Краткий обзор современных добавок к разбавителям спермы, применяемых для повышения устойчивости семени баранов к замораживанию

Базовые технологии, связанные с замораживанием спермы, доказали эффективность и преимущества в молочном скотоводстве, но их применение в овцеводстве не обеспечило какого-либо заметного прогресса. По существу это происходит вследствие двух причин: первая заключается в неустойчивости спермы барана к криоконсервации, вторая обусловлена физиологическими и анатомическими особенностями продвижения сперматозоидов в репродуктивном тракте самки. То, что замораживание и оттаивание спермы барана вызывает значительные генетические нарушения и повреждения мембраны, известно давно (1). Так как результативность оплодотворения при цервикальном осеменении существенно ниже, чем при лапароскопическом, искусственное осеменении с применением замороженной спермы не стало в овцеводстве распространенной практикой (2). Кроме того, расходы на криоконсервацию спермы баранов почти в 20 раз выше аналогичных затрат при хранении бычьей спермы (3). В настоящее время внимание исследователей сфокусировано на подборе состава среды, оценке свойств in vivo и эффективности различных криопротекторов, антиоксидантов и специальных добавок при криоконсервации (4).

Анализируя публикации по этой проблеме, мы пришли к выводу, что в специальной литературе за последние 16 лет не удается обнаружить исчерпывающих сведений, касающихся исследований замороженной спермы барана. В 2000-х годах ученые были в основном сосредоточены на по- иске добавок, обеспечивающих репарационные процессы в мембранах и усиление подвижности сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением в образцах криоконсервированной спермы. Судя по всему, с 2000-х годов до настоящего времени базовые разбавители, применяемые для замораживания семени баранов, мало изменились, тогда как число различных добавок к ним, протестированных за этот период, велико.

Цель нашей работы — обобщить сведения о тех добавках к разбавителям для криоконсервации, описанных в литературе за период с 2000 по 2016 год, которые положительно влияют на репродуктивные характеристики спермы барана после замораживания и оттаивания.

Семенная жидкость и ее бeлковые компоненты (semen plasma proteins, SPPs). Роль семенной жидкости в таких репродуктивных технологиях, как замораживание спермы и определение пола, уже доказана, и исследователи пришли к согласованному мнению, что ее добавление в среду для криоконсервации положительно сказывается на подвижности и морфологических характеристиках сперматозоидов после оттаивания (5, 6). Более того, представляет интерес тот факт, что такой эффект при замораживании и оттаивании проявляется только в семенной жидкости барана, тогда как в бычьей семенной жидкости его не обнаружили (7).

При применении только семенной жидкости либо при ее сочетании с другими компонентами, такими как олеиновая или линолевая кислота, витамин Е и др., защитный эффект наблюдают не только в свежей сперме, но и после ее замораживания и оттаивания, следовательно, SPPs в сочетании с олеиновой или линолевой кислотами, витамином Е обеспечивают постоянное функционирование супероксиддисмутазы — одного из ключевых ферментов в системе антиоксидантной защиты (6). Тем не менее, знаний для идентификации и синтеза таких протеинов с желательными свойствами все еще недостаточно, и требуются исследования, которые позволят преодолеть имеющиеся затруднения биологического характера (8).

Антио кс иданты. Поскольку у сперматозоида по сравнению с соматической клеткой содержание ненасыщенных жирных кислот в мембране высокое, они предрасположены к окислительному стрессу, вследствие чего содержимое и мембрана этих половых клеток крайне чувствительны к холодовому шоку. Более того, у сперматозоидов отсутствуют механизмы восстановления, которые предотвращают повреждение клеток, вызываемые активными формами кислорода. Антиоксиданты, в основном присутствующие в семенной жидкости, обладают ограниченным протек-тивным эффектом (9, 10). Антиоксиданты используются не только для защиты целостности мембраны половых клеток, но также для предотвращения повреждения мембран у эмбрионов и в ооцитах, которые подвергаются депрессивному действию перекисного окисления липидов и образующихся активных форм кислорода (11).

Тиоловые соединения. Известно, что вещества тиоловой природы способны выполнять функцию «мусорщика» в отношении цитоксинов и активных форм кислорода, эффекты которых проявляются на клеточном уровне (12). В последние годы тиоловые соединения, такие как l-эр-готионеин (LE), цистеин и N-ацетилцистин, достаточно часто становились предметом исследования. Показано, что тиолы благоприятно влияют на устойчивость спермы барана к образованию кристаллов льда при замораживании (13-18).

Цистеин. Цистеин относится к тиоловым соединениям, оказывающим защитный эффект при оксидативном стрессе, которому подвергаются половые клетки спермы барана в процессе криоконсервации. Добавление цистеина в среду для замораживания спермы повышает подвижность спрематозоидов и активность каталазы (14).

N-ацетилцистин ( NAC ) . NAC, который служит предшественником при внутриклеточном синтезе SH-глутатиона, редко становился объектом исследования в связи с проблемой замораживания спермы барана (17, 18).

Ферменты антиоксидантной системы. Энзиматические антиоксиданты защищают клетки, предотвращая повреждения клеточной мембраны под действием образуемых в клетке активных форм кислород. К ним относятся супероксиддисмутаза (SOD), каталаза, глутатионпероксидаза (GPx) и глутатионредуктаза (GR) (19).

Некоторые исследователи заявляют, что введение в разбавитель каталазы (20), SH-глутатиона (GSH), SOD (21, 22), Gpx и Tempo или Tempol как имитаторов SOD (23) улучшало качество спермы барана в образцах, подвергшихся замораживанию и оттаиванию.

Неэнзиматические антиоксиданты и сахара (трегалоза и сахароза). Синтетические антиоксиданты или пищевые добавки, например витамины и минеральные вещества, BSA (bovine serum albumin, бычий сывороточный альбумин), трегалоза, витамин C, витамин E, цинк, цистеин, таурин, гипотаурин, глутатион и пр. рассматриваются как антиоксиданты неферментной природы (19). По некоторым данным, BSA, цистеин, ликопин (24), трегалоза, таурин, цистеамин, гиалуронан (24) и сочетание сахарозы и тригалозы (25) при добавлении в разбавители для замораживания позволяли получить удовлетворительный процент подвижных, жизнеспособных сперматозоидов с сохраненной структурой акросомальной мембраны.

Лецитин. Несмотря на то, что механизмы действия лецитина как стабилизатора при замораживании и оттаивании спермы неясен, сообщается, что он и другие липидные добавки защищают и стабилизируют фосфолипидную мембрану сперматозоида, повышая его устойчивость к замораживанию. В некоторых работах показано, что 1,5 % соевого лецитина либо его комбинация с некоторыми соединениями при добавлении к разбавителям обеспечивают улучшение сперматологических показателей (подвижности, жизнеспособности и целостности мембраны половых клеток) по сравнению с результатами применения гиалуроновой кислоты (HA) (26) и яичного желтка (27) и могут рассматриваться в качестве криопротектора, альтернативного яичному желтку (28). Несмотря на то, что желток, как было выявлено (29), все же имеет преимущество, лецитин может быть использован вместо него. У бахтиярских овец при разведении образца спермы средой, содержащей 1 % лецитина, 20 % яичного желтка и 7 % глицерола, сперматологические показатели оказались самыми высокими, и был сделан вывод о возможности замены яичного желтка лецитином (30).

Жирные кислоты ( FA ) . Длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты (long-chain polyunsaturated fatty acids, LCP-UFA) ряда ω -3 обеспечивают приемлемую стабилизацию клеточной мембраны за счет поддержания текучести и пластичности, поэтому обогащение среды полине-насыщенными жирными кислотами (polyunsaturated fatty acids, PUFA) повышает число, подвижность и оплодотворяющую способность сперматозоидов у млекопитающих (31).

Жирные кислоты, например олеиновая и линолевая ( ω -3 FА), используются в экспериментах как агенты, способствующие противодействию оксидативному стрессу на субклеточном уровне, вызываемым им повреждениям и повышению выживаемости спермы после замораживания и оттаивания. Предполагается, что защитным эффектом при криоконсервации спермы барана могут обладать олеиновая или линолевая кислоты в 244

Варианты добавок, предлагаемых для криоконсервации спермы бараны, и спер-матологические показатели образцов после замораживания-оттаивания (по данным литературы)

Исследование	Базовый	Добавка	Доза	Подвижность	Доля, %
	разбавитель			1 1 2	3	1 4 1 5 1	6

Aisen et al., 2002 TCFY10+G3 Trehalose 100 мМ 65 50 Baran et al., 2004 TCGz SP 7,5 % 30 56 AA      56 Uysal et al., 2007 TCFY10 GSSG 5 мМ 60              78 3 AA 65   10 TCFY10 BSA 20 мг/мл 51              78 4 AA 55   12 TCFY10 Cystein 10 мМ 59               73,5 3 AA 41   19,2 TCFY10 Likopen 800 мкг 57,2             70,5 7 AA 49   16,3 Bucak et al., 2007 TCFY10 Taurine 25 мМ 63,0             73,0 6 AA 44,0 23,7 Bucak et al., 2008 TCFY10+G5 Cystein 5 мМ 61,0            27 10 AA 48   30 Marti et al., 2008 SMY+G7+Galacto +SPP+ol- 4 мг+25 мМ+ 48,8             36,3 27,0 se 112 мМ lin+vit E + 2 мМ Anghel et al., 2009 TCGzY20+G5 Cystein 5 мМ 60              60 60    12 TCGzY20+G5 Cystein 10 мМ 72              70 68    17 Uysal et al., 2009 TCGzY15+G5 Trehalose 100 мМ 72,0             74,5 66,1 28,7 Forouzanfar et al., TCFY20+G7 Lechitin 1 % 51,9             48,1 2010 Maia et al., 2010 TGzY Catalase 50 мкг 69-75 27-30 Silva et al., 2011 TCFY20+G5 SOD 100 МЕ⁄мл 58,4   9,4 33,5 TCFY20+G5 GSH 2 мМ 49,45 9,19 32 Succu et al., 2011 TCFY20+G4 Melatonin 1 мМ 45,9   31       68,7 Silva et al., 2012 TCFY20 Glycerol 5 % 49,2 33,3 TCFY20 EG 3% 41,7 39,8 Silva et al., 2012 TCFY20+G5 Vit E 120 мкM 80     14 55     45 Ari et al., 2012 SMEGsY10+G5 LE 10 мМ 23       27,1 30     37,1 Towhidi et al., 2013 Andromed Vit E+ω-3- 0,1 мМ+ 37     33       35 3 FA +1 нг/мл Das Graças et al., TCGsY20 MF 3 % 38 77 N 2013 TCGsY20 Glycerol 5,3 % 50 84 N Motamedi-Mojdehi TCFY20+G3 CLC 1,5 мг 45 32 et al., 2014 Santiani et al., 2014 SMFY5+G7 Tempo 1 мМ 52 41 Šterbenc et al., 2014 TCFY20+G14 Equex 0,75 % 78     26       88 60 Najafi et al., 2014 TCFY20+G7 SL 1,5 % 53     56 45 Emamverdi et al., TY20 SL 1,5 % 56     26       39 51 2014 Mata et al., 2015 TES-TCF+G4 SL 3,5 % 52 28 AA Talebiyan et al., 2015 TCGsY25+G7 FAAH 0,025 МЕ/мл 66     27 Fast Yıldız et al., 2015 SMEGsY10G5 LE 10 мМ 26              27 49 AA 29   52 Panyaboriban et al., TCFY15G5+ Trehalose+ 30 мМ 79              84 82 2015 +0,5 % Equex +Sucrose Nalley et al., 2016 TCF Y-Omega 3 20 % 60 Câmara et al., 2016 TY10G6 Catalase Arı et al., 2016. TY20G7 GPx 5 МЕ/мл 40     23       36 37     50   72 П р и м е ч а н и е. 1 и 2 — общая подвижность и доля клеток с прямолинейно-поступательным движе- нием, %, 3 — жизнеспособные, 4 — с нормальной акросомальной мембраной, 5 — по данным гипоос-мотического теста, 6 — аномалии. T — Трис-HCl, С — лимонная кислота, F — фруктоза, Gs — глюкоза,

Y — яичный желток, G — глицерол, SM — обезжиренное молоко, GSSG — окисленный глутатион, BSA — бычий сывороточный альбумин, SP — семенная жидкость, SPP+ol-lin — белки семенной жидкости и олеиновая или линолевая кислота, SOD — супероксиддисмутаза, GSH — SH-глутатион, EG — этиленгликоль, MF — метилформамид, LE — L-эрготионеин, ω -3-FA — жирные кислоты, CLC — комплекс циклодекстрина с холестеролом, SL — соевый лециин, FAAH — гидролаза амидов жирных кислот, NAC — N-ацетилцистеин, AA — аномалии акросом, N — нормальные акросомы. Подчеркнуты концентрации глицерола и желточного белка, которые повышены относительно стандартной базовой среды. Остальные обозначения и подробное описание см. в основном тексте статьи.

сочетании с витамином Е и SPPs (6). Ожидается, что подобное свойство проявляют метанандаимид (metha-anandamide), амидаза (fatty acid amide hydrolase, FAAH, гидролаза амидов жирных кислот) и ω -3 FА (32).

Витамины. В настоящее время считается доказанным, что в качестве добавок к разбавителям спермы витамин Е (31, 33), витамин C (34-38) и витамин B₁₂ (39, 40) повышают сперматологические показатели, предотвращая повреждения половых клеток активными формами кислорода.

Гормоны. Имеются сообщения о связи между гормональным профилем и поврежденностью сперматозоидов (41, 42). В проанализированных нами публикациях мы не нашли исследований по прямому введению гормонов в состав среды для замораживания с целью повышения сохранности сперматозоидов. Исключение составляет одна работа, в которой изучали эффект мелатонина. Было установлено, что добавка мелатонин (1 мМ) достаточно успешно влияет на улучшение общей подвижности, увеличение доли клеток с прямолинейно-поступательным движением, на внутриклеточное содержание АТФ, сохранность ДНК и в особенности на повышение жизнеспособности сперматозоидов. Кроме того, при применении 1 мМ отмечали улучшение развития эмбрионов in vitro (43).

Другие вещества. В качестве альтернативных криопротекторов тестировали и другие вещества и их сочетания с разными концентрациями глицерола в разбавителе с целью повышения эффективности криоконсервации спермы барана (33, 44, 45).

Известно, что Equex — один из детергентов (поверхностно-активных веществ) — способен стабилизировать клеточную мембрану, защищать ее от повреждений и клеточной интоксикации после замораживания и оттаивания спермы. Проведенные исследования показали, что применение Equex STM® (0,75 %) приводит к улучшению сперматологи-ческих показателей (подвижность, жизнеспособность, целостность мембраны) и предотвращению фрагментации ДНК в сравнении с аналогичными параметрами в контрольном образце. Более того, в двух исследованиях при сравнении метилформамида (MF) и этиленгликоля (EG) с глицеролом (G) наблюдали преимущество глицерола по обеспечению выживаемости при замораживании (44) перед добавками MF и EG (33), однако к эффекту глицерола в концентрации 5 % приближалось действие EG в концентрации 3 %. В то же время сочетание 3 % глицерола и комплекса циклодекстрина с холестеролом (cholesterol-loaded cyclodextrin, CLC, 1,5 мг/120½106 сперматозоидов) в среде для разбавления лучше повышало сперматологические показатели по сравнению с другими вариантами совместного применения этих компонентов, несмотря на снижение жизнеспособности под воздействием глицерола (45).

Данные о влиянии разных добавок на замороженно-оттаянную сперму представлены в таблице. Как видно, в большинстве исследований в качестве базового разбавителя использована среда на основе Трисбуфера с яичным желтком и глицеролом. Обращает на себя внимание тот факт, что некоторые результаты очень незначительны, тогда как другие весьма высоки. Не следует игнорировать то обстоятельство, что подобные различия могут зависеть от природы и дозы примененной добавки, вида использованного базового разбавителя (46), а также метода замораживания (47), типа криозащитного агента (33), метода глицеролизации и концентрации глицерола (48), а также особенностей барана и сезона отбора спермы (49, 50).

Таким образом, мы лишь кратко описали те добавки, применение которых связано с положительным эффектом при криоконсервации спермы барана, чувствительной к замораживанию. В современных условиях не вызывает сомнений, что прогресс в технологиях криоконсервации и методах анализа, например оценки кинетических параметров, определения генетических, митохондриальных и мембранных нарушений в сперматозоидах, позволит более существенно продвинуться в изучении воздействия различных добавок на устойчивость семени к замораживанию. В то же время, поскольку эффект антиоксидантов и добавок на свойства оттаянных спермиев неодинаков, выбор таких добавок не может быть случайным. Дизайну эксперимента должна предшествовать детальная проработка многих аспектов действия используемых агентов во избежание нежелательных эффектов при применении криоконсервации, так как механизмы 246

этих процессов и участия в них криозащитных агентов очень сложны. Криоконсервация спермы барана — тонкая процедура, требующая изучения в многофакторных экспериментах. Хотя затраченные усилия уже дали хорошие результаты в лабораторных тестах, метод, обеспечивающий достаточную оплодотворяемость при цервикальном искусственном осеменении, еще не разработан. Необходимо дальнейшее изучения пока что не известных аспектов влияния криозащитных агентов и поиск их сочетаний и доз для установления идеального протокола криоконсервации семени барана. Далее в производственных испытаниях потребуется подтвердить практическую применимость этих добавок, так как следует убедиться, что результаты научных опытов по введению в среду-разбавитель различных веществ, повышающих устойчивость сперматозоидов барана к образованию кристаллов льда при замораживании, могут быть масштабированы в пределах отрасли. Для этого нужно сравнить количество активных сперматозоидов в спермодозе при применении таких добавок, прогнозируемое на основании лабораторных тестов, с данными по частоте зачатий и ягнениям при искусственном осеменении такой спермой.