Компонентный состав запасных белков образцов диких таксонов гороха

Материал и методика исследований

Объектом исследования служили образцы коллекции ВИР вида гороха Р . fulvum ( И 609881, И 609885, 2523, 6070) и подвидов Р . sativum L. - elatius (1851, 2524, 3115, 4014), transcaucasicum (296, 2365, 2376, 3249, 3980), asiaticum (1923, 1974, 1975, 2645, 5322, 1915), abyssinicum (2759), syriacum (2521) - табл . 1. Исследовали запасные белки сортов и линий культивируемого подвида гороха sativum : Стабил ( усатый тип листа , af ), 102b ( усатый тип листа , af), ПАП ( многократно непарноперистый морфотип , aftl ), ВИ 9402 ( акациевидный морфотип , tl ). Проводили изучение электрофоретических спектров запасных белков линии Рас - тип [8].

Экстрагировали и анализировали белки из 50 индивидуальных семян каждого представителя вида и подвида гороха .

Таблица 1 – Образцы дикого гороха коллекции ВИР

Вид , подвид	Образец
Pisum sativum ssp.
transcaucasicum	296, 2365, 2376, 3249
elatius	1851, 2524, 2173, 3115, 3370, 4014
asiaticum	1915, 1923, 1974, 1975, 2645, 5322
syriacum	2521
abyssinicum	2759
Pisum fulvum	2523, 6070

Использован стандартный арбитражный метод ISTA для выделения и электрофоретического разделения белков семян двудольных [9].

Экстракция белков из муки индивидуальных семян проведена в течении 20 часов при температуре 3-4º С с помощью электродного буфера (Tris, глицин ,

SDS), рН =8,3. После центрифугирования 10 мкл экстракта перенесили в ячейки планшеток для смешивания с равным объемом буфера нанесения (SDS, Tris- Н Cl, глицерин , β - меркаптоэтанол , бромфеноловый синий ). Концентрация разделяющего геля – 12,5%, концентрирующего – 5%. Для проведения исследований использовали камеру для вертикального электрофореза белков VE-4 фирмы « Хеликон » и реактивы для SDS-PAGE электрофореза .

Анализ относительной подвижности компонентов образцов гороха проведен с использованием спектра сои сорта Ланцетная . В эксперименте использовали маркеры молекулярного веса фирмы SIGMA. Окраску компонентов спектра оценивали как : 1 – слабую , 2 – интенсивную и 3 – очень интенсивную .

Кластерный анализ проводили с использованием программы TREECON по методу UPMGA [10]. В качестве внешней группы был использован сорт сои Ланцетная . Индексы бутстрепа ( ИБ ) рассчитывали для 1000 реплик .

Результаты и их обсуждение

При анализе семян исследованных образцов из коллекции ВИР обнаружено большое число типов спектров , различные по составу и интенсивности окрашивания компонентов . Во всех типах электрофоретических спектров компоненты распределялись по 76 позициям « соевой » шкалы ( от 5 до 104). Молекулярная масса компонентов варьировала от 17,5 до 97,4 к Da ( рис . 1, рис . 2).

Рисунок 1 – Электрофоретический спектр белков образцов Р . sativum L. подвидов: 1, 2 – elatius (2524); 3, 4 – asiaticum (2645); 5, 6 – abyssinicum (2759); 7, 8 – elatius (3115); 9, 10 – transcaucasicum (3249); 11, 12 – elatius (4014);

13, 14 – asiaticum (5322); 15, 16 - transcaucasicum (2376); 17,

Рисунок 2 – Электрофоретический спектр белков образцов Р . sativum L. подвидов: 1, 2 - transcaucasicum (296); 3, 4 - elatius (1851); 5, 6 - asiaticum (1915); 7, 8 - asiaticum (1923);

9, 10 - asiaticum (1974); 11, 12 - asiaticum (1975); 13, 14 - elatius (2173); 15, 16 - transcaucasicum (2365); 17, 18 - Pisum fulvum (6070)

Образцы из коллекции ВИР И 609881, И 609885, 2523, 6070, 3115, 3980, 296, 1851, 1915, 1923, 1974, 1975, 2173, 2365, 2524, 2645, 2759, 3115, 3249, 4014, 5322, 2376, 2521 имели 26 одинаковых белковых компонентов . Они различались по наличию / отсутствию 26- ти и интенсивности окрашивания 16- ти компонентов ( табл . 2).

Таблица 2 – Полиморфные компоненты запасных белков у образцов диких таксонов гороха

Тип полиморфизма	Полиморфные компоненты
наличие/отсутствие	9 10 12 18 19 20 24 26 29 30 31 35 38 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 68 69 71
интенсивность окрашивания	5 6 7 8 13 14 15 16 21 22 23 27 28 32 33 54

Образцы P. fulvum 2523 и 6070 коллекции ВИР имели 57 одинаковых белковых компонентов и различались по наличию / отсутствию 6- го компонента и интенсивности окрашивания компонента 23. Следует отметить , что образцы 6070 и 2523 характеризовались наличием маркерных компонентов 18, 19.

Образцы Р . sativum ssp. elatius (4014, 3115, 2524, 2173, 1851) имели 52 общих компонента и различались по наличию / отсутствию 13- ти и интенсивности окрашивания 8- го и 48- го компонентов . В спектрах образцов подвидов asiaticum (1975) и abyssinicum (2759) всего идентифицировано 58 компонентов разной интенсивности окрашивания . Образцы подвида asiaticum (1923, 1974, 2645, 5322, 1915) имели 51 одинаковый компонент и различались по наличию / отсутствию 8- го компонента и интенсивности окрашивания компонентов 31, 32, 33. В спектрах образца 2521 подвида syriacum идентифицировано 63 белковых компонента . Образцы transcaucasicum (296, 2365, 2376, 3249, 3980) имели 44 одинаковых компонента и различались по наличию / отсутствию 17- ти и интенсивности окрашивания 5- ти компонентов (6, 7, 8, 21, 46).

В результате обработки данных электрофоретического разделения запасных белков по наличию / отсутствию компонентов была построена дендрограмма ( рис . 3). На дендрограмме выделились два основных кластера . Устойчивость кластеров подтверждена высоким уровнем индекса бутстрепа ( ИБ =99,3%). Кластер культивируемых сортов и линий дополнили образцы вида P. fulvum И 609881, И 609885 и подвидов elatius 3115, transcaucasicum 3980, syriacum 2521. Второй обширный кластер сформировали образцы подвидов elatius , abyssinicum , transcaucasicum , asiaticum и дикого вида P. fulvum 2523 и 6070. Распределение образцов P. fulvum по разным кластерам указывало на гетерогенность вида и возможность древних межвидовых интрогрессий .

0.]

0.1

tramcaucaiicum 296 atiatkuni 5322 auatkum 1974 atiatkum 1923 datiui 4014 aiiatkuni 2645 datiui 2524 tramcaucaiicum 3249 ■ datiui 3115

abxMiniaim 2759 tramcaucaiicum 2365 datiui 2173 atiatkum 1975 cbtiui 1851 a'iatkum 1915 fall um 6070 fab um 2523 tramcaucaiicum 2376 iith am 1096 nth am Pac-niu lath am ПАП lath am BH >402 lath am CiaSni fe hum 619885 fihum 609WI

587 =- datiui3H5

—        tramcaucaikum 39X0

• - imacum 2521

сея .Панастмая

Рисунок 3 – Дендрограмма различий образцов диких таксонов Р . sativum L. по компонентному составу запасных белков

Выводы

• 1.    Исследованы электрофоретические спектры запасных белков диких таксонов гороха . Описан компонентный состав спектров в единицах относительной подвижности реперных компонентов спектра сои , необходимый для идентификации биохимических маркеров интрогрессивных аллелей хозяйственно - ценных признаков у гибридов гороха .

• 2.    В результате обработки данных электрофоретического разделения запасных белков была построена дендрограмма . На дендрограмме с высоким уровнем индекса бутстрепа ( ИБ =99,3%) выделились два кластера . Распределение образцов P. fulvum И 609881, И 609885, а также 2523 и 6070 по разным кластерам указывало на гетерогенность вида и возможность древних межвидовых интрогрессий . Различия между образцами P. fulvum необходимо учитывать при проведении межвидовой гибридизации .