Корреляционные взаимозависимости содержания общих желчных кислот с основными биохимическими показателями крови у норок (Mustela vison schreber, 1777) при жировой дистрофии печени и токсическом гепатите

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда ¹ 22-26-00158,

В настоящее время в ветеринарной науке активно развивается гипотеза о том, что содержание сывороточных желчных кислот (ЖК) может рассматриваться в качестве раннего предиктора повреждения печени, этот маркер более чувствителен и специфичен, нежели классические биохимические маркеры, и служит точным независимым прогностическим показателем. Однако достоверно охарактеризовать предикторный потенциал не позволяет отсутствие достаточного объема данных о сравнении биохимических маркеров патологий печени и содержания желчных кислот, а также корреляционных взаимосвязей между этими показателями. Оценка изменений количества желчных кислот в сыворотке крови при физиологических и патологических состояниях, влияющих на печень, считается одной из актуальных задач ветеринарной гепатологии, но результаты такой оценки противоречивы (1-4).

Научные публикации, в том числе по итогам рандомизированных контролируемых исследований предикторных функций желчных кислот, подчеркивают диагностическую значимость измерения их содержания в сыворотке крови для выявления незначительной и ранней дисфункции печени. Именно количественный показатель сывороточных ЖК считается достоверным скрининговым тестом на наличие патологий печени и желчевыводящей системы, применимом в клинической практике (5-7). Вместе с тем, несмотря на успехи в изучении стадий энтерогепатической циркуляции ЖК, количественного и качественного состава их пула, влияния на него нарушений печеночного синтеза и кишечной абсорбции, до сих пор не предложена практически применимая статистически обоснованная диагностическая модель на их основе. Это связано, в первую очередь, с различиями в качественном составе ЖК между таксонами, а также с отсутствием протоколов включения их определения в комплексную оценку состояния гепатобилиарной системы (8-10).

В настоящее время тест на количественное содержание сывороточных ЖК считается крайне полезным дополнением, но не альтернативой классическому диагностическому тесту, позволяющему выявить патологии гепатобилиарной системы в их субклиническом проявлении. Это связано, в том числе, с отсутствием данных о корреляционных взаимосвязях между указанными методами, что позволило бы достоверно определить степень их валидированности как между собой, так и в отношении конечной задачи (11-14).

В предыдущем исследовании (15) мы определили корреляции между количеством желчных кислот и показателями, полученными с использованием стандартной биохимической печеночной панелью реагентов.

В представленной работе мы впервые установили взаимосвязь между показателем «общие желчные кислоты» и классическими (биохимическими) показателями состояния гепатобилиарной системы при ее наиболее распространенных патологиях — жировой дистрофии и токсическом гепатите.

Наша цель заключалась в выявление корреляционных взаимосвязей между результатами стандартных лабораторных биохимических анализов и содержанием желчных кислот в сыворотке крови норок при жировой дистрофии печени и токсическом гепатите, а также в оценке этого показателя как предиктора состояния гепатобилиарной системы.

Методика. Опыты проводили в 2022 году на звероферме «Мерме-рины» (д. Мермерины, Тверская обл., Калининский р-н). В качестве модельных животных были выбраны норки породы паломино ( Mustela vison Schreber, 1777) в возрасте 1 года.

Перед исследованием были проанализированы результаты диспансеризации на звероферме, после чего на основе анамнеза и физикального осмотра отобрали животных-кандидатов (10 самок и 10 самцов) с подозрением на жировую дистрофию печени с последующим подтверждением диагноз на основании клинико-биохимических исследований (16, 17), а также сравнения с биохимическими показателями клинически здоровых животных с той же зверофермы (15).

В связи с тем, что токсический гепатит считается широко распространенной, но спорадически проявляющейся патологией, при создании паритетной группы отобрали клинически здоровых животных (10 самок и 10 самцов) для последующего индуцирования у них патологии. Рандомизацию проводили групповым (блочным) методом со стратификацией по возрасту и полу (18). Токсический гепатит индуцировали хлористым этиленом (1,2-дихлорэтаном), дозировку токсиканта рассчитывали индивидуально для каждого животного с использованием межвидового коэффициента пересчета доз (19). Проводимые в рамках исследования манипуляции одобрены Комиссией по биоэтике ФГБОУ ВО СПбГУВМ, соответствуют Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (The European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes; Strasbourg, 18.III.1986), а также Европейской Директиве 2010/63/ЕС (20).

Кровь для анализа брали с соблюдением правил асептики и антисептики из надрезанного кончика хвоста, использовали вакуумные пробирки для биохимических исследований Improvacuter (Китай) с активатором свертывания (21). Общие желчные кислоты количественно детектировали с помощью BSBE-набора («BSBE», Китай).

Содержание общего белка, альбуминов, общего билирубина, щелочной фосфатазы, глюкозы, холестерина, общих желчных кислот, аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы (с расчетом коэффициента де Ритиса) определяли на биохимическом анализаторе URIT 8021A VET («URIT Medical Electronic Group Co., Ltd», Китай). Количество общего белка оценивали биуретовым методом на основе цветной реакции с сульфатом меди (АО «ЛенРеактив», Россия) в щелочной среде, альбуминов — колориметрически с использованием бромкрезолового зеленого (АО «Лен-Реактив», Россия), общего билирубина — колориметрическим диазометодом по Йендрашику-Клеггорну-Грофу с азотнокислым натрием (АО «Лен-Реактив», Россия), коэффициент де Ритиса рассчитывали как соотношение активности сывороточных аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы (17). Содержание глюкозы определяли стандартным глюкозооксидантным методом (производитель глюкозооксидазы — ООО «БиоПрепарат», Россия), холестерина — методом Илька (производитель реактива Илька — АО «ЛенРеактив», Россия) (22).

При расчете коэффициента ранговой корреляции Кендалла (Kendall rank correlation τ coefficient) для содержания общих желчных кислот как диагностического критерия с неизвестной корреляцией относительно остальных показателей использовали формулу:

,

-N(N-1)

где P — число положительных, Q — число отрицательных единиц, приписанных парам при сопоставлении их рангов по обоим признакам, N — число случаев (23).

По результатам анализа с целью подтверждения выводов о наличии, величине и силе корреляции дополнительно рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Гудмена-Краскела (гамма-критерий Гудмена-Крас-кела, Goodman-Kruskal's gamma), поскольку этот параметр определяется как мера ранговой корреляции с учетом сходства упорядоченности данных при ранжировании по каждой из величин. Параметр измеряет силу ассоциации перекрестно сведенных в таблицу данных, когда обе переменные измеряются на порядковом уровне, и рассчитывается по следующему алгоритму:

_G _ N_s -N _d

Ns+Nd, где Ns — число пар случаев, ранжированных в прямом порядке по обеим переменным (число конкордантных пар), Nd — число пар случаев, ранжированных в обратном порядке по обеим переменным (число перевернутых пар); случаи, когда переменные в паре равны между собой, отбрасываются. Эту статистику можно рассматривать как оценку максимального правдоподобия для теоретической величины у:

Ps-Pd

Y = ——^d ,

Ps+Pd, где Ps и Pd — вероятности того, что случайно выбранная пара наблюдений будет располагаться соответственно в том же или противоположном порядке при ранжировании по обеим переменным (24).

Обработку результатов проводили в программе Statistica 6.0. Вычисляли средние значения показателей ( M ), стандартные ошибки средних (±SEM), определяли наличие корреляций, их величину и силу. Для оценки достоверности различий показателей между больными и здоровыми животными использовали t -критерий Стьюдента (25).

Результаты . Выбор норок в качестве модели был обусловлен их видовой склонностью к гепатопатиям и максимальной скоростью энтерогепа-тической циркуляции желчных кислот среди млекопитающих (15).

Биохимические показатели сыворотки крови норок ( Mustela vison Schreber, 1777) породы паломино с жировым гепатозом и токсическим гепатитом ( M ±SEM, Звероферма «Мермерины», д. Мермерины, Калининский р-н, Тверская обл., 2022 год)

Показатель	Жировой гепатоз		Токсический гепатит		Клинически здоровые (15)
	самцы ( n = 10)	самки ( n = 10)	самцы ( n = 10)	самки ( n = 10)	самцы ( n = 100)	самки ( n = 100)
Общий белок, г/л	69,6±3,11	67,0±4,26	95,5±6,20*	68,9±4,30	76,7±2,14	80,1±1,02
Альбумины, г/л Коэффициент де	36,8±4,32	38,4±3,28	42,4±2,13	42,3±1,26	34,7±0,71	33,3±0,56
Ритиса (АСТ/АЛТ) Щелочная	0,90	0,66	0,31	0,81	0,92	0,86
фосфатаза, МЕ/л	375,1±37,84*	404,4±27,52*	219,9±28,34*	286,0±21,67*	66,4±2,31	76,9±4,12
Глюкоза, ммоль/л Холестерин,	5,0±0,23	5,70±0,26	5,1±0,63	4,4±0,27	2,9±0,11	3,0±0,17
ммоль/л Билирубин об-	9,9±0,56*	8,5±0,24	4,5±0,22	4,1±0,31	5,9±0,10	6,9±0,23
щий, мкмоль/л Общие желчные кислоты,	10,0±0,83*	12,2±1,04*	12,2±0,18*	10,6±0,72*	5,1±0,32	5,4±0,43
мкмоль/л	12,2±1,13*	12,4±1,09*	22,4±2,16*	36,1±3,24*	4,6±1,02	5,6±1,19
Примечание.	АСТ — аспартатаминотрансфераза, АЛТ —			аланинаминотрансфераза.
* Различия относительно клинически здоровых животных статистически значимы при р < 0,05.

На основании анализа биохимических показателей сыворотки крови здоровых и больных норок (табл.) можно сделать вывод о правильном формировании подопытных групп. У самцов и самок с предполагаемым жировым гепатозом отмечалось значительное повышение активности щелочной фосфатазы (один из основных биохимических маркеров патологий печени), незначительные нарушения пигментного обмена и повышение содержания общих желчных кислот (что характерно для основной, субклинической, формы жирового гепатоза), а также типичное для указанной патологии нарушение жирового обмена. У самцов и самок с индуцированным токсическим гепатитом, помимо общих показателей нарушения функций печени (повышение активности щелочной фосфатазы), наблюдалось отклонения в белковом обмене (повышенное количество общего белка), что характерно именно для токсического гепатита, поскольку при воспалительных процессах одной из первых нарушается белоксинтезирующая функция печени (13, 14), а также значительное повышение количества желчных кислот по сравнению с референсными значениями.

Полученные результаты считали случайными величинами. Однако в предыдущем исследовании (15) у животных с отсутствием патологий гепатобилиарной системы нами были выявлены некоторые корреляционные взаимозависимости. Поэтому для дополнительного анализа с учетом уже полученных данных мы рассчитывали коэффициенты ранговой корреляции Кендалла и использовали метод пропорциональной редукции ошибок корреляции Гудмена-Краскела для подтверждения гипотезы о взаимосвязи показателей (26-28). Выбор этого расчетного критерия обосновывался необходимостью измерения порядковой связи между двумя величинами, которые нельзя считать заведомо некоррелирующими, так как в предыдущем исследовании (15) для некоторых показателей корреляции были установлены, а использованная методика статистической обработки данных считается непараметрической, поскольку не основывается на каких-либо предположениях о распределениях между показателями, что позволяет подтвердить или опровергнуть гипотезу.

А

Б

Рис. 1. Значения коэффициента ранговой корреляции Кендалла, демонстрирующие связи между

содержанием желчных кислот и основными биохимическими показателями сыворотки крови при жировом гепатозе (А) и токсическом гепатите (Б) у самцов (кружки, n = 10) и самок (треугольники, n = 10) норок ( Mustela vison Schreber, 1777) породы паломино (Р > 95 %, звероферма «Мермерины», д. Мермерины, Тверская обл., Калининский р-н, 2022 год) . При т > 0,5 корреляция считается прямой устойчивой, при т <  - 0,5 — обратной устойчивой, в остальных случаях гипотеза несостоятельна.

А

Б

Рис. 2. Значения коэффициента ранговой корреляции Гудмена-Краскела, демонстрирующие связи между содержанием желчных кислот и основными биохимическими показателями сыворотки крови при жировом гепатозе (А) и токсическом гепатите (Б) у самцов (кружки, n = 10) и самок (треугольники, n = 10) норок ( Mustela vison Schreber, 1777) породы паломино (Р > 95 %, звероферма «Мермерины», д. Мермерины, Тверская обл., Калининский р-н, 2022 год) . При у > 50 % корреляция считается прямой устойчивой, y <  - 50 % корреляция считается обратной устойчивой, в остальных случаях гипотеза несостоятельна.

Расчет коэффициентов ранговой корреляции Кендалла и Гудмена-Краскела выявил связь между содержанием желчных кислот и основными биохимическими показателями в сыворотке крови при жировом гепатозе и токсическом гепатите у норок (рис. 1, 2).

При жировом гепатозе у самцов норок наблюдались прямые устойчивые корреляционные взаимозависимости содержания желчных кислот с количеством щелочной фосфатазы и холестерина, устойчивые обратные — с коэффициентом де Ритиса; у самок были обнаружены прямые устойчивые корреляции с содержанием общего белка, альбуминов, щелочной фосфатазы и холестерина, устойчивые обратные — с коэффициентом де Ритиса.

Взаимозависимое повышение количества желчных кислот и показателей по щелочной фосфатазе и холестерину объясняется их физиологической связью при энтерогепатической циркуляции: первоначальным субстратом для синтеза желчных кислот считается именно холестерин, а их индукция приводит к усилению агрегации щелочной фосфатазы (29). Более 380

того, жировая дистрофия печени негативно влияет на ферментативные системы, регулирующие функции половых гормонов, отвечающих, в том числе, за липидный обмен (30). Устойчивая обратная связь содержания желчных кислот с коэффициентом де Ритиса (количество трансаминаз) обусловлена чувствительностью этих показателей, которые изменяются при любых патологических процессах, связанных с гепатобилиарной системой. Как следствие, увеличение концентрации желчных кислот в сыворотке крови и повышение количества трансаминаз (уменьшение коэффициента де Ритиса) при подобных патологиях будет ординарным случаем.

Корреляция с содержанием общего белка и альбумина предположительно была связана с единообразием патогенетических механизмов возникновения гепатопатий на начальных этапах, поскольку, по мнению многих авторов (13, 14), любые невоспалительные патологии печени на тканевом уровне проявляются смешанной белково-жировой дистрофией в первичной фазе патогенетического процесса. Клинически это может определяться как одновременное нарушение белоксинтезирующей функции и метаболизма липидов, что особенно заметно у самок в связи с более выраженными количественными изменениями белковых фракций (было выявлено у здоровых животных при отсутствии патологий гепатобилиарной системы) (15). Отмечено совпадение результатов в двух системах подсчета ранговой корреляции.

При токсическом гепатите как у самок, так и у самцов мы отмечали устойчивые прямые корреляционные связи между количеством общих желчных кислот и содержанием общего белка, альбуминов и щелочной фосфатазы, а также прямую обратную связь с коэффициентом де Ритиса. При этом у самок наблюдалась прямая корреляция с количеством общего билирубина, что можно объяснить более низкими конституциональными референсными интервалами (31) физиологической нормы. Следовательно, у самок любое повышение этого показателя будет более статистически репрезентативно, чем у самцов. Отмечено совпадение результатов в двух системах подсчета ранговой корреляции.

Взаимосвязь между сывороточными желчными кислотами и классическими метаболическими маркерами функционального состояния печени практически не описана в научной литературе. Так, З.Ш. Миннулина (32) при исследовании подобных корреляций при стеатозе печени приходит к сходным выводам относительно величин коэффициентов корреляции и половых различий в клинико-биохимических проявлениях гепатопатий. Однако, несмотря на сходные физиологические механизмы, жировой гепатоз печени животных и стеатоз печени у человека при идентичных патогенетических проявлениях значительно различаются по этиологии.

Недавно проведенные исследования свидетельствуют о том, что эн-терогепатическая циркуляция желчных кислот представляет собой достаточно обособленный физиологический процесс, который практически не зависит от патологических изменений, которые проявляются в преобразовании биохимических профилей крови. Исключением считаются случаи, когда подобные патологии локализуются в органах и тканях гепатобилиарной и нервной систем, а также заболевания, влияющие на кишечный микробиом (33-35). В то же время изменение содержания желчных кислот способно влиять на некоторые биохимические показатели (например, на уровень холестерина, активность щелочной фосфатазы), но диагностическое значение подобных корреляций либо не было предметом изучения, либо не принимается во внимание (36, 37).

Таким образом, у норок породы паломино патологии гепатобилиарной системы различного генеза характеризуются значительным (2-2,5-кратным при жировом гепатозе и 4-7-кратным при токсическом гепатите) повышением содержания сывороточных желчных кислот, что считается специфическим маркером таких патологий. При жировом гепатозе у самцов норок выявлены прямые устойчивые корреляции содержания желчных кислот в сыворотке крови с концентрацией щелочной фосфатазы (τ = 0,57, γ = 51 %) и холестерина (τ = 0,62, γ = 60 %), а также устойчивые обратные корреляции с коэффициентом де Ритиса (τ = -0,72, γ = -70 %). У самок содержание желчных кислот прямо и устойчиво коррелирует с количеством общего белка (τ = 0,64, γ = 59 %), альбуминов (τ = 0,67, γ = 62 %), щелочной фосфатазы (τ = 0,60, γ = 64 %) и холестерина (τ = 0,68, γ = 74 %), а также находится в устойчивой обратной взаимосвязи с коэффициентом де Ритиса (τ = -0,76, γ = -72 %). При токсическом гепатите как у самок, так и у самцов мы выявили устойчивые прямые корреляционные связи между концентрацией общих желчных кислот в сыворотке крови и количеством общего белка (т 3 = 0,73, Y 3 = 74 %; т $ = 0,69, Y $ = 67 %), альбуминов (т 3 = 0,75, Y 3 = 71 %; т $ = 0,58, y $ = 53 %) и щелочной фосфатазы (т 3 = 0,54, Y 3 = 51 %; т $ = 0,59, у $ = 53 %), а также прямую обратную связь с коэффициентом де Ритиса (т 3 = -0,82, у 3 = 58 %; т $ = -0,84, у $ = -79 %). Кроме того, у самок наблюдалась прямая корреляция с концентрацией общего билирубина (τ = 0,81, γ = 91 %). Показатели ранговых корреляций, рассчитанные с использованием двух статистических методов, практически совпадали.