Липопротеины высокой плотности плазмы крови как транспортная форма актиномицина Д

Одним из приоритетных направлений современной фармакологии является создание терапевтических комплексов лекарственных средств, позволяющих осуществлять адресную доставку препаратов к клеткам-мишеням. Поиск переносчиков лекарственных соединений с целью увеличения их терапевтической эффективности и снижения побочных эффектов продолжается и в настоящее время. Активно изучается возможность применения липопротеинов плазмы крови как наноразмерной транспортной системы [1, 2]. Следует отметить, что активно пролиферирующие опухолевые клетки имеют повышенную потребность в липидах как в структурных компонентах, поэтому отличаются большей способностью захватывать липопротеиновые частицы [3]. В литературе достаточно широко представлена попытка использования липопротеинов низкой плотности в качестве транспортных форм для цитостатиков [4–6], однако в ряде работ указывают на возможность использования для этих целей липопротеинов высокой плотности [7–9].

Целью исследования явилось изучение возможности использования липопротеинов высокой плотности плазмы крови в качестве транспортной формы актиномицина Д.

Материал и методы

В работе использовали меченный тритием актиномицин Д (3Н-Акмц-Д) со специфической активностью 4,1 Ки/ммоль («Амершам», Англия). К 100 мл плазмы крови крыс добавляли ~5 μл 3Н-Акмц-Д (0,5 μКи). После инкубирования (30 мин при 20 оС) поэтапное выделение отдельных фракций липопротеинов из плазмы проводили методом ультрацентрифугирования в растворах KBr в присутствии 3 мМ ЭДТА-Na2на центрифуге («OptimaL-90K, Beckman-Coulter», Австрия) с использованием ротора 70.1Ti. [10]. Получали три основные фракции липопротеинов: липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП, 0,94

После ультрацентрифугирования фракцию ЛПВП подвергали хроматографическому разделению на колонке (0,8×40 см, Сефадекс G-50, «Pharmacia», Швеция). Элюент: 5мМ трис-НСl буфер, рН 7,4, 0,15 М NaCl, не содержащий 6 М мочевину. Профиль элюции регистрировали на УФ-детекторе («LKB», Швеция) при длине волны 280 нм. Кроме того, элюат анализировали на наличие радиоактивности. Измерение концентрации белка проводили на спектрофотометре (Evolution 300, «Thermo Scientific», США) в ЦКП «Спектрометрические измерения» на базе НИИ биохимии ФИЦ ФТМ, г. Новосибирск.

В опытах in vivo эксперименты проведены на самцах крыс Вистар, массой 180–220 г. Исследования выполняли с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации, в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Комплексы ЛПВП с меченным тритием актиномицином Д (0,5 мл, 0,5 μКи) на 100 г массы тела вводили в хвостовую вену крысы. Через 30 мин после введения животных подвергали декапитации под эфирным наркозом. Тушки крыс перфузировали 0,15 М NaCl через аорту и v. porta. Радиоактивность измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике («Марк-II», США) в ЦКП НЦКЭМ. Величину радиоактивности органов и тканей рассчитывали в имп/мин на 1 мг ткани.

Расчет констант ассоциации комплексов ЛПВП-актиномицин Д осуществляли методом тушения триптофановой флуоресценции [11]. Измерения проводили на спектрофлуориметре RF-5301PC («Shimadzu», Япония) при длине волны возбуждения 285 нм и эмиссии в диапазоне от 300 до 600 нм. Рабочий раствор (1 мМ) немеченого актиномицина Д («AppliChem», Германия) готовили из 10 мМ маточного раствора. Титрование проводили в термостатируемой кювете при температуре 20 ºС с добавлением аликвот рабочего раствора (1 мМ) немеченого актиномицина Д (по 2 мкл) к 2 мл ЛПВП. Молекулярные массы ЛПВП и аполипопротеина А-I принимались за 300 кДа и 28 кДа соответственно.

Результаты и обсуждение

Добавление меченного тритием актиномицина Д к плазме крови крыс и последующее ультрацентрифугирование показали, что более половины содержания меченого препарата находилось в составе ЛП-фракций и 40,3 % приходилось на фракцию инфранатанта (рис. 1). Обращает на себя внимание, что среди ЛП-фракций основная часть метки была в составе фракции ЛПВП (48,8 %).

После ультрацентрифугирования фракция ЛПВП, содержащая меченый актиномицин Д, была подвергнута гель-хроматографии на сефадексе G-50 (рис. 2А). Пик радиоактивности препарата совпадал с объемом выхода фракции ЛПВП, хотя и отмечалось небольшое уменьшение удельной радиоактивности за счет сорбции меченного препарата гранулами сефедекса. Практически аналогичную хроматографическую картину мы получили после инкубации изолированной фракции ЛПВП с немеченым актиномицином Д. Наличие немеченого препарата в элюате оценивали методом его спектральной характеристики по максимуму поглощения при длине волны 440 нм. В результате хроматографического разделения пик поглощения при 440 нм полностью совпадал с объемом выхода фракции ЛПВП, что подтверждает возможность комплексообразования и, кроме того, указывает на сохранение устойчивости препарата в комплексе с частицами ЛПВП. Следует отметить, что процесс носил обратимый характер, поскольку введение в данную систему избыточного количества (10-6–10-7 М) немеченого актиномицина Д приводило к вытеснению метки из комплексов с ЛПВП (рис. 2Б).

Для количественной оценки взаимодействия ЛПВП-актиномицин Д нами были использованы данные спектров излучения (флуоресценции). Взаимодействие ЛПВП с немеченым актиномицином Д сопровождалось тушением флуоресценции триптофанилов (рис. 3). При этом форма спектров, их полуширина практически не изменялись. Наблюдался небольшой сдвиг в длинноволновую область спектра, что объясняется локальными конформационными перестройками белкового компонента ЛПВП после взаимодействия его с препаратом. Практически сходные кривые тушения флуоресценции мы получили после инкубации основного белкового компонента ЛПВП – аполипопротеина А-I c актиномицином Д. Следует отметить, что в обоих случаях наибольшее снижение флуоресценции в точке эквимолярности составило около 80 %.

Изучение временной зависимости тушения флуоресценции при одномоментном добавлении насыщающих количеств актиномицина Д показало, что полное насыщение связывающих областей ЛПВП и аполипопротеина А-I наблюдалось через 30 мин взаимодействия. На основании результатов полученных кривых тушения флуоресценции

Рис. 1. Суммарное распределение радиоактивности (%) 3Н-актиномицина Д между фракциями ЛП плазмы крови крыс по результатам препаративного ультрацентрифугирования и с учетом молекулярных масс были получены основные физико-химические характеристики взаимодействия ЛПВП и аполипопротеина А-I с актиномицином Д. Константы ассоциации были порядка 105 М-1, а количество центров связывания для препарата составило 26 для ЛПВП и 12 для аполипопротеина А-I.

Полученные результаты свидетельствуют, что связывание характеризуется недостаточно высоким сходством, поэтому его не следует характеризовать как высокоспецифическое. Однако следует заметить, что в настоящее время имеются данные о реализации биологически активного эффекта комплексов аполипопротеина А-I со стероидными гормонами с константами ассоциации аналогичного порядка – 105 М-1 [12]. Основываясь на этом, можно предположить, что и в данном случае комплексы ЛПВП-актиномицин Д попадут в клетки-мишени, а невысокая специфичность образованных комплексов будет способствовать «освобождению» препарата внутри клетки и эффективной реализации его цитостатического эффекта.

Рис. 2. Связывание меченного тритием актиномицина Д с фракцией ЛПВП плазмы крови крыс: А – ЛПВП + меченный тритием актиномицин Д; Б – ЛПВП + меченный тритием актиномицин Д в присутствии 1000-кратного избытка немеченого актиномицина Д. Колонка: сефадекс

G-50 (0,8×40 см). Элюент: 5 мМ Трис-НСl, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 5 мМ ЭДТА. Сплошная линия – поглощение белка при 280 нм; пунктирная линия – радиоактивность

Рис. 3. Тушение триптофановой флуоресценции ЛПВП при добавлении актиномицина Д; 1 – ЛПВП; 2–6 – добавление аликвот актиномицина Д к ЛПВП; 7 – актиномицин Д

Доказательство возможности использования ЛПВП в качестве транспортной формы для доставки актиномицина Д в органы и ткани организма было продемонстрировано в опытах на животных. Для этого комплексы ЛПВП и меченного тритием актиномицина вводили в хвостовую вену крысы. Распределение радиоактивного препарата в органах и тканях крыс через 30 мин после введения приведено в таблице.

Оказалось, что через 30 мин после внутривенного введения меченого препарата в комплексе с ЛПВП наибольшая удельная радиоактивность была обнаружена в надпочечниках, затем – в печени и почках. Как минимум, вдвое меньшее поглощение меченого препарата наблюдали в легких, жировой ткани, тимусе и селезенке. Совсем слабое поглощение метки отмечено в ткани миокарда.

Обращает на себя внимание высокое накопление препарата надпочечниками. Этот факт вполне понятен, так как в стероидпродуцирующих органах крыс для синтеза стероидных гормонов используется холестерин сосудистого происхождения – эфиры холестерина ЛПВП [13, 14]. В пользу этого факта свидетельствуют также литературные дан- ные о том, что связывание меченого хлордекона с ЛПВП обеспечивает его преимущественное накопление в стероидогенных клетках надпочечников и семенников – органов, наиболее подверженных токсическому воздействию чужеродных соединений [15].

Наличие высокой радиоактивности в печени, как уже отмечалось, объясняется ведущей ролью этого органа в метаболизме ЛПВП и переносимых ими различных лигандов, в частности эфиров холестерина [16]. Следует отметить достаточно высокий уровень меченого актиномицина в почках, что подтверждается работами, в которых показана важнейшая роль почек в катаболизме ЛПВП и апоА-I как основного структурообразующего компонента данной фракции [17]. У крыс, по литературным данным, 39 % всего пула апоА-I катаболизирует в почках [18].

Таким образом, в работе представлен анализ распределения меченного тритием актиномицина Д между основными фракциями липопротеинового спектра плазмы крови крыс. По результатам препаративного ультрацентрифугирования более половины общего содержания меченого актино- таблица

Поглощение меченного тритием актиномицина Д органами и тканями крыс через 30 мин после внутривенного введения в комплексе с ЛПвП (радиоактивность в имп/мин на 1 мг ткани)

Примечание: в группе 5 животных.

мицина Д находилось в составе ЛП-фракций и 40,3 % – во фракции инфранатанта. Среди ЛП-фракций основная часть метки была во фракции ЛПВП (48,8 %). Образование комплексов между частицами ЛПВП и меченым препаратом было подтверждено методом гель-хроматографии. Совпадение объёмов выхода фракции ЛПВП и актиномицина Д свидетельствовало о реальности образования таких комплексов. Комплексообразование было обратимым, поскольку введение в данную систему 500-кратного избытка немеченого препарата приводило к вытеснению радиоактивной метки из комплексов с ЛПВП. Получены основные физико-химические характеристики взаимодействия ЛПВП и аполипопротеина А-I с актиномицином Д. Константы ассоциации были порядка 105 М-1, а количество центров связывания