Научные статьи \ Математика. Естественные науки \ Биологические науки в целом \ Микробиология \ Общая микробиология

Культивируемые органотрофные бактерии, изолированные из воды реки Селенги

Автор: Дагурова О.П., Зайцева С.В., Замбалаев А.В.

Журнал: Природа Внутренней Азии @nature-inner-asia

Статья в выпуске: 1 (30), 2025 года.

Бесплатный доступ

Из воды реки Селенги выделено 18 чистых культур органотрофных бактерий, определена таксономическая принадлежность 13 культур с помощью спектроскопии MALDI-TOF. Штаммы были отнесены к видам Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syringae complex, Bacillus altitudinis/pumilus и Bacillus cereus. Все штаммы были каталазоположительны, большинство было способно к потреблению крахмала, некоторые могли потреблять углеводороды и фенол. Культуры утилизировали широкий спектр сахаров, спиртов и органических кислот, что может свидетельствовать об их адаптационном потенциале. Полученные данные расширяют представления о культивируемых бактериях речных экосистем.

Еще

Река селенга, чистые культуры, штаммы, бактерии, микроорганизмы, экосистема

Короткий адрес: https://sciup.org/148331742

IDR: 148331742 | УДК: 579.26 | DOI: 10.18101/2542-0623-2025-1-31-41

Текст научной статьи Культивируемые органотрофные бактерии, изолированные из воды реки Селенги

Изучение бактерий в водных экосистемах имеет огромное значение для решения проблем, важных для человечества: понимание и контроль процессов круговорота вещества в экосистеме, сохранение здоровья человека, безопасное водоснабжение, индикация качества воды, развитие экобиотехнологий.

Микроорганизмы в пресных водных экосистемах главным образом отвечают за процесс деструкции органического вещества, который осуществляется группой органотрофных бактерий. Это широкая эколого-трофическая группа, разнообразная по составу, которая осуществляет разложение различных органических соединений, обеспечивая самоочищение водоема. Для изучения свойств бактерий необходимо выделение чистых культур бактерий и изучение их свойств.

Река Селенга — наиболее крупный приток озера Байкал, обеспечивающий до половины всей воды, поступающей в озеро, внесенное в список объектов Всемирного наследия ЮНЕСКО. На российском участке реки Селенги ранее исследователями определялась численность органотрофных бактерий [Бархутова и др., 1998; Ковадло, Дрюккер, 2010; Дагурова и др., 2024]. Культуры органотрофных бактерий выделялись из дельты реки Селенги и придельтовых районов озера Байкал [Бархутова и др., 1998; Парфенова и др., 2006; Белых и др., 2013; Дагурова и др., 2018]. Выделение и изучение органотрофных бактерий из реки Селенги ранее не проводилось. Целями данной работы являются выделение, идентификация и описание чистых культур бактерий из воды реки Селенги.

Объекты и методы исследования

Пробы воды для выделения бактерий были отобраны в июне 2023 г. на российском участке реки Селенги. Два участка расположены на юге Республики Бурятия, остальные пробы отобраны около г. Улан-Удэ. Пробы воды помещали в стерильные емкости и хранили до выделения при температуре 4 ˚С.

Из проб воды готовили ряд последовательных десятикратных разведений в стерильной водопроводной воде. Посев материала проводили в чашках Петри глубинным методом на среду ГРМ (питательная среда на основе гидролизата рыбной муки) и богатую среду LB (лизогенная среда с триптоном). Культивирование осуществлялось в термостате при температуре 22 °С. Чистые культуры получали путем пересева изолированных колоний в чашки Петри со средой ГРМ методом истощающего штриха. Чистоту культур контролировали визуально и микроскопически. Морфологические свойства выделенных культур изучали микроскопированием фиксированных мазков, окрашенных по Граму, с помощью микроскопа Аxiostarplus (Carl Zeiss, Германия) при увеличении в 1 000 раз.

Идентификация выделенных чистых культур микроорганизмов проводилась с помощью времяпролетной матрично-активированной лазерной десорбционной/ ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF в бактериологической лаборатории ГАУЗ «РК БСМП им. В. В. Ангапова» на приборе VITEK MS-DS путем сравнения полученных масс-спектров с базой данных. Идентификация бактерий MALDI-TOF является точным и экономически эффективным методом для быстрой таксономической идентификации [Emami et al., 2015].

Проверку способности штаммов к утилизации углеводородов и фенола проводили методом лунок в агаризованной среде Диановой-Ворошиловой, а также в жидкой среде Диановой-Ворошиловой [Практикум... 2005]. Все посевы выполняли в двух повторностях. Наличие роста в жидкой среде определяли, сравнивая с контролем, по помутнению среды или образованию бактериальной пленки.

Способность к потреблению спектра углеводов, органических спиртов и органических кислот определяли по наличию/отсутствию роста в жидкой среде. В качестве минеральной основы готовили среду Пфеннига следующего состава (г/л дистиллированной воды): KH2PO4 — 0,33; NH4C1 — 0,33; CaC12 — 0,33; MgC12 — 0,33; дрожжевой экстракт — 0,15. К среде в качестве субстрата добавляли 10 %-ные растворы органических веществ до концентрации 1%. Посевной материал суспендировали петлей, хорошо перемешивали. Культивирование проводили в пробирках с ватными пробками при 30 °С в течение 5 дней. Наличие роста в жидкой среде определяли, сравнивая с контролем, по помутнению среды или образованию бактериальной пленки.

Амилолитическая активность была определена путем посева культур штрихом в чашки Петри с агаризованной средой Пфеннига с добавлением крахмала в количестве 1,5 %. Инкубировали в термостате при температуре 30 °С в течение 7 суток. После инкубации на поверхность агара добавляли раствор Люголя. Положительный результат определяли визуально по зонам просветления на агаре.

Каталазную активность штаммов определяли по выделению пузырьков при воздействии 3 %-ного Н2О2 на суточную культуру бактерий.

Результаты и обсуждение

Из различных точек отбора на российском участке реки Селенги было выделено 18 аэробных органотрофных штаммов бактерий. В чистую культуру были выделены типы колоний, численно преобладающие в чашках и доминирующие в условиях роста на данных питательных средах.

Выросшие на используемых средах колонии бактерий внешне не отличались разнообразием. Морфологическое описание колоний и клеток культур представлено в таблице 1. У 17 культур клетки имели палочковидную форму, у одной культуры — кокковидную. Клетки большинства выделенных штаммов окрашивались по Граму отрицательно (10 культур). К грамположительным бактериям отнесено 8 культур.

Морфологическое описание выделенных штаммов органотрофных бактерий из р. Селенга

Таблица 1

№	Штамм	Среда выделения	Описание колоний на твердой среде	d, мм	Форма клеток, окраска по Граму
1	С1	ГРМ	Белая, округлая, поверхность гладкая, глянцевая, с ровными краями, непрозрачная, с поверхности агара	3	Короткие палочки, Гр^-
2	С4	ГРМ	Белая, форма округлая, поверхность шероховатая, с ризоидным краем	10	Палочки, Гр^-
3	С5	ГРМ	Белая, из толщи агара	1	Изогнутые короткие палочки, Гр⁺

Продолжение табл. 1

№	Штамм	Среда выделения	Описание колоний на твердой среде	d, мм	Форма клеток, окраска по Граму
4	С6	ГРМ	Белая, форма округлая, поверхность гладкая, глянцевая, с ровным краем	4	Изогнутые короткие палочки, Гр⁺
5	С7	ГРМ	Кремовая, форма округлая, поверхность гладкая, с ризоидным краем	11	Палочки, Гр⁺
6	С8	ГРМ	Белая, форма округлая, поверхность гладкая, глянцевая, с ровным краем	8	Палочки, Гр-
7	С9	ГРМ	Желтоватая, форма округлая, поверхность гладкая, с ровным краем	4	Палочки, Гр-
8	С10	ГРМ	Белая, форма округлая, поверхность гладкая, глянцевая, с ровным краем	4	Кокки, Гр⁺
9	С12	ГРМ	Белая, форма овальная, поверхность гладкая, глянцевая	13	Палочки, Гр^-
10	С13	ГРМ	Белая, форма округлая, поверхность гладкая, глянцевая, с ровным краем	8	Палочки, Гр⁺
11	С14	ГРМ	Белая с желтоватым оттенком, форма округлая, поверхность гладкая, блестящая	10	Палочки, Гр-
12	С15	ГРМ	Белая, форма округлая, поверхность гладкая, с ровным краем	5	Палочки, Гр+
13	С16	ГРМ	Белая, из толщи агара	1	Палочки, Гр-
14	С17	ГРМ	Кремовая, форма округлая, поверхность гладкая, с ровным краем	10	Палочки, Гр-
15	С18	ГРМ	Белая, полупрозрачная, из глубины агара	5	Палочки, Гр-
16	С19	LB	Белая, ризоидная, нитевидная	10	Крупные палочки, спорообразующие, Гр⁺
17	С20	LB	Белая, ризоидная, нитевидная	10	Крупные палочки, спорообразующие, Гр⁺
18	С21	LB	Белая, форма округлая, поверхность гладкая, с ровным краем	5	Палочки, Гр^-

Была проведена идентификация культур методом MALDI-TOF. Определена видовая принадлежность 13 штаммов, 5 штаммов не удалось определить (табл. 2).

Все штаммы были отнесены к двум родам — Pseudomonas (семейство Pseudo-monadaceae класса Gammaproteo bacteria) и Bacillus (семейство Bacillaceae филума Bacillota, или по старой классификации Firmicutes). Определено 3 вида рода Pseudomonas — Pseudomonas fluorescens (4 штамма) и Pseudomonas syringae comp lex (6 штаммов); 2 вида рода Bacillus — Bacillus altitudinis/pumilus (1 штамм) и Bacillus cereus (2 штамма). Выделенные бактерии являются представителями класса Gammaproteo bacteria и филума Firmicutes, групп, широко распространенных в микробных сообществах пресных экосистем [Newton et al., 2011].

Таблица 2

Видовая принадлежность штаммов бактерий, выделенных из р. Селенга

№	Штамм	Результат идентификации
	С4	Bacillus altitudinis/pumilus
	С7	Pseudomonas fluorescens
	С8	Pseudomonas fluorescens
	С9	Pseudomonas syringae complex
	С12	Pseudomonas fluorescens
	С13	Pseudomonas syringae complex
	С14	Pseudomonas syringae complex
	С16	Pseudomonas fluorescens
	С17	Pseudomonas syringae complex
	С18	Pseudomonas syringae complex
	С19	Bacillus cereus
	С20	Bacillus cereus
	С21	Pseudomonas syringae complex

Представители рода Pseudomonas демонстрируют большое метаболическое разнообразие и способны развиваться в различных экологических нишах, широко распространены в природных водах (рис. 1). Установлено, что они всегда присутствуют среди культивируемых гетеротрофных бактерий, выделяемых в чистые культуры из различных биотопов озера Байкал (вода, осадки, биопленки), дельты Селенги и Селенгинского мелководья [Павлова и др., 2003, Парфенова и др., 2006, Белых и др., 2013; Белькова и др., 2018, Дагурова и др., 2018]. Показано, что бактерии рода Pseudomonas доминировали в культивируемом сообществе, в основном в чистых районах акватории озера Байкал, не подверженных влиянию антропогенных факторов [Павлова и др., 2003]. Среди культивируемых органотрофных бактерий в сообществе воды озера Байкал доля псевдомонад достигает 88,6 %, что позволяет их считать доминирующими в культивируемом сообществе озера Байкал и дельты р. Селенги [Парфенова и др., 2006]. Возможно, это связано с их высокой приспособляемостью и способностью к культивированию на различных питательных средах. Вид Pseudomonas fluorescens был выделен из различных биотопов озера Байкал и других водных экосистем, вид Pseudomonas syringae относится к фитопатогенным бактериям. Он повсеместно распространен в большинстве наземных и водных экосистем, в том числе в реках и озерах [Morris et al., 2008; Pietsch et al., 2017]. Рассматривается вопрос о реках и озерах как источников инокулята для вспышек болезней растений, вызываемых P. syringae [Pietsch et al., 2017]. Некоторые штаммы P. syringae обладают активностью нуклеации льда (INA), что позволяет бактериям катализировать замерзание воды, влияя на круговорот воды и климат, обуславливает их важную роль в гидросфере.

Рис. 1. Штамм С7 ( Pseudomonas fluorescens ): (А) рост на плотной среде; (Б) окрашенные по Граму клетки под микроскопом (Гр^-)

Грамположительные спорообразующие бактерии рода Bacillus широко распространены в природе, выделенные нами виды Bacillus altitudinis / pumilus и Bacillus cereus ранее выделялись из воды и осадков озера Байкал и дельты р. Селенги [Парфенова и др., 2005; Суслова, 2007] (рис. 2). Было показано большое количество бактерий рода Bacillus в устье р. Селенги по сравнению с водами оз. Байкал. Бактерии рода Bacillus составляли значительную часть культивируемого сообщества, обладали разнообразной ферментативной активностью, были способны к деградации полициклических углеводородов [Суслова, 2007].

Определение амилолитической активности показало, что половина выделенных штаммов была способна к расщеплению крахмала амилазой (табл. 3). Амилолитическую активность показали 9 из 18 выделенных штаммов. Наибольшую активность показали штаммы С4 и С18.

Каталаза — широко распространенный фермент, она содержится почти во всех аэробных и факультативно-анаэробных бактериях. Функция каталазы заключается в защите организма от активных кислородсодержащих радикалов и пероксида водорода. Культуры были проверены на каталазную активность, все относятся к каталазоположительным.

Таблица 3

№	Штамм	Зона просветления (см)	Интенсивность роста
	С1	0	нет роста
	С4	5,0	интенсивный рост
	С5	0	нет роста
	С6	0	нет роста
	С7	0	нет роста
	С8	0	нет роста
	С9	2,5	умеренный рост
	С10	0	нет роста
	С12	0,5	слабый рост
	С13	0,5	слабый рост
	С14	0,8	умеренный рост
	С15	0	нет роста
	С16	0,5	слабый рост
	С17	0,2	слабый рост
	С18	12,0	интенсивный рост
	С19	0,5	слабый рост
	С20	0	нет роста
	С21	0	нет роста

Штаммы были проверены на способность к утилизации углеводородов и фенола (табл. 4). Предположительная способность к потреблению углеводородов была обнаружена у 8 из 18 проверенных штаммов. Фенол в основном подавлял рост штаммов, но очень слабый рост в жидкой среде присутствовал у 2 штаммов. Способность разлагать оба поллютанта была присуща штамму С15, таксономическую принадлежность которого не удалось определить, и штамму С21, относящемуся к виду Pseudomonas syringae complex .

Разложение углеводородов и фенола штаммами бактерий, выделенными из реки Селенги

Таблица 4

№	Штамм	Контроль	Фенол		Углеводороды
№	Штамм	Контроль	плотная среда	жидкая среда	плотная среда	жидкая среда
	С1	+	-	-	+	-
	С4	++	-	-	++	+
	С5	+++	-	-	++	-
	С6	++	-	-	++	+
	С7	+	+	-	-	-
	С8	++	-	-	++	+
	С9	+	-	-	-	-
	С10	+	+	-	+	-
	С12	+++	-	-	++	+
	С13	+++	+	-	+	-
	С14	+++	-	-	++	-
	С15	+++	+	+	++	+
	С16	++	-	-	-	-
	С17	++	-	-	+	-
	С18	++	-	-	+	+
	С19	++	+	-	++	-
	С20	++	+	-	++	+
	С21	++	+	+	+	+

«+++» интенсивный рост, «++» умеренный рост, «+» слабый рост, «-» нет роста

Для определения способности к потреблению спектра углеводов, органических спиртов и органических кислот было отобрано 5 штаммов, показавших активный рост на плотной среде (табл. 5).

Изученные штаммы благодаря наличию широкого ферментного спектра могут потреблять все представленные субстраты. Исключение составляли штамм С4, который не потреблял рамнозу, и штамм С20, который не потреблял рафинозу.

Таблица 5

Субстрат	S -Й ^ Л тГ ^ "В	8 § а ОО		О	о О
Глюкоза	+	+	+	+, осадок	+
Лактоза	+	+	+	+, осадок	+
Фруктоза	+	+	+	++	+
Ксилоза	+	+	+	+	+
Рамноза	-	+	+	+	+
Сахароза	+	++	+	++	+
Целлюлоза	+	+	+	++	+
Мальтоза	+	++	+	+	+
Галактоза	+	+	+	++	+
Рафиноза	+	+	+	+	-
Этанол	+	+	+	+	+
Дульцит	+	+	+	+	+
Глицерин	+	+	+	++	+
Сорбит	+	+	++	+	+
Маннит	++	++	++	+	+
Пируват	+++	+	+	+	+
Цитрат	+, пленка	+	+	+	+
Лактат	++	++	++	+	+
Сукцинат	+	++	++	+	++
Твин	++	++	++	+	+

«++» умеренный рост, «+» слабый рост, «-» нет роста

Способность к потреблению спектра углеводов, органических спиртов и органических кислот

Заключение

Таким образом, из воды реки Селенги выделено 18 чистых культур органотроф-ных бактерий, определена таксономическая принадлежность 13 культур. Штаммы были отнесены к видам Pseudomonas fluorescens (4 штамма), Pseudomonas syrin-gae complex (6 штаммов), Bacillus altitudinis / pumilus (1 штамм) и Bacillus cereus (2 штамма). Они относятся к наиболее часто выделяемым группам бактерий. Все штаммы были каталазоположительны, большинство было способно к потреблению крахмала. Была проверена их способность к потреблению углеводородов и фенола: 8 из 18 штаммов могли использовать углеводороды, 2 штамма — фенол. Культуры были способны утилизировать широкий спектр сахаров, спиртов и органических кислот, что может свидетельствовать об их адаптационном потенциале.

Полученные данные расширяют представления о культивируемых бактериях реки Селенги и их свойствах. Дальнейшие исследования позволят более подробно изучить выделенные штаммы и оценить их биотехнологический потенциал.