Комплексный анализ потенциальных биомаркеров у больных колоректальным раком

Исследования молекулярных механизмов инициирования и развития колоректального рака (КРР) определили важную роль скрининга мутаций в онкогенах и генах-супрессорах, а также эпигенетических событий, включающих изменение статуса метилирования генов репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (mismatch repair – MMR) (de Vogel et al., 2009). В современной литературе описаны два альтернативных неперекрывающихся пути инициации и прогрессии КРР с участием эпигенетических механизмов подавления генов MMR. Один из них связан с мутациями в гене KRAS, возникающими вследствие гиперметилирования и последующей инактивацией гена MGMT.

Другая цепочка молекулярных событий практически исключает мутации гена KRAS и маркирована гиперметилированием промотора MLH1 гена и активирующей мутацией BRAF (de Vogel et al., 2009). Эпигенетические изменения регуляции экспрессии генов, влияющие в итоге на паттерн белковой экспрессии – ранние события в инициации спорадических случаев онкогенеза и его прогрессии.

Цель исследования . Поиск предиктивных маркеров малиг-низации тканей толстого кишечника с помощью протеомных микрочипов в сочетании с определением мутаций в генах KRAS, BRAF и инактивирующим метилированием промотора гена MLH1.

Материалы и методы. В исследование были включены 20 пациентов Юга России, проходившие плановое лечение в ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ (медиана возраста – 57 лет) с гистологически подтвержденной умеренно дифференцированной (G2) аденокарциномой ободочной и сигмовидной кишки. Из них у 11 пациентов была III стадия развития заболевания, у 9 – IV с отдаленными метастазами.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ И ПАТОМОРФОЛОГИЯ

Для протеомного скрининга проводили экстракцию белков, маркировку и гибридизацию на слайде с использованием набора Panorama Antibody Microarray – Cell Signaling Kit (Sigma, США) по инструкции производителя. Слайды сканировали на сканере для микрочипов GenePix 4100A (Molecular Devices, США). Биоинформационный анализ данных по 224-м антителам к соответствующим белкам проводили с использованием программного обеспечения для анализа изображений GenePixTM Pro 6.0. Нормализацию проводили методами смены красителей и по референсным белкам.

Для молекулярно-генетических исследований ДНК экстрагировали из опухолевых и условно здоровых тканей, хранившихся при –1500С. Скрининг мутантного статуса гена KRAS осуществляли при помощи HRM-PCR. Тип мутаций во втором экзоне (G12C, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A и G13D) уточняли в qRT-PCR с помощью набора «Real-Time-PCR-KRAS-7M» («Биолинк», Россия), в 3 и 4 экзонах – прямым секвенированием на AB3500 Genetic Analyzer (LT, USA). Мутацию V600E в гене BRAF идентифицировали с помощью набора «Real-Time-PCR-BRAF V600E» («Биолинк», Россия). Метилирование промотора гена MLH1 оценивали методом пиросеквенирования на PyroMark Q24 набором «PyroMark Q24 CpG MLH1» (Qiagen, Germany).

Результаты. В ходе анализа 224-ти протеомных маркеров в опухолевой и условно здоровой тканях 20-ти пациентов с КРР было обнаружено достоверное изменение экспрессии двух протеомных маркеров: Nerve Growth Factor Receptor (NGFR p75) и Microtubule-Associated Protein Tau (МАРТ). Экспрессия данных белков в опухоли возрастала в 25% случаев по маркеру NGFR p75 и в 30% случаев по маркеру МАРТ.

Подавление экспрессии маркеров в ткани опухоли наблюдалось у 5% пациентов по NGFR p75 и у 10% пациентов по МАРТ без выраженной корреляции со стадией заболевания. В случаях одновременного изменения экспрессии двух белков, их уровень однонаправленно повышался. В случаях понижения экспрессии одного из указанных белковых маркеров уровень другого не отличался от экспрессии в условно здоровой ткани. Исследованная выборка характеризовалась 5 типами мутаций в гене KRAS, обнаруженных у 9 (45%) пациентов. Чаще встречалась мутация c.35G>A (G12D) – 5 случаев (55,6%); остальные мутации (c.34G>T (G12C); c.35G>T (G12V); c.38G>A (G13D) и c.183A>T (Q61H)) – по одному случаю (11,1%). Отметим идентификацию в небольшой выборке пациентов с КРР достаточно редкой активирующей мутацией Q61H (<1%; по данным COSMIC) в 3 экзоне KRAS, которую обнаружили с помощью прямого секвенирования после скрининга в HRM-PCR. Все идентифицированные мутации в гене KRAS сопровождались изменением в опухоли уровня экспрессии белковых маркеров (NGFR и МАРТ).

Мутация BRAF V600E не обнаружена в исследованной выборке, хотя по литературными данными её частота (8–15%) у пациентов со спорадическим КРР не относит BRAF V600E к редким событиям (de Vogel et al.,2009; Deng et al., 2004).

Использование метода пиросеквенирования позволило количественно оценить степень метилирования промоторного участка гена MLH1. Среднее значение метилирования составило 1,4% для условно здоровой ткани и 2,2% для опухоли. В одной из работ по количественному определению уровня метилирования промотора MLH1 указан пограничный предел гиперметилирования этого локуса – не менее 18% (Bettstetter et al., 2004). Поэтому, несмотря на достоверность различий

(p<0.05) между патологическим состоянием и нормой, обнаруженный уровень метилирования явно не достаточен для эффективного подавления экспрессии гена. Различия в метилировании промотора MLH1 у пациентов с разными стадиями заболевания были не достоверны.

Отсутствие мутаций BRAF V600E и гиперметилирования промотора MLH1 в исследованной группе пациентов, в том числе с активирующими мутациями KRAS, соответствует представлениям о различных молекулярных моделях онкогенеза при КРР. С другой стороны в нашем исследовании были обнаружены не описанные ранее ассоциации активирующих мутаций гена KRAS с изменением экспрессии белков NGFR p75 и МАРТ. Оба протеомных маркера в большей степени охарактеризованы в отношении нервной ткани и нейродегенеративных состояний. Тем не менее, была показана связь некоторых видов рака с экспрессией рецептора NGFR p75(Boiko et al., 2010), который в зависимости от эндо- и экзогенных факторов способствует или инициации апоптоза, или выживанию клетки посредством PI3K/AKT и/или NF-kappa B сигнальных путей.

МАРТ – структурный пептид цитоскелета, не участвующий в сигнальной трансдукции клетки. Однако были описаны отклонения в экспрессии этого белка при малигнизации тканей, например, уровень МАРТ предложено использовать как предиктивный маркер для оценки результатов химиотерапии у пациенток с метастазирующим раком груди (Zhou et al., 2015).

Заключение. Выявленные различия в экспрессии белков NGFR p75 и МАРТ, а также метилировании промотора MLH1 в опухоли и условно здоровой ткани пациентов с КРР позволяет рассматривать использование этих показателей в качестве перспективных и независимых маркеров прогрессии колоректального рака.