Локализация СD8-позитивных клеток лимфатических узлов в различные сроки после введения аллогенного костного мозга

Романов В.О., Любовцева Л.А., Воробьева О.В., Романова Л.П. Локализация СD8-позитивных клеток лимфатических узлов в различные сроки после введения аллогенного костного мозга. Морфологические ведомости. 2021;30(1):549.   mn.2022.30(1).549

Romanov VO, Lubovtseva LA, Vorob’yova OV, Romanovа LP. The localization of CD8-positive cells of the lymph nodes cells in different times after the injection of the allogenic bone marrow. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological newsletter. 2021;30(1):549. (1).549

Article received 17 April 2021

Article accepted 22 December 2021

Введение. На современном этапе иммунология прочно вошла в каждую врачебную специальность и требует достаточно большого объема новых знаний, которые необходимы для понимания механизмов регуляции иммунного ответа в нормальных и патологических условиях. Лимфатическая система участвует в опосредовании иммунитета, поскольку лимфатическое русло осуществляет приток антигенов в часть вторичных лимфоидных органов и образований афферентными лимфатическими путями [1]. Лимфатические узлы представляют собой место развития иммунного ответа, участок им-мунокооперативных взаимодействий [2–6]. На любые эндогенные и экзогенные воздействия лимфатические узлы динамично, лабильно реагируют изменением своих структурно-функциональных особенностей, поскольку они вместе с лимфатическими капиллярами, сосудами, стволами и протоками входят в состав иммунной системы [7–9]. CD8-антиген идентифицирован как маркер субпопуляции цитотоксических T-лимфоцитов [10-11]. Исследование временной динамики числа СD8-позитивных клеток (супрессоров) в лимфатических узлах может прояснить реакцию лимфатических узлов на введение клеточных антигенов. Подсадка аллогенного костного мозга (далее – КМ) может помочь в выявлении степени участия Т-клеточного звена иммунной системы в определенных зонах лимфатических узлов. Введение живого аллогенного антигена должно показать, как изменяется число клеток-супрессоров по мере развития реакции замедленного типа, в какие временные промежутки этот ответ максимален, когда заканчивается, и какими изменениями характеризуется при попадании в организм клеток разных популяций.

Целью исследования явилось изучение числа СD8-позитивных клеток лимфатических узлов на ранних временных этапах после введения аллогенного костного мозга.

Материалы и методы исследования. Эксперименты проведены на 50 беспородных крысах-самцах. Животные были разделены на три группы: 1-я группа – интактные крысы (n=10), 2-я – контрольные животные (n=10), которым вводили 3 мл 0,85% раствора хлорида натрия; 3-я – опытные крысы (n=30), которым в хвосто- вую вену вводили клеточную суспензию, состоящую из 1 мл костного мозга, извлеченного из эпифиза бедренной кости другой крысы и смешанного с 2 мл 0,85% раствора натрия хлорида. Выведение животных из эксперимента проводилось через 40, 120 и 240 минут от начала эксперимента под кетаминовым наркозом из расчета 4,4 мг/кг веса животного в соответствии с международными правилами проведения работ с экспериментальными животными [12]. Все действия осуществлялись с учетом требований «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» [12]. На проведение исследования получено разрешение локального этического комитета медицинского факультета Чувашского государственного университета имени И.Н. Ульянова» (протокол № 5/8 от 18 июня 2015 г).

Для оценки иммунного ответа использовали иммуногистохимический метод трехэтапного непрямого иммунофер-ментного анализа с использованием первичных моноклональных антител к антигенному маркеру CD8 (клон 4B11) (Novo-castra Labaratoris Ltd, Великобритания). После депарафинирования и регидратации в этаноле нисходящей концентрации срезы лимфатического узла погружали в восстанавливающий цитратный буфер (рH=6,0). Затем проводили высокотемпературную обработку прогреванием на водяной бане при 90–95°С в течение 30 минут с целью демаскировки искомых антигенов в тканях. После ингибирования эндогенной пероксидазы 3%-м раствором перекиси водорода на метаноле в течение 30 минут с последующей промывкой 0,1М фосфатным буфером проводили иммуногистохимическую реакцию методом трехэтапного непрямого иммуноферментного анализа с использованием первичных моноклональных антител (далее - МКАТ) к антигенному маркеру CD8 в разведении 1:100, согласно рекомендации фирмы-изготовителя (Dako, Дания). Визуализацию первичных МКАТ, связавшихся с антигенами, проводили стандартным био-тин-стрептавидин-пероксидазным методом с использованием набора LSAB-2 (Labeled Streptavidin Biotin System

Peroxidase Dako, Дания). Для блока неспецифического связывания срезы инкубировались в течение 1 часа в 10% козьей сыворотке, после чего к ним были добавлены первичные антитела к белку CD8 на 18 часов при температуре 4°С. В качестве вторичных антител были использованы анти-видовые анти-иммуноглобулиновые био-тилированные антитела. Cрезы докрашивались гематоксилином. В каждой серии иммуногистохимических реакций выполнялось контрольное исследование c инкубированием нескольких срезов в отсутствии первичных антител. Специфичность экспрессии искомого антигена в опытных срезах лимфатического узла подтверждалась отсутствием ее в контрольных срезах, не обработанных пер- вичными антителами [13]. Достоверность различий оценивали по критерию разности долей. Различия между группами считались достоверными при p<0,05 [14].

Результаты исследования и обсуждение. У интактных животных CD8+-лимфоциты определяются в небольшом числе в паракортикальной зоне, единичные в краевых синусах, мозговых тяжах лимфатических узлов (рис. 1, табл. 1). При введении физиологического раствора число CD8+-лимфоцитов увеличивается до 40 минут (рис. 2). В последующие временные этапы их число остается на том же уровне. В связи с тем, что изменения в лимфатических узлах начинались с 30 минут включительно, экспериментальный материал забирали, начиная с 40 минут.

Рис. 1. Корковое вещество лимфатических узлов интактных животных. Иммуногистохимическая реакция с антителами к CD8. Окр. гематоксилином. Ув.: х400.

Рис. 2. Распределение CD8+ клеток в короне лимфоидного узелка через 40 минут после введения физиологического раствора. Иммуногистохимическая реакция. Окр. гематоксилином. Ув.: х400.

а

Рис. 3. Распределение CD8+ клеток в структурах лимфатических узлов через 40 минут после введения аллогенного костного мозга. Иммуногистохимическая реакция. Окр. гематоксилином. Ув.: а – х100; б - х400.

б

Через 40 минут после введения аллогенного КМ в корковом веществе лимфатических узлов происходит увеличение числа CD8+-лимфоцитов. Количество CD8+-лимфоцитов начинает увеличиваться в короне большинства лимфоидных узелков и в паракортикальной зоне, однако различия с интактными животными по этим показателям статистически не значимы

(табл. 1). Около лимфоидных узелков обнаруживаются расширенные краевые синусы с CD8+-лимфоцитами (рис. 3-а). В мозговом веществе наблюдается фрагментация мозговых тяжей с группами CD8+-лимфоцитами (рис. 3-а). CD8+-лимфоциты определяются около лимфатических и кровеносных сосудов (рис. 3-б).

Таблица 1

Содержание CD8+-лимфоцитов в структурах лимфатических узлов в процентах после пересадки аллогенного костного мозга

Наименование структур	Животные интактные, n=10	экспериментальные, после трансплантации
		40 мин, n=10	2 часа, n=10	4 часа, n=10
Краевые синусы	1,1	9,7	24,7	8,3
Мякотные шнуры	1,1	4,4	17,4	15,2
Промежуточные синусы	0,0	7,0	22,6	5,3
Лимфоидные узелки	0,0	6,0	11,6	12,3
Паракортикальная зона	4,6	8,8	64,7 */**	1,2***

Примечание: * - результаты статистически достоверны по сравнению с интактными животными (р=0,0056); ** - по сравнению с группой «40 минут после начала эксперимента» (p=0,0092); *** - по сравнению с группой «2 часа после начала эксперимента (p=0,0037)

Через 120 минут после аллопере-садки КМ CD8+-лимфоциты определяются под капсулой в один-два слоя. Определяются 3 вида лимфоидных узелков с позитивными клетками: лимфоидные узелки, не имеющие CD8+-лимфоцитов, со средним числом CD8+-лимфоцитов, которые в небольшом числе локализуются во всех частях лимфоидных узелков и с большим числом CD8+-лимфоцитов, которые располагаются в короне (рис. 4а, 4б). В корковом веществе лимфатического узла лимфоидные узелки располагаются в один, два ряда (рис. 4а). Паракортикаль-ная зона с видимыми CD8+-лимфоцитами сокращается до полного отсутствия в части этой зоны (рис. 4а). В лимфоидных узелках, в их герминативном центре происходит «оголение стромы» (рис. 4в). В короне лимфоидных узелков число CD8+-лимфоцитов резко возрастает. В целом в паракортикальной зоне лимфатических узлов отмечается значительный статистически значимый рост числа CD8+-клеток, как по сравнению с аналогичным показателем интактных животных, так и по сравнению с группой в которой их число определялось на 40 минуте после начала эксперимента (табл. 1).

Наблюдается «оголение стромы» и расширение кровеносных сосудов в герминативном центре лимфоидных узелков. В мозговом веществе лимфатического узла появляются новые лимфоидные узелки, что может указывать на ускоренное размножение лимфоцитов, CD8+-лимфоциты в мозговых тяжах располагаются группами (рис. 4а).

Через 240 минут после введения аллогенного КМ, лимфоциты, экспрессирующие CD8, располагаются неравномерно в очень небольшом числе и лишь в некоторых участках под капсулой, в короне некоторых лимфатических узелков, они также определяются в магистральных лимфатических сосудах и в корковых промежуточных синусах. В паракорти-кальной зоне их число достоверно снижается по сравнению с предыдущим этапом (рис. 5а, табл. 1).

Наибольшие изменения происходят в медуллярной зоне, где появляется множество адипоцитов (рис. 5б, 5в). Положительные CD8+-лимфоциты образуют группы в мозговых тяжах, иногда цепочки клеток, корковые синусы расширены, кровеносные сосуды полнокровны.

а

б

в

Рис. 4. Распределение CD8+-лимфоцитов в структурах лимфатических узлов через 120 минут после введения аллогенного костного мозга. Иммуногистохимическая реакция. Окр. гематоксилином. Ув.: х400.

а

б

в

Рис. 5. Распределение CD8+-лимфоцитов в структурах лимфатических узлов через 240 минут после введения аллогенного костного мозга. Иммуногистохимическая реакция. Окр. гематоксилином. Ув.: х400.

Как известно, повышение CD8+-лимфоцитов приводит к угнетению иммунного ответа организма, что свидетельствует о недостаточности иммунитета, они тормозят выработку антител различных классов за счет задержки пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов, а также развитие гиперчувствительности замедленного типа [15-17]. В лимфатических узлах число CD8+-супрессоров небольшое, но уже в контроле через 30 минут от начала эксперимента их количество увеличивается в корковом веществе, в дальнейшем остается на том же уровне. При введении аллогенного КМ через 40 минут увеличивается число лимфоидных узелков, а в них CD8+-лимфоцитов. Аллогенный КМ резко подавляет иммунную реакцию, с одной стороны, увеличением числа CD8+-лимфоцитов и, очевидно, приводит к стимулирующему влиянию клеток-хелперов [18-19]. С другой сторо ны, наблюдается увеличение числа лимфоидных островков, расширение сосудов, синусов, в которых определяются CD8+-лимфоциты. Оголение стромы может указывать на то, что лимфатические узлы выбрасывают в кровь лимфоциты [4, 7, 20]. Такой рост числа CD8+-лимфоцитов продолжается до 120 минут эксперимента. При этом размножение этих клеток происходит под капсулой, в короне некоторых лимфоидных узелков, в паракорти-кальной зоне и в мозговых тяжах. Максимальная реакция по всем названным параметрам происходит до 120 минут эксперимента. Через 240 минут от начала введения аллогенного КМ число CD8+-лимфоцитов изменяется в корковом веществе и других функциональных зонах лимфатических узлов, наблюдается жировое перерождение мозгового вещества лимфатических узлов и отсутствие CD8+-лимфоцитов в корковом веществе органа.

Заключение. Таким образом, через 40 минут от начала пересадки аллогенного КМ в структурах лимфатических узлов крыс-реципиентов лимфоциты с CD8 маркером определяются в расширенной субкапсулярной, паракортикальной зонах, около сосудов, в корковых синусах, мозговых тяжах. Через 120 минут от начала пересадки аллогенного КМ увеличивается число лимфоидных узелков с разным числом CD8+- лимфоцитов и разной интенсивностью их окраски, происходит размножение клеток под капсулой, в короне некоторых лимфоидных узелков, сосуды остаются расширенными и наступает фрагментация мозговых тяжей с появлением новых групп CD8+-лимфоцитов. Можно предположить, что происходит выброс этих лимфоцитов в кровь, так как наблюдается «оголение стромы» во всех участках лимфатических узлов, в том числе и в герменативных центрах. Через 240 минут от начала введения аллогенного КМ в небольшом числе CD8+-лимфоциты определяются в субкапсулярной зоне, в короне единичных лимфоидных узелков, по ходу лимфатических и кровеносных сосудов, группами – в мозговых тяжах. Наблюдается жировое перерождение в мозговом веществе лимфатических узлов. В целом выявленная поэтапная динамика CD8+-клеток в лимфатических узлах после введения аллогенного костного мозга демонстрирует внутриорганную временную микротопографию процесса распознавания аллогенных белков у крыс-реципиентов и развитие ответной реакции.