Лучевая визуализация моделей метастатического роста на примере меланомы мышей B16/F10 с эндостальным введением и оценкой методом ПЭТ/КТ

Разработка лекарственных средств, способных ингибировать ключевые этапы метастазирования, остается одной из актуальных задач современной онкологии. В этом контексте модель легочных метастазов меланомы B16F10 у мышей доказала свою ценность как экспериментальная система для доклинических исследований антиметастатических агентов [1]. Для моделирования метастатического поражения, как правило, используют один из двух подходов. Первый подход основан на прямом внутривенном введении клеточной суспензии, обеспечивающем гематогенную диссеминацию и формирование вторичных очагов. Второй подход включает подкожную трансплантацию опухолевых клеток с последующим развитием первичного узла и спонтанным метастазированием, при этом для предотвращения преждевременной гибели животного выполняется хирургическое удаление пораженной лапы [2].

Общепринятый способ оценки развития метастатического поражения предполагает вскрытие животного с визуальной макроскопической оценкой пигментированных очагов в легких. Недостатком данного способа являются необходимость в выведении животного из эксперимента и, соответственно, отсутствие возможности наблюдать за развитием метастазов в динамике. Прижизненное наблюдение за развитием метастатического процесса возможно с помощью различных методов лучевой диагностики, каждый из которых характеризуется определенной степенью информативности в контексте биомедицинского исследования. Например, биолюми-несцентная визуализация обладает максимальной чувствительностью на ранних стадиях метастатического процесса, но на более поздних сроках сигнал от очагов сливается, что не позволяет детально оценить степень метастатического поражения [3]. Магнитно-резонансная томография (МРТ) легких затруднена, т.к. легочная ткань состоит преиму- щественно из воздушных пространств и обладает низкой протонной плотностью. Кроме того, МРТ-изображение неизбежно страдает от выраженных артефактов дыхания и сердцебиения [4].

Основным методом для диагностики очаговых образований в легких как в клинической, так и в доклинической практике является компьютерная томография (КТ). Это обусловлено существенным различием в рентгеноплотности между легочной тканью и солидными очагами, за счет чего достигается высокая контрастность изображения [5]. Доклиническая микрокомпьютерная томография (микроКТ) позволяет отчетливо визуализировать даже субмиллиметровые метастазы. Важно отметить, что при сканировании лабораторных животных качество изображения существенно улучшается при использовании синхронизации с дыханием [6].

Позитронная эмиссионная томография (ПЭТ) со стандартным препаратом 18F-фтордезоксиглюкозой (18F-ФДГ) может предоставить дополнительную информацию о метаболической активности выявленных очагов [7]. В клинической практике ПЭТ/КТ с 18F-ФДГ является методом выбора для достоверной идентификации метастатических очагов в легких пациента [8]. Однако роль ПЭТ/ КТ в диагностике легочных метастазов у мелких лабораторных животных на данный момент недостаточно обоснована. В ряде работ продемонстрировано активное накопление 18F-ФДГ в легочных метастазах меланомы B16F10, что отчетливо визуализируется при ПЭТ/КТ-сканировании. Например, при изучении технических характеристик двух доклинических ПЭТ/КТ томографов оба аппарата позволили визуализировать метастазы с повышенной метаболической активностью, размером от 1 до 5 мм [9]. Кроме того, с помощью методов лучевой диагностики удалось обнаружить очаги размером от 1 мм, в наиболее крупных из них (от 2,7 мм) отмечалось активное накопление 18F-ФДГ. Кроме того, с помощью ПЭТ/КТ были выявлены метастазы не только в легких, но и в других областях: в костях, в органах брюшной полости и подкожные [10]. Отмечено влияние используемого вида анестезии на результаты ПЭТ/КТ: при применении комбинации кетамина с ксилазином фоновая активность легочной ткани мыши повышалась, затрудняя визуализацию патологических очагов, но при использовании изофлурана метастазы отчетливо определялись [11].

С другой стороны, многие авторы указывают на низкое накопление 18F-ФДГ в легочных метастазах меланомы B16F10 у мышей, что не позволяет визуализировать патологические очаги методом ПЭТ/КТ [12–14]. Таким образом, вопрос о диагностической ценности комбинированного ПЭТ/ КТ исследования в доклинической практике и его преимуществах перед микроКТ до настоящего момента окончательно не решен.

Цель исследования – сравнение информативности методов микроКТ и ПЭТ/КТ при оценке метастатического поражения легких лабораторной мыши.

Материал и методы

Для моделирования метастатического процесса использовали модифицированный метод с внутрикостным введением опухолевых клеток. В отличие от внутривенного введения, при внутрикостной инъекции моделируется полный цикл метастатического каскада, включая локальную инвазию, формирование первичного очага, гематогенное и лимфогенное распространение опухолевых клеток. При этом, в отличие от подкожной инокуляции, рост первичного очага происходит медленнее, в связи с чем не требуется травматичное для животного хирургическое удаление лапы с первичной опухолью. Кроме того, введение малого количества клеток меланомы не формирует иммунного ответа, и таким образом моделируется эффект опухолевого ускользания, который лежит в основе микрометастазирования [15].

Исследование проведено на мышах-самках линии C57Bl/6 массой 20–22 г, полученных из разведения ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» МЗ РФ. Метастатический процесс моделировали с использованием культуры клеток меланомы мышей B16F10 (ATCC® CRL6475™) второго культурального пассажа, полученной из криохранилища ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» МЗ РФ. Для приготовления суспензии опухолевых клеток культуру выводили из криоконсервации, затем монослой разрушали раствором Версена, отмывали в фосфатно-солевом буфере (PBS, phosphate buffered saline) без содержания кальция и магния, после чего осадок ресуспен-дировали в 1 мл PBS и проводили подсчет клеток в камере Горяева. Далее клетки ресуспендировали в 30 % растворе гиалуроновой кислоты на PBS. Пробирку со стандартизированной по количеству клеток суспензией помещали на холодную подложку (+5 °С) для дальнейшего отбора суспензии в индивидуальные шприцы для перевивки. Итоговая суспензия содержала 100 000 клеток/мл.

Для моделирования метастатического процесса был использован внутрикостный способ введения опухолевых клеток, описанный в работе [16]. Адаптация и модификация данного метода для получения легочных метастазов меланомы B16F10 подробно описаны в работе [17]. Мышей вводили в наркозный сон, помещая в камеру с подачей воздушной смеси изофлурана, далее в течение всего времени работы с животными наркозный сон поддерживали путем ингаляции 2 % воздушной смеси изофлурана через маску. После депиляции задней правой конечности в проксимальный эпифиз большеберцовой кости вводили подготовленную суспензию клеток в количестве 2 500 клеток в

25 мкл. Внутрикостное введение опухолевых клеток было выполнено 10 животным.

Лучевая визуализация животных методами КТ и ПЭТ была выполнена с помощью трехмодального доклинического томографа VECTor 6 (MILabs, Нидерланды). Во время всех видов сканирования животные находились в состоянии наркозного сна, вызванном 2 % воздушной смесью изофлурана.

КТ проводили всем 10 животным через 1 сут после внутрикостного введения клеток меланомы B16F10, затем через 7, 14, 21, 28, 35 сут. Каждому животному проводили сканирование в стандартном режиме «Accurate» (область сканирования – все тело мыши) и в режиме «Ultra Focus» (только область легких). Сканирование в режиме «Accurate» выполняли со следующими параметрами: напряжение на рентгеновской трубке 55 кВ, ток трубки 0,21 мА, время экспозиции на одну проекцию 75 мс, шаг угла поворота рентгеновской трубки 0,5° с получением 1 проекции на шаг, полученные изображения реконструировали с размером вокселя 0,2×0,2×0,2 мм. Сканирование в режиме «Ultra Focus» со следующими параметрами: шаг угла поворота рентгеновской трубки 0,15° с получением 2 проекций на шаг, изображения реконструировали с размером вокселя 0,08×0,08×0,08 мм, проводилось с синхронизацией с дыханием. Просмотр и постобработка изображений выполнялись в программе PMOD 4.205.

Через 35 сут после внутрикостного введения клеток меланомы по данным КТ были выбраны 3 мыши с наибольшей степенью поражения легких. Выбранным 3 животным было выполнено дополнительное КТ-сканирование в режиме «все тело» с контрастным усилением, после внутривенного введения 200 мкл препарата ОмнипакТМ 300 (йогексол, С[I]=300 мг/мл).

ПЭТ/КТ проводили 3 мышам, выбранным по данным КТ, через 38 сут после внутрикостного введения клеток меланомы. Мышам вводили внутривенно 18F-ФДГ в дозировке 90 ± 10 МБк в объеме 300 мкл, после чего выполняли динамическое ПЭТ-сканирование в виде 6 временных фреймов по 10 мин. Непосредственно по завершении ПЭТ выполнялось КТ-сканирование. Для реконструкции ПЭТ-изображений использовали энергетическое окно 511 ± 10% кэВ и коррекцию распада радионуклида на начало исследования.

В ходе постобработки изображений в программе PMOD 4.205 по данным КТ выбирали измеримые очаги, имеющие солидный характер роста. Для каждого очага измеряли линейные размеры, затем оконтуривали его границы на последовательных срезах томограммы (ручная сегментация) и определяли объем очага. По данным ПЭТ определяли активность в выделенном объеме, SUV_max (максимальный стандартизованный уровень накопления, maximum standardized uptake value) и SUV mean (средний стандартизованный уровень накопления, mean standardized uptake value).

Количественные показатели SUVmax по всем очагам, выявленным суммарно у 3 животных, были выражены в виде M ± SD, где M – среднее арифметическое по всем исследованным очагам; SD – стандартное отклонение. Затем очаги были разделены на «крупные» (≥1 мм3) и «мелкие» (<1 мм3), для каждой подгруппы очагов было отдельно вычислено SUVmax в формате M ± SD. Сравнение значений SUVmax между «крупными» и «мелкими» очагами выполняли с использованием двустороннего критерия Манна–Уитни для независимых выборок, так как каждый метастаз рассматривался как отдельная единица анализа. Различия считали значимыми при p<0,05.

Для SUVmean каждого очага изучалась динамика за 60 мин сканирования. Далее показатели для каждого временного фрейма были усреднены отдельно по группам «мелких» и «крупных» очагов, для каждой временной точки данные SUVmean представлены в виде M ± SD.

Для сравнения рентгеноплотности опухолевого узла на КТ-изображениях до и после введения контрастного средства использован парный t-тест, так как измерения выполнены на одних и тех же животных.

Морфологическое исследование всех 10 животных проводилось через 39 сут после внутрикостного введения опухолевых клеток. Вскрытие выполняли классическим методом по Абрикосову. После эвисцерации производили визуальный осмотр легких, фотофиксацию, затем легкие взвешивали и определяли их плавучесть (проба Галена). Оценивали состояние других внутренних органов и лимфатических узлов. Для детальной оценки количества и размеров сформировавшихся метастазов фотографии легких оценивали с использованием графического редактора ImageJ.

Результаты

В работе выполнено моделирование метастатического поражения легких мыши путем внутрикостного введения клеток меланомы B16F10. Первые признаки метастатического поражения по данным микроКТ определялись через 14 сут в виде единичных очагов у 6 животных из 10. Через 21–28 сут у 4 из этих 6 животных отмечалось увеличение размеров и/или числа очагов, а также появились единичные очаги еще у 2 мышей. Через 35 сут метастазы в легких отчетливо визуализировались у 8 животных из 10, число очагов составляло от 2 до 13 у каждой мыши (в среднем 6 ± 4) (рис. 1). Были выбраны 3 мыши с наибольшим числом метастазов (8, 9 и 13), которым на 38-е сут проведено динамическое ПЭТ/КТ-сканирование.

Суммарно у 3 животных по данным микроКТ области легких в режиме «Ultra Focus» выявлено 30 метастатических очагов, расцененных как измеримые – отграниченные от соседних структур, имеющие солидный характер роста, не распростра-

Рис. 1. КТ мыши с метастазами меланомы. Мультипланарная реконструкция, косой срез правого легкого: а – через 14 сут после внутрикостного введения опухолевых клеток; б – через 28 сут; в – через 35 сут. Красными кольцами выделены метастатические очаги. Примечание: рисунок выполнен авторами

Fig. 1. CT of a mouse with B16F10 melanoma metastases. Multiplanar reconstruction, oblique slice of the right lung: a – 14 days after intraosseous tumor cell injection; b – 28 days; c – 35 days. Metastatic foci are outlined with red rings. Note: created by the authors

Рис. 2. КТ (а, г), ПЭТ (б, д) и ПЭТ/КТ с 18F-ФДГ (в, е) мыши с метастазами меланомы B16F10. Аксиальный срез на уровне легких: а, б, в – мелкие очаги (объем <1 мм3) без активного накопления 18F-ФДГ; г, д, е – крупные очаги (объем ≥1 мм3) с активным накоплением 18F-ФДГ. Красными кольцами выделены метастатические очаги. Примечание: рисунок выполнен авторами

Fig. 2. CT (a, d), PET (b, e), and 18F-FDG PET/CT (c, f) of a mouse with B16F10 melanoma metastases. Axial slice at the lung level: a, b, c – small foci (volume <1 mm3) without active 18F-FDG uptake; d, e, f – large foci (volume ≥1 mm3) with active 18F-FDG uptake. Metastatic foci are outlined with red rings. Note: created by the authors

няющиеся диффузно вдоль кровеносных сосудов. Наименьший диаметр очагов, с уверенностью определяемых по данным КТ области легких в режиме «Ultra Focus», составлял 0,4 мм.

По всем 30 исследованным очагам значения SUVmax варьировали от 0,97 до 3,42, среднее значение – 2,01 ± 0,77. Для более детального анализа все измеренные очаги были разделены на «крупные» (≥1 мм3, n=9) и «мелкие» (<1 мм3, n=21). Для классификации очагов использован критерий объема, а не линейного размера, т.к. данный параметр является более надежным при измерении очагов неправильной формы. Среднее значение SUVmax для 9 крупных очагов составило 2,8 ± 0,6, а для 21 мелкого – 1,6 ± 0,5. Таким образом, показано, что более крупные очаги накапливают 18F-ФДГ активнее, чем мелкие (тест Манна–Уитни, p=0,016). Характерный вид «крупных» и «мелких» очагов представлен на рис. 2.

Для всех исследованных очагов проводилась оценка SUVmean в динамике за 60 мин сканирования. Для крупных метастазов была выявлена тенденция к накоплению 18F-ФДГ: признаки постепенного увеличения активности имели 7/9 (78%)

Рис. 3. Динамика изменения SUV mean в крупных (объем ≥1 мм³) и мелких (объем <1 мм³) метастатических очагах меланомы B16F10 в легких мышей.

Примечание: рисунок выполнен авторами

Fig. 3. Dynamics of SUV mean in large (volume ≥1 mm³) and small (volume <1 mm³) metastatic foci of B16F10 melanoma in mouse lungs. Note: created by the authors

Рис. 4. КТ (a), ПЭТ (б) и ПЭТ/КТ с 18F-ФДГ (в) мыши через 38 сут после внутрикостного введения меланомы B16F10. Розовым кольцом выделена первичная опухоль.

Примечание: рисунок выполнен авторами

Fig. 4. CT (a), PET (b) and 18F-FDG PET/CT (c) of a mouse 38 days after intraosseous injection of B16F10 melanoma. The primary tumor is outlined with a pink ellipse.

Note: created by the authors

крупных метастазов и лишь 4/21 (19%) мелких. Средние значения SUVmean по данным динамического сканирования, отдельно для крупных и мелких метастазов, представлены на рис. 3.

В первичном опухолевом узле по результатам ПЭТ/КТ у всех 3 животных отмечалось интенсивное накопление 18F-ФДГ c SUVmax 3,4 ± 0,7. Для более отчетливого отграничения первичного очага от здоровых тканей проведено КТ-сканирование с контрастным усилением (рис. 4). Введение контрастного средства привело к повышению рентгеноплотности опухолевой ткани от 73 ± 16 до 131 ± 23 HU (парный t-тест, p=0,004). По данным ПЭТ/КТ интенсивное накопление 18F-ФДГ присутствовало лишь в части объема опухоли, составляющей от 1/2 до 1/3 объема, остальная часть опухоли характеризовалась низкой метаболической активностью (рис. 4).

При макроскопическом морфологическом исследовании легких было подтверждено наличие метастатического поражения в виде единичных или множественных очагов (рис. 5). Суммарное число очагов, обнаруженных при вскрытии, было больше, чем при КТ-исследовании, за счет визуализации большого числа крайне мелких метастазов диаметром 0,15–0,35 мм (измерено по данным фотофиксации с помощью графического редактора ImageJ). Несмотря на то, что при вскрытии оценивались лишь субплевральные метастазы, а при КТ – весь объем легких, даже у мыши с наибольшим числом метастазов по данным КТ (13 очагов) при фотофиксации выявлено 27 очагов, из них 17 имели диаметр менее 0,4 мм и находились за пределами разрешающей способности КТ. Дополнительно при вскрытии у 2 животных обнаружены метастазы в лимфатические узлы забрюшинного пространства (рис. 5). Лучевая визуализация этих лимфатических узлов у лабораторной мыши невозможна из-за малого размера изучаемого объекта и низкого контрастного разрешения КТ.

Таким образом, методы лучевой диагностики закономерно уступают патологоанатомическому исследованию по абсолютной чувствительности. Однако ключевое преимущество лучевых методов заключается в возможности повторного прижизненного сканирования каждого животного в динамике, что принципиально недостижимо при использовании ex vivo подходов.

Обсуждение

В данном исследовании с помощью микроКТ были обнаружены метастазы в легких мыши, имеющие линейные размеры от 0,4 мм до 2,6 мм. Мелкие очаги, объемом до 1 мм3, не проявляли признаков активного накопления 18F-ФДГ. При этом первичная опухоль у всех исследованных животных содержала метаболически активную ткань, интенсивно накапливающую 18F-ФДГ. Ранее по данным гистологического анализа было дока-

Рис. 5. Макропрепарат:

а – легкие мыши со множественными метастатическими очагами меланомы B16F10; б – лимфатический узел с метастазом меланомы B16F10 (указан пинцетом). Примечание: рисунок выполнен авторами Fig. 5. Macroscopic specimen:

a – mouse lungs with multiple metastatic foci of B16F10 melanoma;

b – lymph node with B16F10 melanoma metastasis (indicated by forceps).

Note: created by the authors

зано, что развивающиеся после внутрикостного введения легочные очаги состоят из клеток меланомы, аналогичных клеткам первичного узла [17]. С учетом данного факта можно было бы ожидать сходного уровня метаболической активности, однако на практике этого не наблюдали.

Различия в уровне сигнала при ПЭТ-исследовании первичной опухоли и вторичных легочных очагов меланомы B16F10 могут быть рассмотрены как с физической, так и с биологической точки зрения. С биологической точки зрения снижение накопления 18F-ФДГ в легочных метастазах по сравнению с первичной опухолью описано в клинической практике для пациентов с метастазами не только меланомы, но и других злокачественных новообразований [8, 18]. Для меланомы B16F10 у мышей данный эффект выражен еще более отчетливо, что связано с отсутствием у данной линии мутации BRAF V600E, характерной для части случаев меланомы человека. Эта мутация связана с активацией сигнальных путей MAPK/ERK, усилением гликолитического метаболизма и развитием эффекта Варбурга [19].

В условиях роста солидной опухоли клетки меланомы B16F10 испытывают гипоксию, что приводит к активации HIF (фактора, индуцированного гипоксией) и переходу на гликолитический тип метаболизма [20]. Это сопровождается увеличением экспрессии переносчиков глюкозы (GLUT1, GLUT3) на поверхности клеток и повышением уровня гексокиназы в цитоплазме. Указанные изменения способствуют усиленному поглощению 18F-ФДГ, которая поступает внутрь клетки через глюкозные переносчики и фосфорилируется гек-сокиназой, после чего не может далее метаболизироваться и накапливается в клетке, обеспечивая высокий сигнал на ПЭТ [21]. Для мелких легочных метастазов у мышей характерно отсутствие выраженной гипоксии, вследствие чего клетки продолжают использовать окислительное фосфорилирование без перехода на гликолитический тип метаболизма. В результате такие очаги не демонстрируют значимого накопления 18F-ФДГ при ПЭТ-исследовании.

Физические ограничения также вносят вклад в снижение измеренного сигнала от метастатических очагов при ПЭТ. В очагах малого объема содержится крайне небольшое количество радиоактивных атомов, что приводит к низкому абсолютному уровню сигнала, даже если в ткани происходит активное накопление препарата. Существенным фактором также является эффект частичного объема (PVE, partial volume effect), который приводит к распределению истинного сигнала по нескольким вокселям изображения и его усреднению с сигналом от окружающей легочной ткани. Учитывая, что активность в легочной ткани близка к фоновой, измеряемая активность в метастатических очагах оказывается лишь незначительно выше фона, что затрудняет их визуализацию и количественную оценку [22].

Результаты настоящего исследования показали, что проведение ПЭТ не приводило к увеличению диагностической информативности по сравнению с КТ. Можно заключить, что для выявления и мониторинга метастатических очагов в легких у лабораторных мышей оптимальным методом является микроКТ. При технической возможности оптимально использование режима высокого разрешения («Ultra Focus»).

С другой стороны, КТ при исследовании первичного опухолевого узла обладает ограниченной информативностью. Опухолевая ткань на КТ-изображении имеет типичную рентге-ноплотность, характерную для мягких тканей, и неотличима от нормальной мышечной ткани конечности. Применение низкомолекулярных йодсодержащих контрастных средств (например, йогексола) обеспечивает умеренное контрастное усиление опухоли, позволяющее приблизительно определить ее границы, но не визуализировать внутреннюю структуру. Для детального изучения структуры первичной опухоли целесообразно использовать КТ с контрастным средством на основе наночастиц. Например, наночастицы золота, накапливаясь преимущественно в соединительной ткани, обеспечивают контрастирование фиброзных перегородок и позволяют оценить соотношение паренхиматозного и стромального компонентов [23]. Альтернативный вариант – комбинация модальностей ПЭТ/МРТ. Этот подход сочетает данные о метаболической активности, полученные методом ПЭТ, с высоким контрастным разрешением МРТ для мягких тканей, обеспечивая комплексную характеристику опухоли. Для реализации данного подхода возможно как использование гибридного томографа, так и сопоставление изображений, полученных отдельно на ПЭТ и МРТ сканерах, с помощью специализированного программного обеспечения [24].

Проведенные исследования показали возможность создания системы лучевой визуализации для оценки эффективности кандидатов на роль антиметастатических препаратов. Применение такой системы позволит проводить быстрый и воспроизводимый скрининг соединений, обладающих антиметастатическим действием, а также будет