Коррекция нарушении процессов свободнорадикального окисления и метаболизма коллагена суставного хряща при экспериментальной травме коленного сустава

В настоящее время многих исследователей беспокоит проблема травматических повреждений крупных суставов, несмотря на разнообразие современных методов лечения [1]. Повреждение суставного хряща является пусковым фактором, активирующим цепь последовательных воспалительных изменений в травмированном суставе [2]. Важное место в патогенезе посттравматического остеоартроза отводится активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), продукты которого участвуют в формировании дегенеративнодистрофических изменений всех компонентов сустава [3]. Мигрирующие в очаг воспаления активированные нейтрофилы и макрофаги, способствуют избыточному накоплению активных форм кислорода, образующихся в результате деструкции хондроцитов и последующего высвобождения митохондриальных ферментов. Они, воздействуя на полиненасыщенные жирные кислоты клеточных мембран, запускают цепь реакций ПОЛ, что в конечном итоге способствует развитию оксидативного стресса [4]. Повреждающему действию свободных радикалов препятствует антиоксидантная система (АОС) организма, включающая низкомолекулярные антиоксиданты и антиоксидантные ферменты. В условиях оксидативного стресса происходит нарушение функционирования ферментов АОС, вследствие чего возникают и накапливаются окислительные повреждения, усугубляющие деструкцию хондроцитов и межклеточного матрикса суставного хряща [5]. На фоне деструктивных процессов так же наблюдается нарушение метаболизма коллагена в результате дисфункции синтетических процессов хондроцитов, проявляющееся синтезом структурно неполноценного короткоцепочечного фибриллярного коллагена, что препятствует нормальной репарации хрящевой ткани [6]. Оксипролин является специфической аминокислотой коллагена, поэтому может выступать в роли маркера катаболизма этого белка. Так, маркером деградации соединительной ткани служат свободный (СО) и пептидносвязанный оксипролин (ПСО), а процессы ее синтеза сопровождаются увеличением количества белковосвязанного оксипролина (БСО) в сыворотке крови. [7].

Учитывая патогенетические механизмы развития острого асептического посттравматического артрита, наиболее целесообразным в комплексном лечении данной патологии является внутрисуставное введение этоксидола, так как он обладает широким спектром воздействия, оказывая мембранопротекторное действие, оптимизирует про- и антиоксидантные системы, улучшает микроциркуляцию, в комбинации с нимесулидом, оказывающим противовоспалительный эффект.

Цель исследования: изучение влияния перорального применения нимесулида в комбинации с внутрисуставным введением этоксидола на процессы ПОЛ, активность эндогенной АОС и некоторые показатели обмена коллагена при экспериментальном посттравматическом артрите.

Материалы и методы

Эксперименты проведены на 105 белых нелинейных крысах обоего пола массой 180-200 г., содержавшихся в стандартных условиях вивария ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева». Про- токол экспериментов был составлен в соответствии с Конвенцией по защите животных, используемых в эксперименте и других научных целях (принятой Советом Европы в 1986 г.), с приказом МЗ РФ № 267 от 19.06. 2003 «Об утверждении правил лабораторной практики»; он соответствует требованиям Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным (2000 г.), одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева».

Животные были разделены на 4 серии. Первую серию составили интактные животные в количестве 15 крыс. В контрольной (30 животных) и опытных сериях под ингаляционным наркозом моделировали повреждение коленного сустава механическим путем в модификации Г. М. Дубровина [8]. Во II контрольной серии лечение не проводилось. Животным III серии (30 крыс), начиная со дня моделирования травмы, проводился курс лечения нимесулидом через зонд в среднетерапевтической дозе 2 мг/кг ежедневно в течение 10 дней. На животных IV серии (30 крыс) изучалась эффективность комбинированного перорального введения нимесулида в дозе 2 мг/кг ежедневно 1 раз в день в течение 10 дней и внутрисуставной терапии эток-сидолом в дозе 5 мг/кг через день в количестве 5 инъекций. На данную методику получен патент на изобретение № 2516951 от 26.03.14 г. Для исследования от животных получали периферическую кровь.

Для оценки интенсивности процессов ПОЛ определяли уровень диеновых конъюгатов, малонового диальдегида при спонтанной (МДА) и железоиндуцированной (Fe-МДА) липо-пероксидации в эритроцитах и плазме. О состоянии АОС судили по уровню активности каталазы в плазме и эритроцитах и супероксиддисмутазы (СОД) в плазме.

Оценку метаболизма коллагена проводили по содержанию свободного (СО), пептидносвязанного (ПСО) и белковосвязанного (БСО) оксипролина в сыворотке крови по методу П.Н. Шараева [9]. На методику определения интенсивности деструктивных процессов в суставе нами получен патент на изобретение № 2463000 от 10.10.2012 г.

Животных выводили из эксперимента на 28 сутки наблюдения. Статистическая обработка результатов исследований проведена с помощью t-критерия Стьюдента. Изменения считали достоверными при р меньше 0,05 (0,01; 0,001).

Результаты и их обсуждение

Моделирование травматического повреждения коленного сустава приводит к активации свободнорадикальных процессов ПОЛ, проявляющееся многократным повышением первичных и вторичных продуктов липопероксидации в крови лабораторных животных, высокий уровень которых оставался на протяжении всего эксперимента. Так, концентрация МДА плазмы и эритроцитов превышала аналогичные данные интактной серии на 101,17% (p<0,001) и 72,85% (p<0,001) соответственно, Fe-МДА был выше должных величин в плазме на 112,06% (p<0,001), в эритроцитах - на 82,22% (p<0,001). Показатель первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов превышал исходные цифры на 118,75% (p<0,05). Активность каталазы в плазме и эритроцитах к концу эксперимента оставалась в состоянии угнетения относительно показателей интактной серии в 2,26 раза (p<0,001) и в 2,04 раза (p<0,001). СОД в плазме была меньше уровня исходного значения в 2,51 раза (p<0,001). Высокая активность процессов свободнорадикального окисления и низкий антиоксидантный потенциал свидетельствует о необходимости медикаментозной коррекции развивающегося дисбаланса ПОЛ.

При пероральном введении нимесулида наблюдалась положительная достоверная динамика снижения содержания продуктов ПОЛ: МДА и Fe-МДА плазмы составили 9,17±0,41 мкмоль/л и 19,86±1,15 мкмоль/л соответственно, что было ниже значений контрольной серии на 11,14% (p1<0,05) и 10,38% (p1<0,05). Выявлено статистически значимое снижение МДА в эритроцитах при спонтанном окислении липидов на 11,06% (p1<0,05), а при железоиндуцированном окислении – на 11,97% (p1<0,05). При этом концентрация в плазме МДА и Fe-МДА была выше показателя интактных животных в 1,79 (p<0,001) и 1,99 раза (p<0,001), в эритроцитах в 1,54 (p<0,001) и 1,60 раза (p<0,001) соответственно. Так же сохранялся высокий достоверно не изменяющийся уровень диеновых конъюгатов, превышавший норму в 1,94 раза (p<0,001). При сравнении с соответствующими показателями контрольной серии наблюдалось увеличение уровня каталазы в плазме крови на 22,0% (p1<0,05), в эритроцитах на 21,92% (p1<0,05), а СОД – на 25,49% (p1<0,05) соответственно. Но, несмотря на определенный рост показателей АОС, их содержание было значительно ниже исходного уровня: активность каталазы в плазме в 1,85 раза (p<0,001), каталазы в эритроцитах в 1,68 раза (p<0,001), супероксиддисму-тазы в плазме - в 2,0 раза (p<0,001) соответственно.

На фоне комбинированного введения этоксидола и НПВП относительно данных контрольной серии уровень МДА плазмы и эритроцитов снизился на 45,63% (p1<0,001) и 38,42% (p1<0,001) соответственно. Показатели Fe-МДА плазмы и эритроцитов уменьшились на 47,11% (p1<0,001) и 41,95% (p1<0,001), уровень диеновых коньюгатов на 48,57% (p1<0,001), соответственно. Показатели активности АОС были выше, чем у животных контрольной серии: каталаза в плазме - на 98,00% (p1<0,001), каталаза в эритроцитах – на 93,86% (p1<0,001). Концентрация СОД увеличилась в 2 раза (p1<0,001). Относительно данных серии с нимесулидом при комбинированном введении НПВС и этоксидола МДА плазмы и эритроцитов снизились соответственно на 38,82% (p2<0,001) и 30,75% (p2<0,001). Уровень Fe-МДА плазмы и эритроцитов был ниже на 40,99% (p2<0,001) и 34,02% (p2<0,001) соответственно. Показатель диеновых конью-гатов снизился на 41,94% (p2<0,001) (табл. 1). Изменения антиоксидантной системы проявились увеличением активности каталазы плазмы и эритроцитов на 62,3% (p2<0,001) и 58,99% (p2<0,001) и ростом СОД на 59,38% (p2<0,001) (табл. 2).

При моделировании травматического повреждения коленного сустава в контрольной серии наблюдалось развитие дисбаланса метаболизма коллагена, характеризующееся повышением уровня СО в 2 раза (p<0,001), и значительным ростом ПСО и БСО в 5,3 (p<0,001) и 2,42 (p<0,001) раза относительно животных интактной серии. Наблюдалось повышение коэффициента ПСО/СО на 155,5% над должными значениями.

Таблица 1

Динамика некоторых показателей ПОЛ при травматическом повреждении коленного сустава в эксперименте (M±m)

Показатель	Интактные животные (n=15)	Контрольная серия (n=30)	Нимесулид per os (n=30)	Нимесулид per os и в/с этоксидол (n=30)
МДА плазмы, мкмоль/л	5,13±0,34	10,32±0,40 p<0,001	9,17±0,33 p<0,001 p1<0,05	5,62±0,28 p>0,05 p1<0,001 p2<0,001
Fe-МДА плазмы, мкмоль/л	10,45±0,32	22,16±0,67 p<0,001	19,86±0,79 p<0,001 p1<0,05	11,72±0,58 p>0,05 p1<0,001 p2<0,001
МДА эритроцитов мкмоль/л	8,84±0,54	15,28±0,68 p<0,001	13,59±0,40 p<0,001 p1<0,05	9,42±0,51 p>0,05 p1<0,001 p2<0,001
Fe-МДА эритроцитов мкмоль/л	18,34±1,31	33,42±1,05 p<0,001	29,42±1,55 p<0,001 p1<0,05	19,41±0,62 p>0,05 p1<0,001 p2<0,001
Диеновые коньюгаты, ед/мл	0,16±0,02	0,35±0,04 p<0,05	0,31±0,03 p<0,001 p1>0,05	0,17±0,02 p>0,05 p1<0,001 p2<0,001

Примечание: p - достоверность отличий к данным интактных животных; р1- достоверность отличий к данным контрольной серии; р2 – достоверность отличий к данным при введении нимесулида

Таблица 2

Динамика некоторых ферментов АОС при травматическом повреждении коленного сустава в эксперименте (M±m)

Показатель	Интактные животные (n=15)	Контрольная серия (n=30)	Нимесулид per os(n=30)	Нимесулид per os и в/с этоксидол (n=30)
Каталаза в плазме, (мккат/с∙л)	1,13±0,06	0,50±0,04 p<0,001	0,61±0,04 p<0,001 p1<0,05	0,99±0,04 p>0,05 p1<0,001 p2<0,001
Каталаза в эритроцитах (мккат/ с∙л)	2,33±0,13	1,14±0,06 p<0,001	1,39±0,05 p<0,001 p1<0,05	2,21±0,14 p>0,05 p1<0,001 p2<0,001
СОД в плазме (ед. акт.)	1,28±0,05	0,51±0,05 p<0,001	0,64±0,03 p<0,001 p1<0,05	1,02±0,08 p<0,05 p1<0,001 p2<0,001

Примечание: p - достоверность отличий к данным интактных животных; р1- достоверность отличий к данным контрольной серии; р2 – достоверность отличий к данным при введении нимесулида

Применение нестероидной противовоспалительной терапии способствовало ограничению роста СО в сыворотке крови относительно данных контрольной серии на 13,07% (p3<0,01), ПСО на 47,84% (p3<0,001). Наблюдался рост величины БСО до 91,75±1,20 мкмоль/л, однако это было ниже контрольного значения на 25,96% (p3<0,001). Показатель отношения ПСО/СО снижался на 36,96% (p3<0,001) относительно контрольной серии. При сравнении с должными величинами к концу экспери- мента фракция свободного оксипролина была выше на 79,11% (p<0,001), пептидосвязанный и белковосвязанный оксипролин на 176,68% (p<0,001) и 79,01% (p<0,001) соответственно. Показатель ПСО/СО превышал значение интактных животных на 53,70%.

При комбинированном лечении нимесулидом и этоксидо-лом фракции оксипролина в сыворотке крови по сравнению с данными контрольной серии изменились следующим образом: СО снизился на 50,19% (p3<0,001), ПСО – на 79,19% (p3<0,001), БСО – на 54,70% (p3<0,001), ПСО/СО – на 60,14% (p3<0,001) (табл. 3).

Обсуждение

В ходе исследования установлено, что процессы свободнорадикального окисления играют важную роль в патогенезе посттравматического артрита, способствуя усилению процессов деструкции и нарушению репаративных возможностей коллагенового каркаса хрящевой ткани. Моделирование посттравматического артрита коленного сустава приводит к развитию дисбаланса метаболизма коллагена, характеризующегося значительным повышением СО и ПСО в сыворотке крови, свидетельствующих о деструкции соединительной ткани. На фоне продолжающихся деструктивных процессов коллагена происходит резкий рост белковосвязанной фракции оксипролина, определяющий высокую активность неполноценного фибрил-логенеза, приводя к избыточному накоплению соединительной ткани с развитием склерозирования хряща и субхондральной кости.

Применение комбинированного введения этоксидола и ни-месулида способствовало снижению интенсивности процессов липопероксидации и росту антиоксидантной активности ферментов, приближая их уровень к концу эксперимента к интактным значениям. Параллельно к концу эксперимента происходило коррекция нарушений обмена коллагена катаболической и синтетической направленности, определяемые снижением уровня всех фракций оксипролина, что отражает подавление процессов деструкции и избыточной пролиферации соединительной ткани в пораженном суставе.

Таким образом, полученные результаты показывают обоснованность комбинированного применения нестероидной противовоспалительной терапии и внутрисуставного введения этоксидола.

Выводы

• 1.    Травматическое повреждение сустава приводит к резкому росту процессов ПОЛ и угнетению активности АОС, приводящих к усилению деструктивных процессов коллагеновых биополимеров соединительной ткани, являющихся основным каркасом внеклеточного матрикса суставного хряща.

• 2.    Пероральное введение нимесулида в сочетании с внутрисуставным введением этоксидола к концу эксперимента способствовало значительному снижению продуктов липопе-роксидации, уменьшая свободнорадикальную биодеструкцию коллагеновых волокон и блокируя избыточную пролиферацию соединительной ткани, предупреждая развитие дегенеративнодистрофических изменений и доказывая, тем самым, целесообразность сочетанного применения данных препаратов.