптоз в опухолевых клетках, что способствует сокращению объема опухоли меланомы на 90 % [12]. Калиевые каналы называют новой онкологической мишенью, так как их ингибирование вызывает апоптоз [13]. Это связано с гиперполяризацией мембранного потенциала митохондрий, высвобождением цитохрома С и продукцией активных форм кислорода, что приводит к гибели опухолевых клеток [14]. Эти данные подтверждают наше предположение о том, что высокий процент апоптотиче-ских и некротических клеток в группе, которая подвергалась комплексному воздействию, обусловлен ингибированием калиевых каналов внутриклеточных мембран клеток пептидом Kappa-TRTX-Gr1b.

Поскольку цитохром-с-оксидаза является основным клеточным хромофором, который располагается во внутренней мембране митохондрий, то последующее облучение лазером также вызывает каскад реакций, влияющих на функционирование клеток. Возбуждение ци-тохром-с-оксидазы лазерным излучением способствует росту электрохимического протонного градиента, который приводит к усиленному синтезу АТФ [15]. Образование комплекса цитохрома С с оксидом азота подавляет клеточное дыхание за счет вытеснения кислорода в состоянии стресса. Maegawa et al. показали, что облучение лазером меняет кластерную структуру воды, которая является одним из фотоакцепторов клетки [16]. Это приводит к изменениям гидрофобных взаимодействий белков и процессов, в которых они участвуют. Chung et al. продемонстрировали, что молекулярный кислород, который также является фотоакцептором клетки, под воздействием облучения переходит в синглетный кислород ¹О 2 и вносит значительный вклад в биоэффекты [17]. Следственно, воздействие лазерного излучения с длинной волны 1265 нм приводит к изменению мембранного потенциала митохондрий, окислению белков и ДНК, что в конечном итоге провоцирует гибель опухолевых клеток [18, 19].

Заключение. Таким образом, корректно подобранный диапазон волн [20] и аминокислотные последовательности токсина Kappa-TRTX-Gr1b оказывали негативное влияние на жизнеспособность опухолевых клеток меланомы. В рамках работы показано, что использование указанной комбинации оказывало более значимое воздействие, чем раздельное применение этих факторов. Полученные данные могут стать основой для создания нового подхода в терапии, который сохранит все преимущества, связанные с местным применением и точным воздействием на злокачественную опухоль.