Криобанки соматических клеток как перспективный способ сохранения генетических ресурсов животных (обзор)

Исследования выполнены при финансовой поддержке Минобрнауки РФ, шифр проекта 2013-1.2-14-5120045-047.

Вымирание некоторых видов млекопитающих необратимо и представляет собой часть естественной эволюции. Однако из-за деятельности человека, приводящей к разрушению среды обитания, неконтролируемого использования охотничье-промысловых ресурсов, конкуренции животных за зоны питания этот процесс происходит гораздо быстрее, чем видообразование (1). Меняющиеся требования рынка и интенсификация сельского хозяйства также усилили тенденцию сокращения биоразнообразия домашних животных. В сельском хозяйстве небольшие производственные системы постепенно сменяются крупными коммерческими структурами. Современные репродуктивные технологии, неограниченные возможности перемещения генетического материала, а также селекционные программы, проводимые национальными и международными компаниями, приводят к доминированию некоторых пород (2). По данным ФАО, примерно 20 % мировых пород крупного рогатого скота, коз, свиней, лошадей и птицы в настоящее время находятся под угрозой исчезновения. Многие породы вымерли в течение последних нескольких лет, в результате чего их генетические характеристики потеряны навсегда (3). В связи с этим в целях обеспечения биобезопасности, а также экологической и продовольственной безопасности крайне важно поддерживать биоразнообразие и сохранять альтернативные и потенциально полезные гены в генофонде (4). Понимание серьезности проблемы привело к тому, что в 2007 году 109 стран утвердили глобальный план сохранения генетических ресурсов животных (Global Plan of Action for Animal Genetic Resources) (5).

В идеале сохранение численности животных должно происходить в in situ, когда она поддерживается в тех условиях среды или системах производства, в которых они были получены. Однако такой подход нуждается в обширной инфраструктуре и управлении и, следовательно, достаточно затратен. Кроме того, он зачастую оказывается недостаточным для распространения малых популяций, а также для поддержания адекватного генетического разнообразия (2). Дополнительным к in situ современным приемом сохранения животных, способным решить перечисленные проблемы, служит создание банков генетических ресурсов (6-8).

Роль банков генетических ресурсов, где собран, обрабатывается и хранится биологический материал, в управлении и сохранении исчезающих видов особенно заметна в последнее десятилетие (9). При правильном использовании резервы банков способны как сохранять текущее генетическое разнообразие популяций, так и обеспечивать их репродукцию с использованием различных биотехнологических методов в будущем (10). Центральная проблема при создании таких банков заключается в определении количества и типа генетического материала. Большинство криобанков фокусирует свое внимание на криоконсервации гамет (в первую очередь спермы) и эмбрионов. Их основная цель состоит в получении потомства с использованием вспомогательных репродуктивных технологий, которые включают в себя искусственное оплодотворение, экстракорпоральное оплодотворение и трансплантацию эмбрионов (11). Однако открытие феномена репрограммирования ядер соматических клеток позволило расширить спектр форм биоматериала в программах по криоконсервации. В настоящее время создание криобанков соматических клеток — доноров ядер для клонирования рассматривается как вспомогательный инструмент сохранения и улучшения генофонда сельскохозяйственных животных и птицы (12).

Метод культивирования и замораживания соматических клеток позволяет получать от одного животного и в последующем сохранять многие 4

годы сотни миллионов клеток, что сравнимо по масштабам с культурами микроорганизмов. Для эффективного культивирования соматических клеток созданы специальные питательные среды достаточно сложного состава, включающие наборы аминокислот, витаминов, сахаров с добавлением сыворотки крови, содержащей многие ростовые факторы. Определены условия культивирования в термостатах с фиксированной концентрацией СО2 в воздухе. Разработаны методы, позволяющие переводить клетки в длительно размножающиеся культуры и обеспечивающие возможность их культивирования в течение десятка пассажей с сохранением нормального кариотипа и всех признаков нормальных клеток (13).

Следует отметить, что в отличие от половых клеток и эмбрионов соматические клетки имеют небольшие размеры и, соответственно, более устойчивы к криоконсервации. История разработки метода исчисляется десятилетиями, в связи с чем мероприятия по созданию банков этих клеток для большинства типов тканей представляют собой рутинную процедуру и сводятся к выделению клеточной массы из исходной ткани животного, ее культивированию, получению первичной культуры, наращиванию нужного количества клеточной массы, ее замораживанию и хранению в жидком азоте (13).

Создание криобанков клеток предусматривает криоконсервацию образцов и их хранение при температуре ниже - 146 ° С. В таких условиях биологический материал почти полностью защищен от химических и физических изменений. Следовательно, он имеет огромный потенциал не только для проведения работ по сохранению генетических ресурсов методом ex situ , но и для исследований методами современной биологии (14). Для создания жизнеспособных криоконсервированных клеточных линий достаточно небольшого количества биопсийного материала, в том числе от умершего животного, но при этом такие линии содержат полный геном и протеом. В отличие от половых клеток и эмбрионов, а также от генеративных тканей криоконсервированные соматические клетки после многократного размораживания способны к регенерации, то есть могут практически бесконечно служить источником биоматериала как для использования во вспомогательных репродуктивных технологиях, так и для биологических исследований, в том числе ретроспективных (9, 15).

Наглядной демонстрацией роли криобанков в сохранении генетических ресурсов домашних и диких животных служат результаты деятельности международного консорциума Frozen Ark (16), его участников — зоопарка Сан-Диего (Калифорния, США) (17) и лаборатории по сохранению исчезающих видов LaCONES (Индия), а также банка генетических ресурсов Сеульского национального университета (Южная Корея) (10). Работа по сохранению генетических ресурсов через создание банков соматических клеток и тканей также активно проводится в рамках национальных программ такими странами, как Канада, Бразилия, Китай, Германия, Польша, Испания и Турция (10, 15, 18-23). Заслуживают внимания результаты реализации проекта по использованию банков соматических клеток и технологии клонирования для сохранения аборигенных анатолийских пород домашних животных (23).

Сущность клонирования заключается в удалении ядра из зрелого ооцита и введении ядра донорской соматической клетки. После пересадки донорское ядро подвергается эпигенетическому репрограммированию под влиянием ряда факторов, локализованных в ооплазме, что позволяет дифференцированному донорскому ядру стать активным и начать свое развитие не как соматическая клетка, а как одноклеточный эмбрион (24).

Идея клонирования была высказана Гансом Шпеманом (H. Spe-mann), который продемонстрировал, что у саламандр ядра клеток до 16клеточной стадии обладают плюриопотентными свойствами (25). Пересадки ядер у млекопитающих начались позднее, в 1980-х годах. Это было связано с техническими трудностями, так как зигота млекопитающих имеет небольшие размеры, что затрудняло проведение манипуляций. Тем не менее, первые сообщения о получении клонов мышей, идентичных донору, появились уже в 1981 году . В 1986 году о первой успешной ядерной передаче у овцы сообщил S.M. Willadsen (26). Клонированная им овца была произведена микрохирургической энуклеацией ооцитов на стадии метафазы MII и их последующим слиянием с 8- и 16-клеточными бластомерами. После успехов клонирования с ранними эмбриональными бластомерами были предприняты попытки клонирования животных из культивируемых клеток. В 1996 году в Шотландском университете K.H.S. Campbell c соавт. (27) использовали в качестве доноров ядер клетки, которые были получены из внутренней клеточной массы бластоцисты. Это исследование закончилось рождением двух ягнят — Меган (Mеgan) и Мораг (Morag) и стало решающим шагом к получению клонов с использованием соматических клеток взрослого животного.

Первое клонированное потомство методом переноса ядер соматических клеток млекопитающих осуществлено в том же университете в 1997 году (28). Рождение овцы Долли (Dolly) вызвало огромный научный интерес и способствовало в дальнейшем большому количеству исследований в направлении получения клонированного потомства с использованием соматических клеток и у других видов животных.

За последние годы с использованием дифференцированных соматических клеток были получены особи разных видов млекопитающих, включая домашних и диких животных (28-49) (табл.).

Получение первого клонированного потомства у различных видов животных
Год	|       Вид животного	|             Авторы и страна
1997	Овцы	A.E. Schnieke с соавт. (Великобритания) (28)
1998	Мыши	T. Wakayama с соавт. (США) (29)
1998	Коровы	J.B. Cibelli с соавт. (Новая Зеландия) (30)
1999	Козы	A. Baguisi с соавт. (Япония) (31)
2000	Свиньи	I.A. Polejaeva с соавт. (Великобритания) (32)
2000	Гуар	R.P. Lanza (США) (33)
2001	Муфлон	P. Loi с соавт. (Италия) (34)
2002	Домашняя кошка	T. Shin с соавт. (США) (35)
2002	Кролики	P. Chesne (Китай) (36)
2003	Мул	G.L. Woods с соавт. (США) (37)
2003	Лошадь	C. Galli с соавт. (Италия) (38)
2003	Крыса	Q. Zhou с соавт. (Франция, Китай) (39)
2004	Дикая кошка	M.C. Gomes с соавт. (США) (40)
2005	Собака	B.C. Lee с соавт. (Корея) (41)
2005	Бантенг	M.J. Sansinena с соавт. (США) (42)
2006	Хорек	Z. Li с соавт. (Китай, США, Франция) (43)
2007	Волк	M.K. Kim с соавт. (Корея) (44)
2007	Буйвол	D. Shi с соавт. (Китай) (45)
2007	Благородный олень	D.K. Berg с соавт. (Новая Зеландия) (46)
2009	Горный козел	J. Folch с соавт. (Испания) (47)
2010	Верблюд	N.A. Wani с соавт. (ОАЭ) (48)
2012	Койот	I. Hwang с соавт. (Корея) (49)

Для производства клонированных животных можно использовать практически любые типы клеток (12). Имеются данные о применении для этого эмбриональных клеток (50), клеток молочной железы, кумулюса, гранулезы, яйцевода, печени (29, 51-55), фибробластов (56), лейкоцитов

(57) и эмбриональных стволовых клеток (58), но эффективность клонирования при этом существенно зависит от типа клеток. Наиболее результативным с точки зрения эмбрионального развития и рождения живого потомства является клонирование с использованием в качестве доноров ядерного материала фетальных фибробластов. Указанный тип клеток характеризуется низким уровнем мутаций и высокой пролиферативной активностью (12). Однако при создании банка соматических клеток с целью сохранения генетических ресурсов животных не всегда есть возможность и целесообразность получения фетального материала, и источником клеток тогда служат ткани взрослого животного. Соматические клетки взрослого животного получают чаще всего из кожи, мышц и хрящевой ткани. Их можно выделять как из свежей ткани, хранившейся не более 2 нед при +4 ° С, так и замороженного материала (59). К недостаткам выделяемых из таких тканей клеток следует отнести их более низкую по сравнению с фетальными фибробластами потенцию к репрограммированию и последующему эмбриональному развитию (60-61).

Результаты последних лет показывают, что альтернативным источником ядер при клонировании могут быть стволовые клетки. Этот тип клеток присутствует в каждом органе взрослого животного, обеспечивая поддержание структурного и функционального гомеостаза. Стволовые клетки претерпевают больше циклов репликации и имеют большую пластичность, чем полностью дифференцированные соматические клетки (62). Исследования, проводимые с использованием нейральных стволовых клеток мышей, продемонстрировали, что полностью репрограммировать ядро стволовой или прогениторной клетки (то есть стволовой, детерминированной на дифференцировку в определенный тип клеток) легче, чем терминально дифференцированной, также показано, что при использовании в качестве кариопласта ядер стволовых клеток значительно увеличивается число получаемых клонированных эмбрионов (63). В настоящее время наиболее привлекательным источником ядер для клонирования считаются мезенхимные стволовые клетки (64-66).

Технология клонирования с использованием клеток взрослых индивидуумов значительно расширяет спектр ее применения в программах по сохранению генетических ресурсов животных и птиц, а также в селекции. Клонирование взрослых животных позволит вместо генетической селекции осуществлять фенотипическую селекцию. Хромосомная комбинация генов при клонировании остается неизменной, что означает возможность использования не только аддитивного их действия. В стандартизированной окружающей среде, которая может достигаться в хозяйствах с хорошей системой управления, продуктивность клонов должна различаться только в пределах остающейся природной изменчивости и обусловленной технологией клонирования митохондриальной генетической изменчивости. Это позволит достигнуть уровня продуктивности лучших животных внутри одного стада уже в течение одной генерации. Особое значение в этом аспекте приобретает отбор животных с высокой пожизненной продуктивностью (22).

Несмотря на то, что в последние годы в области клонирования достигнуты определенные успехи, эффективность технологии остается крайне низкой, высока частота аномального эмбрионального развития, а рожденное потомство менее жизнеспособно (67, 68). Лидером по клонированию пока остается крупный рогатый скот, результативность рождения потомства у которого в среднем составляет 10, а в ряде случаев 25 %. Для большинства же других животных этот показатель чаще всего не превыша- ет 1 %. Создавая банки соматических клеток и тканей сегодня, человек таким образом сохраняет биологический материал для применения соматического клонирования в будущем, когда эффективность этой технологии возрастет (69).

Одно из направлений в области клонирования — поиск универсального цитопласта для переноса ядер соматических клеток. Эти исследования стали актуальны в первую очередь в рамках программ по сохранению генетического материала диких животных. Получение аутогенных цитопластов у последних по известным причинам невозможно или затруднено. Ооциты, используемые для межвидового клонирования должны отвечать определенным требованиям. Важно, чтобы получение цитопласта не было дорогим и сложным, а также чтобы ооцит имел способность к репрограммированию соматических клеток других видов и поддержанию эмбрионального развития межвидовых цитогибридов.

В 1999 году T. Dominko с соавт. (70) впервые показали, что цитоплазма ооцитов крупного рогатого скота способна репрограммировать ядра соматических клеток других животных. После переноса в энуклеированный на стадии MII ооцит крупного рогатого скота ядер из клеток кожи овец, свиней, обезьян и крыс происходило объединение цитопласта и ксеногенного кариопласта. В последующем ооциты крупного рогатого скота использовались в качестве цитопласта при переносе ядер соматических клеток свиней (71), коалы (72), антилопы, тура (73), лошадей (74), черного медведя (75), горной антилопы (76), кур (77), яка и собаки (78), а также бизона (79). Причиной, по которой ооциты крупного рогатого скота оказались универсальной моделью для биотехнологических исследований (и в частности, для межвидового клонирования), стала дешевизна их получения (яичники животных после убоя) и простота подготовки (культивирование in vitro обеспечивает до 90 % созревания ооцитов). Более того, технология, разработанная для культивирования ооцитов и эмбрионов указанного вида животных, в настоящее время считается самой совершенной.

В 2000 году ученые из штата Айова (США) получили первого клонированного индийского бизона гаура, находящегося на грани вымирания. Ядра фибробластов взрослого самца гаура были введены в энуклеированные ооциты коров. Полученные таким способом 44 эмбриона после культивирования in vitro трансплантировали 32 коровам. У одной из них родился живой теленок гаура (33).

Ярким примером использования межвидового клонирования служит работа по сохранению бантенга ( Bos javanicus ) — животного из отряда парнокопытных. Его численность уменьшилась на 85 % в течение последних 15-20 лет. В 2003 году в США были предприняты мероприятия по сохранению этого редкого вида. Отсутствие аутогенных ооцитов также делало невозможным внутривидовую трансплантацию ядер соматических клеток. Поэтому были использованы ооциты коров, в которые пересаживались ядра фибробластов из кожи взрослого животного (самки и самца). Генный материал для клонирования был получен из Центра воспроизводства вымирающих животных зоопарка Сан-Диего (the San Diego Zoo’s Center for Reproduction of Endangered Species — CRES), где сохраняются генетические ткани исчезающих животных. После пересадки суррогатным коровам 30 бластоцист родились два теленка (42).

Интересные результаты были достигнуты на домашней овце и ее диких родственниках, прежде всего на европейском муфлоне. Ядра соматических клеток взрослой самки муфлона, найденной мертвой на пастбище, были введены в энуклеированные ооциты домашней овцы, затем за-8

родыши трансплантировали овцам-реципиентам и получили живое потомство. В работе, проведенной в 2001 году (34), удалось успешно применить метод репродуктивного клонирования к исчезающему виду Ovis orientalis , причем источником генетического материала были мертвые самки, а эффективность процедуры оказалась намного выше, чем при создании знаменитой Dolly.

В Испании в 2009 году родился клонированный детеныш вымершего подвида пиренейского горного козла букардо (испанский козерог Capra pyrenaica pyrenaica ). Исследователи переносили соматические клетки букардо в энуклеированные ооциты домашней козы. Подсаживали полученные эмбрионы суррогатным матерям — самкам других подвидов испанского козла или гибридных видов, полученных скрещиванием домашних и диких коз. В результате эксперимента было создано 439 эмбрионов, 57 из которых имплантировали в суррогатные матки. Одна коза родила самку букардо, умершую через 7 мин после рождения от проблем с дыхательной системой (47).

Перечисленные выше возможности клонирования базируются на потенциале, который описанная технология может предложить в настоящее время. При этом следует подчеркнуть, что пока еще до конца не ясно, будет ли клонирование с использованием клеток взрослых организмов в ближайшем будущем оптимизировано таким образом, что соотношение между затратами на его осуществление и результативность окажется приемлемым.

Таким образом, создание криобанков соматических клеток — доноров ядер для клонирования рассматривается как вспомогательный инструмент сохранения и улучшения генофонда сельскохозяйственных животных и птицы. В отличие от половых клеток и эмбрионов, а также от генеративных тканей криоконсервированные соматические клетки после многократного размораживания способны к регенерации, то есть могут практически бесконечно служить источником биоматериала как для использования во вспомогательных репродуктивных технологиях, так и для биологических исследований, в том числе ретроспективных. Кроме того, из-за небольшого размера соматические клетки более устойчивы к криоконсервации. Для производства клонированных животных можно использовать практически любые клетки, но эффективность клонирования существенно зависит от их типа. Наиболее результативно с точки зрения эмбрионального развития и рождения живого потомства клонирование с использованием фетальных фибробластов в качестве доноров ядерного материала. Альтернативным источником ядер при клонировании могут быть стволовые клетки. С применением клонирования были получены домашние и дикие животные разных видов: овцы, мыши, коровы, козы, свиньи, гуар, муфлон, домашняя кошка, кролики, мул, лошадь, крыса, дикая кошка, собака, бантенг, хорек, волк, буйвол, благородный олень, горный козел, верблюд, койот. Лидером по клонированию пока остается крупный рогатый скот, результативность рождения потомства у которого в среднем составляет 10, а в ряде случаев 25 %. Для большинства других животных этот показатель пока что не превышает 1 %. На практике с помощью клонирования животных с высокой продуктивностью можно достигнуть уровня продуктивности лучших животных внутри одного стада уже в течение одной генерации. Перспективы практического применения клонирования, в том числе с использованием крио-консервированного материала, зависят в значительной степени от того, окажется ли соотношение между затратами на его осуществление и результативность экономически приемлемым.

CRYOBANKING OF SOMATIC CELLS IN CONSERVATION OF ANIMAL GENETIC RESOURCES: PROSPECTS AND SUCCESSES

(review)

G.N. Singina, N.A. Volkova, V.A. Bagirov, N.A. Zinovieva