Лазерная проточная цитометрия в лабораторном иммунологическом мониторинге эндопротезирования коленного и тазобедренного суставов

Несмотря на значительные успехи современной ортопедии, повреждения и заболевания крупных суставов до настоящего времени остаются одной из наиболее значимых проблем медицины и общества. Методом выбора при лечении поздних стадий коксартроза и го-нартроза является эндопротезирование, относящееся к числу высокоэффективных лечебно-реабилитационных технологий. Имплантацией искусственных суставов занимаются сотни клиник и исследовательских центров. В России потребность в эндопротезировании только тазобедренного сустава по предварительным расчетам составляет до 300 000 хирургических вмешательств в год. В то же время, операции по имплантации искусственного сустава по-прежнему относятся к высокой категории сложности и требуют длительной реабилитации. При остеоартрозе крупных суставов существует определенный порочный круг. С одной стороны, стойкий иммунологический дисбаланс способствует дальнейшему развитию дегенеративно-дистрофических изменений в тканях пораженного сустава и поддержанию вторичного синовита, с другой — прогрессирование патологии и нарастание в связи с этим компенсаторных реакций истощают метаболический фон и адаптационные механизмы [4]. Операционная травма способна провоци- ровать патологические иммунные реакции в организме, усугубляя уже имеющиеся нарушения, что, в свою очередь, способствует развитию послеоперационных осложнений, поэтому при подготовке больного к операции необходимо учитывать состояние системы иммунитета [1, 3]. При современном оснащении лабораторий большинства крупных больниц, в которых выполняется эндопротезирование, иммунологическое обследование пациентов вполне осуществимо, а прогностическая значимость полностью оправдывает все расходы и трудозатраты на его проведение [2, 5, 6]. Исследование показателей клеточного иммунитета на различных этапах реабилитационного периода после эндопротезирования крупных суставов позволяет прогнозировать как благоприятное течение послеоперационного периода, так и развитие послеоперационных осложнений [7, 8].

Стрессовое ремоделирование («stress shielding») — реакция костной ткани на имплантат, проявляющаяся усилением интенсивности процессов резорбции и костеобразования, рассматривается как процесс адаптации к новым условиям. Это изменение интенсивности ремоделирования с одной стороны имеет своей целью увеличение массы кости для создания тесного контакта с имплантатом, с другой — становится причиной развития нестабильности и ограничивает «срок жизни» эндопротеза. Некоторые авторы указывают на связь асептической нестабильности эндопротеза с наличием персистирующей микрофлоры в зоне имплантации. В частности, методом полимеразной цепной реакции доказано, что % протезов, удаленных при ревизии, инфицированы, тогда как традиционными методами выявляют менее 10 % инфицированных имплантатов. Определение среди больных с нестабильными эндопротезами группы риска в плане развития вялотекущего гнойно — воспалительного процесса в зоне имплантации искус- ственного сустава позволяет изменить тактику хирургического лечения: вместо одноэтапного ревизионного эндопротезирования выполнять двухэтапное ревизионное эндопротезирование с санацией зоны имплантации и установкой цементного спейсера с антибиотиком.

Цель исследования — разработка алгоритма иммунологического обследования пациентов с гонартрозом и коксартрозом до и после имплантации искусственного сустава, позволяющая сократить сроки реабилитации тяжелой группы больных путем снижения возможных ошибок в выборе тактики хирургического лечения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Основу исследования составил анализ показателей иммунного статуса 109 больных остеоартрозом коленного и тазобедренного суставов III стадии в возрасте от 40 до 73 лет. Длительность заболевания варьировала от 5 до 35 лет. Для имплантации цементных протезов использовался костный цемент марки «Pоlacos-R».

Распределение больных по видам имплантированных цементных и бесцементных эндопротезов представлено в таблице 1.

Состояние клеточного иммунитета изучали посредством типирования лимфоцитов периферической крови методом лазерной проточной цитометрии на цитометре «BECKMAN COULTER EPICS XL» (США). Для идентификации лимфоцитов и определения их субпопуляционного состава применялся набор моноклональных антител (МКАТ) компании «Immunotech» (Франция). Т-лимфоциты (CD3+),

Т-хелперы (CD3⁺CD4⁺), цитотоксические Т-лимфоциты (CD3 + CD8 + ), В-лимфоциты (CD3 - CD19 + ), естественные киллеры (CD3 - CD16 + CD56 + ), естественные киллеры / Т-лимфоциты (CD3⁺CD16⁺CD56⁺), CD3⁺CD25⁺, несущие маркеры ранней активации Т-лимфоцитов, CD3⁺HLA-DR, несущие маркеры поздней активации Т-лимфоцитов, идентифицировали с помощью МКАТ, меченых фикоэритрином (РЕ) и флуоресцинизотиоци-анатом (FITC). Забор крови для исследования производится в количестве 6 мл из локтевой вены, натощак.

Полученные данные обрабатывались с помощью методов непараметрической статистики с использованием U-критерия Вилкоксона с применением программного обеспечения AtteStat 1.0, выполненного как надстройка к «Microsoft Exсel» программного продукта «Microsoft Office». Результаты исследования были представлены в виде медиан и интерквартильных размахов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Первичное обследование больного проводилось до хирургического вмешательства. Полученные данные на последующих этапах исследования использовались в качестве контрольных.

Через 5-7 суток после имплантации выявлялись изменения, обусловленные массивным повреждением суставных и околосуставных тканей, внедрением инородных тел (имплантат, костный цемент). Для благоприятного течения послеоперационного периода было характерно умеренное снижение абсолютного количества лимфоцитов, повышение относительного и абсолютного числа В-лимфоцитов (CD3 - CD19 + ), уменьшение относительного количества естественных киллеров (CD3^-CD56⁺CD16⁺) и естественных киллеров / Т-лимфоцитов (CD3⁺CD56⁺CD16⁺) (не более чем на 30 %).

При отсутствии осложнений инфекционного характера исследуемые показатели через 18-21 сутки после эндопротезирования возвращались к исходным значениям, что позволило использовать их в качестве диагностического теста для оценки течения послеоперационного периода.

Этап перехода оперированной конечности на полную нагрузку (4-7 месяцев после имплантации) характеризовался умеренным снижением относительного содержания Т-хелперов (CD3+CD4+) (не более чем на 15 %). Остальные показатели клеточного иммунитета в эти сроки не отличались от дооперационных значений.

Влияние имплантата на показатели клеточного иммунитета через 10-14 месяцев после имплантации (период начала активного функционирования эндопротеза) проявлялся снижением количества лимфоцитов (не более чем на 15 %), абсолютного числа Т-лимфоцитов (CD3 + ) (не более чем на 20%), относительного и абсолютного содержания Т-хелперов (CD3⁺CD4⁺) (не более чем на 15 %). Данные изменения были характерны для неосложненного течения послеоперационного периода.

Таблица 1

Распределение больных по виду имплантированных протезов

Виды бесцементных эндопротезов	Кол-во больных	Виды эндопротезов с цементной фиксацией	Кол-во больных
SLPS ЗАО «Altimed» (Белоруссия)	64	«Smith & Nephew» (США) (тазобедренные)	10
«Keramed» (Германия)	2	«Genesis-1» (США) (коленные)	29
«Ceraver» (Франция)	3	«De Peu» (США)	1

До операции (лимфоциты, моноциты, гранулоциты, CD3 , CD3*CD4 , СОЗ CDS*, СОЗ CD19 , CD3CD16⁺CD56⁺, CD3⁺CD16⁺CD56⁺,CD3⁺CD25⁺, CD3⁺HLA-DR).

5-7суток после имплантации

НЕОСЛОЖНЕННОЕ ТЕЧЕНИЕ ПОСЛ ЕОП ЕРА ПИОЧНОГО П ЕРИОДА

1 лимфоциты '

ТСОЗ СО19+         не более чем на 30 %

1CD3CD16CD56 от дооперационных 1CD3+CD16*CD56J значений

РИСК РАЗВИТИЯ

ИНФЕКЦИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ

1 лимфоциты (< 0,8х 10 /л)

Т СОЗ СО19+ (> 16 %; 0,Зх 10%)

1 CD3 CD16+CD56+ (< 6 %)

I CD3+CD16*CD56+ (< 3,3 %; 0.04х 10%)

18-21 суток после имплантации показатели возвращаются к дооперационным значениям

। лимфоциты (<0,8хЮ%)

Т СD3 CD 19+ (> 16 %; 0,3х 10%)

4-7 месяцев после имплантации

я                        д

1 СОЗ*СО4* (не более чем на 15% от            TCD3CD19* (>16 %; 0,Зх|0%)

дооперационных значений)

Я

10-14 месяцев после имплантации

Т лимфоциты (нс более чем на 15 %)

Т СОЗ* (не более чем на 20 %)

Т CD3+CD4+ (не более чем на 15 % от дооперационных значений)

РИСК РАЗВИТИЯ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА В ЗОНЕ НЕСТАБИЛЬНОГО ИМПЛАНТАТА

4 о гранулоциты (>4,0x10 /л)

Т CD3CD19+(>16 %; 0,3 х 10%)

TCD3*HLA-DR (>8 %; 1,0x10%)

TCD3+CD25+(>26 %; 1,3x10%)

22-24 .месяца после имплантации

д

• 1    лимфоциты (нс более чем на 40 %)

• 1    CD3* (не более чем на 40 %)

• 1    CD3⁺CD4⁺ (не более чем на 17 %)

• * CD3 CD16⁺CD56 (не более чем на 25 %)

Т CD3*CD 16 CD56* (не более чем на 13 % от дооперационных значений)

Д

Т гранулоциты (>4,0х 10%) TCD3CD19* (>16 %; О,3х 10%) TCD3 HLA-DR (>8 %; 1,0хЮ%) TCD3+CD25+(>26%; 1,3x10%)

Рис. 1. Алгоритм иммунологического обследования пациентов с остеоартрозом после эндопротезирования крупных суставов

Снижение абсолютного количества лимфоцитов (не более чем на 40 %), относительного содержания Т-лимфоцитов (CD3+) (не более чем на 15 %), абсолютного содержания Т-лимфоцитов (CD3+) (не более чем на 40 %), относительного и абсолютного содержания Т-хелперов (CD3+CD4+) (не более чем на 17 %), повышение относительного количества естественных киллеров (CD3-CD56+CD16+) (не более чем на 40 %) и естественных киллеров / Т-лимфоцитов (CD3+CD56+CD16+) (не более чем на 50 %) было характерно для благоприятного течения послеопера ционного периода. Относительное и абсолютное количество исходно повышенных клеток, экспрессирующих маркеры ранней активации Т-лимфоцитов (CD25+), в эти сроки снижалось, достигая нормальных значений. Значения показателей, превышающие 4,0×109/л для гранулоцитов, 16 % (0,35 × 109/л) для В-лимфоцитов (CD3-CD19+), 8 % (1,0 х 109/л) для CD3+HLA-DR, 26 % (0,4 х 109/л) для CD3+CD25+ свидетельствуют о вероятном развитии вялотекущего воспалительного процесса в области нестабильного имплантата (рис. 1).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данный алгоритм используется в стационаре ФГУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г. А. Илизарова» Минздравсоцразвития РФ во время подготовки к первичному и ревизионному эндопротезированию тазобедренных и коленных суставов и в послеоперационном периоде. Эффективность новой технологии подтверждена наблюдением на протяжении двух лет за группой из 109 больных в возрасте от 28 лет до 71 года, проле -ченных методом эндопротезирования. У 93 пациентов (85,3 %) получены хорошие функциональные результаты, признаков нестабильности эндопротеза на протяжении 2 лет наблюдения не выявлено, ближайший и отдаленный послеоперационные периоды протекали без осложнений, что было подтверждено результатами иммунологического обследования. Динамика иммунологических показателей в этой группе представлена в таблицах 2–4.

У 16 больных (14,7 %) в течение первого года после имплантации искусственного сустава были выявлены признаки нестабильности эндопротеза (тотальной или одного из компонентов). В этой группе с признаками нестабильности эндопротеза у 10 пациентов (0,09 %) с помощью иммунологических тестов был выявлен клинически не проявляющийся, вялотекущий воспалительный процесс в зоне имплантации (рис. 2), что позволило внести существенные изменения в тактику лечения: пациентам было выполнено двухэтапное реви- зионное эндопротезирование. На первом этапе удалялся нестабильный эндопротез и устанавливался цементный спейсер с антибиотиком. После регресса воспалительного процесса в зоне имплантации, подтвержденного результатами иммунологического тестирования (спустя 2-4 месяца после первого вмешательства), выполнялся второй этап лечения (удаление спейсера и реимплантация эндопротеза). Все результаты двухэтапной реимплантации хорошие. Повторного воспалительного процесса, а также признаков нестабильности реимплан-тированного протеза не выявлено, что позволяет рекомендовать данную медицинскую технологию для применения в лечебных учреждениях.

Таблица 2

Абсолютное содержание лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов после эндопротезирования крупных суставов при неосложненном течении послеоперационного периода (медианы значений показателей и интерквартильные размахи)

Лимфоциты (109/л)	Моноциты (109/л)	Гранулоциты (109/л)
До операции
1,56 (1,25÷2,02)	↓ 0,16+ (0,1÷0,27)	3,08 (2,55÷4,01)
5-7 суток после эндопротезирования
Д,29 * (0,9:1,4)	0,2 (0,13÷0,25)	Т 4,4 * (3,8:4,93)
18-21 сутки после эндопротезирования
1,64 (1,35÷1,95)	0,16 (0,11÷0,24)	3,3 (2,25÷4,28)
4-7 месяцев после эндопротезирования
1,56 (1,35÷1,83)	0,18 (0,14÷0,26)	3,31 (2,64÷3,87)
10-14 месяцев после эндопротезирования
| 1,24 * (1,06:1,47)	0,16 (0,12÷0,27)	2,91 (2,6÷3,27)
22-24 месяца после эндопротезирования
| 0,9 ** (0,71:1,43)	0,16 (0,11÷0,29)	3,29 (2,74÷3,58)
Норма
1,0 - 2,5	0,12 - 0,6	1,7 - 4,0

Примечание: * — p < 0,05, ** — p < 0,01 относительно дооперационных значений.

Таблица 3

Показатели клеточного иммунитета после эндопротезирования крупных суставов у пациентов с остеоартрозом при неосложненном течении послеоперационного периода (медианы значений показателей и интерквартильные размахи)

	СD3+	CD3 - CD19 +	CD3+CD4+	CD3+CD8+	CD3 - CD16 + CD56 +	CD3+CD16+CD56+
До операции
%	73,4 (67,2÷77,5)	9,6 (5,9÷11,8)	45,3 (41,3÷51,8)	26,2 (18,6÷31,2)	13,6 (8,3÷17,9)	6,7 (5,3÷8,8)
109/л	1,1(0,9÷1,41)	0,16 (0,08÷0,19)	0,72 (0,56÷0,88)	0,37 (0,28÷0,48)	0,21(0,11÷0,29)	0,1 (0,08÷0,23)
5 - 7 суток после эндопротезирования
%	72,8 (69,3÷78,1)	Т 12,3 * (10,0:15,3)	48,0 (43,4÷52,5)	24,1(18,6÷29,0)	1 9,3 ** (6,0:10,9)	, 4,9 * (3,3:6,0)
109/л	1,0 (0,77÷1,27)	Т 0,18 * (0,19:0,25)	0,65 (0,53÷0,87)	0,33 (0,22÷0,41)	0,16 (0,13÷0,22)	1 0,08 ** (0,04:0,11)
18 - 21 сутки после эндопротезирования
%	75,6 (69,8÷79,7)	8,5 (6,52÷10,2)	47,7 (43,9÷54,4)	24,7 (16,9÷29,1)	12,1 (7,8÷15,8)	6,1(4,6÷7,4)
109/л	1,16 (1,01÷1,52)	0,13 (0,09÷0,17)	0,76 (0,61÷0,96)	0,39 (0,28÷0,53)	0,19 (0,12÷0,29)	0,08 (0,06÷0,12)
4 - 7 месяцев после эндопротезирования
%	71,4 (59,6÷74,7)	9,7 (7,2÷11,5)	1 38,7 * (35,3:43,4)	26,1 (18,6÷36,4)	16,6 (13,2÷17,4)	6,8 (4,2÷11,2)
109/л	1,04 (0,68÷1,26)	0,14 (0,09÷0,2)	0,6 (0,47÷0,67)	0,38 (0,25÷0,51)	0,21 (0,16÷0,27)	0,11 (0,05÷0,14)
10 - 14 месяцев после эндопротезирования
%	68,2 (62,7÷71,4)	9,7 (7,2÷11,1)	1 38,5 ** (35,5:41,8)	30,4 (19,6÷35,8)	17,6 (11,7÷18,8)	7,4 (3,6÷9,5)
109/л	1 0,92 * (0,7:1,1)	0,13 (0,1÷0,16)	1 0,5 * (0,4:0,59)	0,38 (0,24÷0,54)	0,21 (0,15÷0,31)	0,09 (0,05÷0,13)
22 - 24 месяца после эндопротезирования
%	1 62,2 * (57,8:68,9)	8,3 (5,6÷9,6)	1 35,3 ** (34,1:38,5)	23,1 (18,1÷26,1)	Т 24,8 ** (21,6÷25,3)	Т 11,9 * (8,7:13,1)
109/л	1 0,59 ** (0,47:1,01)	1 0,08 * (0,07:0,14)	1 0,43 ** (0,35:0,53)	^ 0,21 * (0,16:0,39)	0,21 (0,18÷0,29)	0,11 (0,08÷0,14)
Норма
%	60-83	6-16	37-53	20-34	8-18	0-6
109/л	0,79-2,5	0,06-0,51	0,5-1,6	0,23-1,06	0,05-0,66	0-0,16

Примечание: * — p < 0,05, ** — p < 0,01 относительно дооперационных значений.

Таблица 4

CD3+HLA-DR (%)	CD3+HLA-DR (10 9/л)	CD3+CD25+ (%)	CD3+CD25+ (109/л)
До операции
4,11 (3,21÷6,37)	0,06(0,04÷0,11)	29,8 (26,0÷31,9)	0,44(0,37÷0,52)
5 – 7 суток после эндопротезирования
4,31 (2,42÷6,78)	0,06 (0,03÷0,11)	27,9 (23,1÷29,6)	0,41(0,23÷0,45)
18 – 21 сутки после эндопротезирования
3,9 (2,92÷6,37)	0,07 (0,05÷0,09)	31,8 (28,7÷33,9)	0,63 (0,5÷0,83)
4 – 7 месяцев после эндопротезирования
5,3 (4,2÷6,3)	0,07 (0,06÷0,12)	26,3 (25,7÷34,2)	0,33 (0,29÷0,35)
10 – 14 месяцев после эндопротезирования
5,1 (3,2÷7,6)	0,08 (0,05÷0,1)	↓ 20,6 * (18,2÷24,8)	↓ 0,23 * (0,19÷0,34)
22 – 24 месяца после эндопротезирования
5,6 (5,0÷6,4)	0,07 (0,04÷0,12)	↓ 18,0 ** (15,4÷22,1)	↓ 0,18 ** (0,13÷0,23)
Норма
0–6	0–0,16	7–18	0,06–0,4

Примечание: * — p < 0,05, ** — p < 0,01 относительно дооперационных значений.

CD3+(%)

Рис. 2. Иммунологический профиль у пациентов с нестабильностью эндопротеза с выявленными во время ревизионного вмешательства признаками гнойно — воспалительного процесса в зоне имплантации; за 100 % приняты медианы показателей пациентов со стабильными имплантатами; * — p < 0,05; ** — p < 0,01 относительно значений показателя в группе со стабильными имплантатами

Динамика CD3+ HLA-DR и CD3+ CD25+ после эндопротезирования крупных суставов при неосложненном течении послеоперационного периода (медианы значений показателей и интерквартильные размахи)