Лейкоцитарная формула периферическом крови у грызунов (Oryctolagus cuniculus) при хроническом описторхозе

Sidel’nikova AA. Peripheral blood leukocyte formula in rodents (oryctolagus cuniculus) with chronic opisthorchiasis. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological Newsletter. 2021;29(2):550. (4).550

Введение . Описторхоз имеет две фазы течения – острую, длящуюся в течение первого месяца после заражения, и хроническую, протекающую после 2-3 месяца до 15-25 лет [1-2]. Заболевание приводит к формированию холангиокарциномы, неоплазии, паразит-ассоциированному раку [3-6]. Лабораторные исследования количественных и качественных показателей крови в острую фазу характеризуются у человека выраженной эозинофилией и нейтрофильным лейкоцитозом, в хроническую фазу – сохранением эозинофилии в 50% случаев [7]. При изучении периферической крови при остром описторхозе в эксперименте у кроликов были обнаружены количественные изменения состава лейкоцитов крови, как гранулоцитов, так и агранулоцитов [8-10]. В лейкоцитарной формуле был отмечен нейтрофильный и базофильный лейкоцитоз, при сравнительно невысокой эозинофилии, а количество моноцитов – значительно снижено. Следовательно, при переходе заболевания в хроническую фазу, через 3 месяца после заражения, показатели лейкоцитарной формулы крови все еще могут иметь отличия от нормальных значений.

Цель исследования: изучить количественные изменения состава форменных элементов крови при описторхозе в эксперименте в хроническую фазу описторхоза.

Материалы и методы исследования. Проведено исследование процентного соотношения лейкоцитов периферической крови (лейкоцитарной формулы) у половозрелых самцов кроликов Oryctolagus cuniculus в возрасте 6 месяцев (n=16) в хроническую фазу описторхоза. Вид животного выбран с учетом высокой реактивности метаболизма, высокой восприимчивости к разным воздействиям [11]. Авторы руководствовались положениями «Международных рекомендаций по проведению биомедицинских исследований с использованием животных» (1985). Заражение животных проведено per os, однократно в инвазионной дозе по 50 метацеркариев Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884) per os, исследование проведено спустя 3 месяца после заражения, как описано ранее [8]. Выделение инвазионного материала (видовая принадлежность – язь, мышечная ткань) выловленных в реке Томь и полученных на кафедре ихтиологии и гидробиологии Томского государственного университета (Томск), проводилось вручную, с помощью компрессориума, под световым микроскопом при увеличении в 200 раз. Отбор метацеркариев осуществлялся при наличии маятниковых движений. Состоявшуюся инвазию подтверждали положительными анализами экскрементов методами Като-Миура и Paracep с обнаружением яиц трематод, как описано ранее [8]. Мазки крови изготовлены из капиллярной крови, взятой из сосудов уха животных. Взятие материала проведено в утренние часы, натощак. От каждого животного изготовлено по 3 микропрепарата (мазка крови). Фиксация мазков крови проведена азур-2-эозином по Май-Грюнвальду, окраска эозином-метиленовым синим по Романовскому-Гимза. Подсчет лейкоцитов проведен методом меандров, в расчете на 100 клеток, с использованием светового микроскопа МС 300 (Austria) при увеличении ×1000, с применением иммерсионной микроскопии. Статистическая обработка полученных данных проведена с вычислением среднего арифметического, межгрупповое сравнение данных для выборок с ненормальным распределением проведено непараметрическим критерием Манна-Уитни при уровне доверительной вероятности р≤0,05. В качестве контроля выбраны данные литературы для животных в сквозном диапазоне возраста от 6 месяцев до 1 года [12], поскольку возрастной диапазон животных в сроке наблюдения увеличился. Данные по лейкоцитарной формуле для животных в возрасте 9 месяцев отсутствуют. Для сравнения данных по фазам опи-сторхозной инвазии взяты собственные данные предыдущих исследований при острой фазе описторхоза через 33 суток (около 1 месяца), которые составили контроль-опыт [8].

Результаты исследования и обсуждение. При подсчете лейкоцитарной формулы периферической крови было установлено, что количество сегментоядерных псевдоэозинофилов по сравнению с нормой 1 больше на 13,5%, а с нормой 2 – на 10,15% (таблица 1). Количество палочкоядерных псевдоэозинофилов по сравнению

с нормой меньше на 0,42% и 0,12% соответственно. Общее число псевдоэозинофилов меньше на 12,73% и 10,73%, то есть 1,51-1,67 раз.

Таблица 1

Количество лейкоцитов в крови у кроликов при описторхозе через 3 месяца (в %, М)

Показатель	Норма 1*	Норма 2**	Контроль-опыт	Группа наблюдения (п=16)
Псевдоэозинофилы сегментоядерные	17	20	23,5	30,15
Псевдоэозинофилы палочкоядерные	2	1,7	3,5	1,58
Псевдоэозинофилы (общее количество)	19	21	27	31,73
Эозинофилы	1,2	1,2	1,2	4,76
Базофилы	0,8	1,1	5,5	11,1
Лимфоциты (общее количество)	77	73	62,3	53,16
Моноциты	2	3	3,1	0,04
Лимфоциты/Псевдоэозинофилы	4,05	3,36	2,3	1,67

*- по данным литературы для здоровых животных в возрасте 6 месяцев.

**- по данным литературы для здоровых животных в возрасте 1 год.

Таким образом, количество псевдоэозинофилов через 3 месяца все еще остается повышенным, что свидетельствует о протекающем в организме воспалении, общей интоксикации. По сравнению с контролем число псевдоэозинофилов стало выше на 4,73%, то есть возросло в 1,17 раза, различия уровня признака статистически значимы (U=3, p<0,05). Эти результаты характеризуют нарастание воспалительного процесса в динамике. Соотношение количества форм нейтрофилов имеет существенное значение для диагностики заболеваний, так как при воспалении число палочкоядерных форм всегда больше [13]. Таким образом, происходит нарастание воспалительного ответа, несмотря на переход процесса в хроническую фазу.

Количество эозинофилов в группе наблюдения по сравнению с нормой и контролем стало больше на 3,56%, то есть в возросло в 3,96 раза, различия уровня признака статистически значимы (U=4, p<0,05). Отсюда следует, что, нарастание числа этих клеток характеризует анти-паразитарный ответ организма у кроликов лишь к 3 месяцу протекания инвазии. Эозинофилы выделяют противовоспалительный цитокин - интерлейкин-10 [14], что может свидетельствовать о стихании острой фазы воспаления. Увеличение по- казателя указывает на возрастание аллергического фона и сенсибилизацию организма на чужеродные белки, получаемые организмом при инвазии. Значительное число эозинофилов в периферической крови через 3 месяца указывает на неспецифический ответ организма хозяина, поскольку, как известно, эозинофилия отмечается в острую фазу описторхоза, то есть в сроки 1-1,5 месяца.

Количество базофилов у животных через 3 месяца превышает данные нормы 1 на 10,3%, то есть в 13,87 раз, нормы 2 - на 10%, то есть в увеличено в 10 раз. При сравнении с контролем число базофилов больше на 5,6%, то есть выше в 2 раза, различия уровня признака статистически значимы (U=4, p<0,05). Полученные данные свидетельствуют о высоком аллергическом фоне у кроликов, вероятно, спровоцированном инвазией. У мышей при влиянии стресса в сочетании с инвазией также отмечалось наличие базофилии и эозинофилии [15]. Количество базофилов у кроликов, возросшее в два раза по сравнению с контролем, подтверждает состоявшуюся инвазию, а также неспецифический ответ организма с появлением иммунных комплексов антиген-антитело, оседающих на аналогах тучных клеток. Поскольку время нахождения базофилов в русле составляет половину суток [16], сле- довательно, выброс аллергена происходит как минимум двукратно за сутки. При этом базофилы, по данным литературы, сами фагоцитируют антигены, фрагментируют их и презентуют Т-хелперам [16]. При постоянном поступлении аллергена число базофилов для презентации, вероятно, было бы значительно больше, так как большее число клеток нагружалось бы антигеном. Относительно большое число клеток, возможно, связано с жизненным циклом паразита внутри хозяина, при котором происходит постепенное поступление антигенов к базофилам. Также, нарастание числа базофилов характеризует манифестацию развития гуморального ответа на инвазию не ранее, чем к 3 месяцу. Кроме того, базофилы способны к синтезу простагландинов и лейкотриенов, модулирующих воспаление, отек и экссудацию в слизистых оболочках [16]. Следовательно, рост базофилов крови характеризует протекание острого или подострого воспаления в слизистых оболочках желудочно-кишечного тракта, в том числе, желчевыводящих путях.

Количество лимфоцитов по полученным данным в группе наблюдения меньше, по сравнению с нормой 1 - на 14,7% и нормы 2 - на 10,7%, то есть в целом меньше в 1,2 и в 1,17 раз, соответственно. Однако, по сравнению со случаем-контролем результат больше на 9,14%, различия уровня признака статистически значимы (U=3, p<0,05). В этом случае можно считать, что при увеличении срока инвазии, количество лимфоцитов у животных возвращается к норме, хотя и не достигает нормальных значений. В данном случае можно также предположить, что организм хозяина адаптируется к инвазии, а картина крови приобретает приближенные к нормальным показателям. Такие данные можно трактовать, как выход из острой фазы воспаления при инвазии.

При исследовании состава лимфоцитов, исходя из их морфологической классификации, можно отметить, что большая часть приходится на средние лимфоциты (рис. 1), а меньшая часть - на большие лимфоциты (рис. 2). Соотношение лимфоцитов (большие: средние: ма- лые) при описторхозе у кроликов составляет 1:3,44:2,88. Как известно, лимфоциты играют важную роль в усвоении и синтезе белков. Следовательно, при увеличении их числа восстанавливается, в некоторой мере, белковый обмен, несмотря на поражение печени. Однако, соотношение лимфоцитов в пользу средних форм может трактоваться как отражение работы иммунной системы, так как в норме большее их число в крови приходится на малые лимфоцитов.

При сравнении числа моноцитов у зараженных животных через 3 месяца показатель соответствует норме 2, и несколько меньше нормы 1. Однако, при сравнении со случаем-контролем этот показатель значительно больше, на 3,06%, различия уровня признака статистически значимы (U=0, p<0,05). В данном случае это можно рассматривать как возврат числа моноцитов к нормальным значениям и выход из фазы активного воспаления. Следовательно, моноциты остаются в кровеносном русле, не мигрируя в большинстве своем в ткани. Проявления активного фагоцитоза блокируются определенными факторами. Среди них могут быть такие, как отграничение паразита собственными тканями организма (формирование капсулы) либо адаптация организма повышенной продукцией данного пула клеток, либо их ускоренной миграцией в ткани, что приводит в итоге к нормальным значениям относительного показателя числа моноцитов.

При отслеживании соотношения числа лимфоцитов к псевдоэозинофилам (аналогам нейтрофилов у человека) установлено, что и этот показатель по сравнению со случаем-контролем возрос на 0,63%. Однако он значений показателей нормы 1 и 2 не достигает. По сравнению с нормой 1 он возрастает лишь в 1,76 раза, нормой 2 в 1,46 раза. Отмечается усиление функции нейтрофилов в купировании асептического воспаления при инфекциях описторхидами [17-18]. Тем не менее важно отметить, что у кролика профиль лейкоцитарной формулы является лимфоцитарным [12], через 3 месяца инвазии число псевдоэозинофилов снижается, а число лимфоцитов возрастает. В нашем случае можно считать, что фаза реактивного воспаления к этому времени заканчивается.

Соотношение числа эозинофилов к числу базофилов обычно не учитывается при рассмотрении лейкоцитарной формулы. Мы предлагаем вводить данный показатель для уточнения характера аллергического процесса. Как известно эозинофилы реагируют на чужеродный белок и их число обычно велико лишь в ранние сроки инвазии, до формирования защитных барьеров организма и поступления эндотоксинов разрушенных клеток и экзотоксинов паразита в крово- и лимфоток [19]. В дальнейшем их число снижается, и этот показатель информативность теряет. В нашем случае число эозинофилов возрастало, но также возрастало и число базофилов, причем последних вдвое. Базофилы по данным литературы выполняют функции, сходные с тучными клетками соединительной ткани при влиянии разных факторов [20]. Следовательно, они реагируют на иммунные комплексы «аллерген-антитело класса Е». Продукция антител данного типа вероятно значительна, поскольку число данного вида лейкоцитов значительно возрастает. Если нормальные показатели соотношения эозинофилов к базофилам 1:1,1 или 1:1,3, то при инвазии через 3 месяца этот показатель уже равен 1:4,58, а на ранних сроках 1:2,33. Таким образом, число иммунных комплексов нарастает, что проявляется в повышенном содержании числа базофилов, по сравнению с эозинофилами, роль последних отходит на второй план. Как известно, представление антигена на своей поверхности могут не только макрофаги, дендритные клетки, фибробласты и эпителиоциты, но также по данным Тарасовой И.В. эти функции могут выполнять базофилы, тучные клетки и тромбоциты [16]. Так, по данным автора, базофилы способны выделять интерлейкин-4, усиливая работу Т-хелперов. На начальном этапе развития аллергии базофилы активируют Т-хелперы 2 типа, что обеспечивает дифференцировку В-лимфоцитов, это приводит к образованию иммуноглобулинов плазмоцитами. Такие иммуноглобулины связываются одним концом с аллергеном, а другим - с базофилом или тучной клеткой [5, 16]. В этом случае, число последних нарастает с повышением продукции специфических антител. В этом случае, также можно наблюдать низкое содержание моноцитов в крови у зараженных животных на ранних этапах инвазии.

Рис. 1. Распределение видов лимфоцитов у кроликов при описторхозе через 3 месяца в абсолютных и относительных числах.

Рис. 2. Мазок крови кролика через 3 месяца после заражения описторхозом. Базофил (1) и большой лимфоцит (2). Окр.: по Романовскому-Гимза. Ув.: х900.

При этом в норме показатель отношения числа моноцитов к числу базофилов для косвенной оценки работы иммунной си- стемы может иметь значение при длительно протекающем воспалительноаллергическом процессе. В норме этот по- казатель у кроликов составляет 2,5-2,7. При инвазии этот показатель падает до 0,003 в ранние стадии, и возрастает до 0,56 через 3 месяца. Следовательно, при анализе этого показателя можно выявить существенные изменения в лейкоцитарной формуле крови при незначительном изменении исходных значений содержания отдельных видов клеток.

Заключение . Таким образом, при описторхозе у кроликов через 3 месяца после заражения отмечается частичное восстановление некоторых показателей в лейкоциатрной формуле периферической крови с тенденцией возврата к нормальным значениям. Число базофилов и псевдоэозинофилов остается значительным, возрастает количество моноцитов, незначительное в острой фазе инвазии.