Конопляный белок: получение и функционально-технологические свойства

Население мира в настоящее время (2021 г.) растет примерно 1,09% в год и, по прогнозам, к 2100 году достигнет 11,2 млрд. Нехватка пищевого белка является не только экономической, но и социально-медицинской проблемой современного мира, поскольку наличие или отсутствие сбалансированного по белку рациона не даёт нормально развиваться биологическому организму. Для решения этой проблемы необходим научный подход к исследованию возможных альтернатив высококачественных растительных белков, являющихся альтернативой животным белкам и не уступающим им по биологическим функциям. В результате мирового литературного обзора выявлены недооцененные растительные культуры, на основе которых методом биокатализа можно получить биологически полноценные пищевые белки и активные пептиды. В настоящее время повышенное внимание уделяется ревалоризации побочных продуктов пищевой промышленности, в особенности их альтернатив и возможности использования. Поэтому получение альтернативных пищевых белков на основе вторичного масличного сырья технической конопли будет востребовано в ближайшей перспективе [6].

Давно заброшенной культурой, но при этом обладающей уникальным биостатусом является конопля. Кроме того, семена конопли содержат в своем составе до 21% белка, концентрация которого после холодного отжима масла увеличивается в шроте до 38–39,5%. По этой причине усилился интерес к производству конопли за рубежом.

Из высокобелковой конопляной муки был выделен и идентифицирован, богатый метионином и цистином белок (10 кДа) [7]. В изоляте белка конопли (HPI) эдестин составляет порядка 60% от общего содержания белка конопли [3]. Есть данные [5] о полезности белка глобулина (эдестина и эдестана) из конопляного семени. Сообщается, что физико-химические и функциональные свойства (особенно растворимость белка) изолята конопляного белка хуже по сравнению с изолятом соевого белка [3]. Хотя конопляный белок имеет хороший потенциал для применения в качестве источника белкового питания, но он демонстрирует гораздо функциональные свойства, особенно растворимость белка, по сравнению с изолятом соевого белка [3]. Плохие функциональные свойства могут сильно ограничить применение этого белка во многих рецептурах пищевых продуктов. Для решения данной проблемы возможно применение мягких способов выделения белка, ферментативной и физической модификации изолята конопляного белка для улучшения его функциональных свойств, а также повышения его биологической активности.

Таблица 1.

Состав высокобелковой конопляной муки

Table 1.

Composition of high-protein hemp flour

Показатель Index	Содержание Value
Массовая доля белка, % Mass fraction of protein, %	47,22
Массовая доля жира, % Mass fraction of fat, %	13,1
Массовая доля углеводов, % Mass fraction of carbohydrates, %	21,4
Зольность (общая зола), % Ash content (total ash), %	9,63
Влажность, % | Humidity, %	8,9
Кальций, мг/кг | Calcium, mg/kg	3430
Фосфор, мг/кг | Phosphorus, mg/kg	23900
Магний, мг/кг | Magnesium, mg/kg	9500
Калий, мг/кг | Potassium, mg/kg	14800
Железо, мг/кг | Iron, mg/kg	277

Обычно ферментативная модификация предпочтительнее из-за более мягких условий процесса, более легкого контроля реакции и минимального образования побочных продуктов [4].

Выделение белка из объектов исследований электрофоретическим методом показало, что он представлен в основном 3–4 фракциями белка с высокой молекулярной массой с различной растворимостью (альбуминами, глобуминами, проламинами, глютелинами и их комплексами, включая нерастворимый белок). Такое массовое распределение белка свидетельствует о вероятности его осаждения в большом количестве в изоэлектрической точке для получения концентрированных белковых препаратов.

Цель работы – исследование влияния способов экстракции и получения на свойства белка конопляной муки

Материалы и методы

Обезжиренная конопляная мука, полученная холодным прессованием, предоставленная ООО «Макошь», дистиллированная вода, NаОН, 0.1 М, СаСl 2 0.1 М, 0.1 М НСl фитаза TOLERASE™ P 20000G, OOO Банком Белград, Сербия.

При фракционном разделении конопляного белка в качестве экстрагентов использовались вода, 0.1 М раствор СаСl 2 и 0.1 М раствор NаОН.

Затем фракцию, экстрагируемую щелочью, нейтрализуют 0,1 М НСl до рН-6.8–7.0, а фракцию подвергнутую солевой экстракции разбавляют водой в соотношении 1:3. Для получения концентрата белковых фракций их подвергают ультрафильтрации на лабораторной установке ультрафильтрации Водопад УМТКп – 1. Для водной и солевой экстракции подвергали мембранной ультрафильтрации / диафильтрации с использованием мембраны с отсечкой по молекулярной массе 0.14 мкм, а для щелочной фракции 1.4 мкм.

Определение молекулярной массы полученных фракций осуществляли методом SDS-ПААГ электрофореза. При выполнении эксперимента были использованы следующие реактивы: 30%-ный раствор акриламида; 10%-ный раствор DS-NA; 2М ТРИС-НСl (рН 8,8); 1М ТРИС-НСl (рН 6,8); 1%-ный раствор персульфата аммония; 0,5%-ный раствор бромфенолового синего; 2N раствор соляной кислоты; глицин; 2-меркаптоэтанол; кумасси R-250; кумасси G-250; этиловый спирт; ледяная уксусная кислота.

Изучение влияния рН на выход белка и молекулярную массу полученных фракций белка конопли проводили в диапазоне рН от 6.0 до 10.0.

Определение аминокислотного состава полученных фракций белка конопли осуществляли по ГОСТ 32195–2013 (ISO 13903:2005). [7]

Содержание белка определяли с помощью комплекта оборудования по Кьельдалю на базе АКВ-20 (Виллитек, Россия) с коэффициентом пересчета 6,25. Жиры, зола и влагасодержание было определено в соответствии с официальными процедурами AOAC (AOAC, 2019 г.).

Получение белкового изолята из конопляной муки

В качестве объекта исследования в данной работе была использована обезжиренная конопляная мука, полученная при холодном отжиме масла. Муку дополнительно измельчали на молотковой дробилке и просеивали через сито № 1 с размером ячейки 1,0 мм. Степень измельчения оказывает непосредственное влияние на скорость экстракции и гидролиза. Чем мельче помол, тем эффективнее и быстрее идет процесс биодеградации сложных углеводов.

Для получения изолята белка, обезжиренная мука заливалась дистилированной водой гидромодуль 1:8. Далее, методом известным как мицеллизация, основанном на способности белков образовывать агломераты с мицеллярной структурой осуществлялось непосредственное извлечение белков из раствора. Это происходит за счет уменьшения ионной силы раствора, в котором они солюбилизированы [3]. В соответствии с описанным методом мицеллизации были экстрагированы белки из обезжиренной муки 0,1 М раствором СаСl2 при рН 7 в течение 1 ч при температуре 37 °С. Концентрат перемешивали в течение 2 ч при температуре 25 °С, затем, раствор центрифугировали при частоте вращения 7000 с-1, в течение 5 минут, затем осаждали 0,1 М НСl в изоэлектрической точке и снова центрифугировали, осадок промывали дистилированной водой, а затем осуществляли сублимационную сушку.

Получение УФ концентрата конопляного белка

Обезжиренную конопляную муку измельчали на молотковой дробилке и просеивали через сито № 1 с размером ячейки 1,0 мм. Затем, подвергали гидролизу фитиновой кислоты с использованием фитазы TOLERASE™ P 20000G, OOO Банком Белград, Сербия, гидромодуль 1:8 при 55 ℃, 60 мин. Затем рН среды доводился до требуемых значений (таблица 2) и еще 60 минут осуществлялось экстрагирование

После гидролиза смесь кратковременно нагревалась до 90 ℃ с целью инактивации ферментов и направлялась на центрифугирование в центробежном сепараторе при частоте вращения 3500 с-1 в течение 5 минут. Полученный супернатант концентрировали ультрафильтрацией используя каскад из мембран 1,4 и 0,14 мкм, а затем разбавляли 1:10 дистиллированной водой и отправляли на распылительную сушку.

Результаты

В результате последовательной экстракции различными экстрагентами общая масса полученных белков составила 36,8% от количества исходного сырья. Содержание альбуминов, глобулинов и глютелинов составило 11.4, 22.08, и 3.68 г. на 100 г. муки соответственно. Самой объемной фракцией конопляного белка выявлена глобулиновая (эдестин), содержание альбуминовой фракции соответствовало литературным данным, кроме того, выявлено достаточно высокое содержание глютелиновой фракции, в количестве 10% от общего белка.

В процессе получения изолятов и концентратов белков из конопляной муки были получены белки, сильно отличающиеся внешне (рисунок 2, 3).

Разница в органолептических показателях двух приведенных продуктов, обусловлена переходом гидролизованной фитиновой кислоты в пермеат при ультрафильтрации и практически полном освобождении от нее, полученного белкового концентрата. В случае получения изолята, она частично связывается с белковыми веществами, образуя нерастворимые комплексы с катионами и переходит в целевой продукт, что не только ухудшает его функционально-технологические свойства, но и снижает пищевую ценность и усвояемость.

Рисунок 1. Изолят белка конопляной муки

Figure 1. Hemp flour protein isolate

Рисунок 2. Концентрат из конопляной муки, полученный с использованием ультрафильтрации

Figure 2.  Hemp  flour concentrate obtained using ultrafiltration

Рисунок 3. Полипептидный состав белковых продуктов семян конопли в невосстанавливающих и условиях электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия: 1 – коммерческий белковый концентрат семян конопли; 2 – осажденный изолят белка семян конопли; 3 – УФ-концентрат белковой муки; 4 – белковая мука из семян конопли

Figure 3. Polypeptide composition of hemp seed protein products under non-reducing and electrophoresis conditions in polyacrylamide gel with sodium dodecyl sulfate: 1 – commercial hemp seed protein concentrate; 2 – precipitated hemp seed protein isolate; 3 – UV-concentrate of protein meal; 4 – protein flour from hempseeds

Рисунок 4. Полипептидный состав белковых продуктов семян конопли в восстанавливающих условиях электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия: 1 – коммерческий белковый концентрат семян конопли; 2 – осажденный изолят белка семян конопли; 3 – УФ-концентрат белковой муки; 4 – белковая мука из семян конопли

Figure 4. Polypeptide composition of protein products of hemp seeds under reducing conditions of electrophoresis in polyacrylamide gel with sodium dodecyl sulfate: 1 – commercial protein concentrate of hemp seeds; 2 – precipitated hemp seed protein isolate; 3 – UV-concentrate of protein meal; 4 – protein flour from hemp seeds

Обсуждение

Невосстанавливающие профили SDS-PAGE показали, что полоса 47 кДа содержит основной полипептид в продукте под номером 1 (рисунок 1). Другие полипептиды с более низкой интенсивностью полосы проявляются в полосах 12, 25 и 36 кДа. Однако полосы 25 и 35 кДа, по-видимому, отсутствуют в продукте, полученном с использованием мембранных технологий (номер 3). Сходство полипептидного состава образцов 1, 2 и 4 указывает на то, что методы обработки, использованные для белковых продуктов, экстрагировали сходные белки из цельных семян. Напротив, продукт, полученный с использованием мембранных технологий имел несколько иной полипептидный состав, что позволяет предположить, что процесс мембранной ультрафильтрации приводил к сохранению более высоких значений полипептидов 12 и 47 кДа и, следовательно, меньшей интенсивности белков 25 и 36 кДа.

Простые белки классифицируются на основе дифференциальной растворимости каждой фракции как в воде, так и в растворах неорганических растворителей. Альбуминовую фракцию получают путем суспендирования в воде, глобулиновую – в разбавленных солевых растворах, проламины представляют собой спирторастворимую фракцию, а глютелины – это наиболее труднорастворимая фракция и экстрагируется слабощелочными растворами [1]. В случае с конопляной мукой наличие проламинов при экстрагировании выявлено не было.

Величина рН при экстракции существенно влияет на выход белка. В связи с этим, экстракцию проводили, используя в качестве экстрагентов воду и раствор СаСl 2 при значениях рН от 6.0 до 10.0. Слабокислые растворы для экстрагирования не использовались, так как для преобладающих в конопляном белке глобулинов значение изоэлектрической точки лежит в районе 5.6–5.8 ед., что может привести к их преждевременному выпадению в осадок.

В таблице 2 представлены результаты экстрагирования отдельных фракций белков при разных значениях рН.

Таблица 2.

Фракционирование белка конопли с использованием различных экстрагентов

Table 2.

Fractionation of hemp protein using various extractants

Фракция белка Protein fraction	Экстрагент Extractant	Масса белка, г/100 г. муки при рН Protein weight, g/100 g.
		6.0	7.0	8.0	9.0	10.0
Альбумины Albumin	Вода Water	7.3	8.50	10.8	11.4	12.0
Глобулины Globulins	0,1 М СаСl 2	15,8	16.4	20,08	22.8	23.2
Глютелины Glutelins	0,1 М NаОН	-	1.83	2.81	3.68	3.70

Интенсивная окраска, наблюдаемая в водных экстрактах выше рН 9, вероятнее всего обусловлена солюбилизацией и окислением фенольных соединений, концентрация которых увеличилась примерно в семь раз от рН 6 до 10. При самом высоком применяемом рН от 11 до 12 (в таблице не рассматривается) образование ковалентных комплексов между фенольными соединениями и некоторые полипептиды конопли становятся нерастворимыми, что ухудшает ее функциональные и органолептические свойства.

Аминокислотный состав был проанализирован для оценки белкового концентрата, изолята и фракционированных белков конопли и возможного влияния аминокислотного профиля на биоактивность продуктов.

Таблица 3.

Аминокислотный состав белка конопли, %

Table 3.

Amino acid composition of hemp protein, %

Аминокислота Amino acid	УФ-концетрат белка UV protein acetate	Изолят белка Protein isolate	Альбумины Albumin	Глобулины Globulins	Глютелины Glutelins
Ala	4.19	3,81	3,91	2,84	1,22
Arg	13,20	15,06	12,82	16.7	3,35
Аsр	10,78	11,31	7,01	9,47	2,97
Gln	18,48	19,10	20,07	20,7	10.9
Gly	4,67	4,31	8,26	-	4,01
His	3.48	3,26	3,68	2.4	2.7
Ile	3.59	3,63	2,02	4,7	4.9
Leu	6.87	6,46	4,05	6.5	7.73
Lys	6.94	2,73	7.37	3,69	4.09
Met + Cys	3,8	3,17	1,74	2,9	0,39
Phe + Tyr	7,72	8,33	3,34	9,79	6,68
Pro	4.37	4,30	3,82	4,25	3,87
Ser	5.6	5,58	5,12	1,48	5,73
Thr	3,75	3,42	4,63	3,85	2,60
Val	4,69	4,66	2,90	6,5	3,41

Данные по аминокислотному составу показывают, что в целом аминокислотный состав альбуминовой фракции был сравним с таковым у глобулиновой лишь с некоторыми небольшими отличиями (таблица 3). Например, глобулин имеет более высокое содержание серосодержащих аминокислот, особенно метионина, по сравнению с альбумином. Общеизвестно, что белки семян бобовых бедны серосодержащими аминокислотами, но наши результаты показывают, что фракция глобулина может быть лучшим источником этой аминокислоты, если ее использовать отдельно. Во фракции глобулина также было больше гидрофобных и ароматических аминокислот, что могло способствовать усилению межбелковых взаимодействий между полипеп-тидными цепями.

Заключение

Потенциальное использование изолятов и концентратов белка в значительной степени зависит от их физико-химических и функциональных свойств, при этом большое влияние оказывает усвояемость белка.

Конопляный белок по отдельным фракциям является неполноценным, так как, хотя он содержит все незаменимые аминокислоты, некоторые из них обладают ненадлежащим качеством, чтобы обеспечить допустимый минимум незаменимых питательных веществ для человека; лимитирующей аминокислотой в конопле обычно является лизин, при этом лейцин и L-триптофан представляют собой вторую и третью лимитирующие аминокислоты. При экстракции глобулиновой фракции зафиксировано, что глицин не переходит в экстракт, а предположительно, остается в альбуминовой фракции, также снижается содержание треонина. Но за счет совокупности фракций его биологическая ценность повышается. Баланс содержания аминокислот в УФ концетрате гораздо ближе к «идеальному белку» и в дальнейшем для выделения биоактивных пептидов целесообразно использовать его.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что процессы механического и химического воздействия на конопляную муку обеспечивают получение сырья с высоким содержанием белка, содержащего все незаменимые аминокислоты и характеризующегося преобладающим содержанием суммы водо и солерастворимых фракций.

В связи с выявленными изменениями свойств белка, полученного разными способами по освобождению от антипитательных веществ в дальнейшем, планируется обратить внимание на этот вопрос отдельно.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 22–26–00277 «Альтернативные протеины: влияние структуры на функционально-технологические свойства и биологические функции»)