Маркеры онкогенных вирусов в ранней диагностике злокачественных опухолей

НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН

Для подавляющего большинства спонтанных опухолей молекулярные механизмы запуска "онкогенной" программы клетки остаются неизвестными. Этот пробел может быть в значительной степени восполнен при изучении опухолей, индуцированных вирусами. При этом можно с достаточно высокой долей вероятности идентифицировать вирусный ген, стимулирующий процесс бесконтрольной пролиферации, и проследить путь передачи этого сигнала в клетке. Поэтому вопрос о роли вирусов в канцерогенезе представляется одним из наиболее актуальных не только для онкологии, но и для биоло-I гаи в целом.

Примечателен тот факт, что в развивающихся странах показатели заболеваемости вирус-ас-социироваиными неоплазиями примерно в три раза превышают таковые в странах с развитой экономикой, что свидетельствует о важной роли других факторов (возраст, социальные условия, этническая принадлежность, влияние окружающей среды и т.д.), принимающих участие в развитии этих заболеваний [23, 29].

Значение ВЭБ в формировании злокачественного фенотипа клеток лимфомы Беркитта и устойчивости их к апоптозу было недавно убедительно продемонстрировано J. Komano et al. [19]. Клоны клеток БЭБ-позитивной линии лимфомы Беркитта, не содержащие вирус, были повторно инфицированы. Как оказалось, эти клоны (в отличие от неинфицированных) были способны к росту в среде полужидкого агара и образованию опухолей in vivo, а также проявляли значительно большую резистентность к апоптозу, чем ВЭБ-негативные. На основании полученных данных авторы пришли к выводу, что для развития злокачественного фенотипа и устойчивости к апоптозу в клетках лимфомы Бер-киття необходимо постоянное присутствие ВЭБ.

Заболевания человека, ассоциированные с вирусом Эпштейна — Барр [2]

Заболевания

ВЭБ-ассоциированные случаи,%

Доброкачественная реактивная инфекция:

• •    Инфекционный мононуклеоз

• •    Волосатоклеточная лейкоплакия полости рта

Лпмфотранулсматоз (ЛГМ):

• •    ЛГМ, смешанно-клеточный

• •    ЛГМ, лимфоидного истощения

• •    ЛГМ, ассоциированный со СПИД

Неходжскинские лимфомы и новообразования, связанные с иммунодефицитом

• •    Неходжскинская лимфома, СПИД-ассоциироваипая

• •   Лимфома мозга, СПГГД-ассоциированиая

• •    Посттрансплантационные лимфопролиферации

• •   Лимфома Беркитта Африканская

• •   Лимфома Беркитта, Североамериканская

• •   Лимфома Беркитта, СПИД-ассоциированная

• •   Лимфома, первичный иммунодефицит

• •   Назальная T/NK-клеточная лимфома

• •   Лимфоидный гранулематоз (В-клетки)

Раки:

> 99,0

>99,0

70,0

50,0

> 95,0

40,0

95,0

95,0

>95,0

20,0

30,0

Большинство

>95,0

Большинство

>95,0 75,0

Большинство 10,0

Впервые нами в восточном регионе страны было изучено распространение вируса Эпштейна - Барр в различных популяциях уникального но численности и этническому разнообразию контингента малочисленных народов, населяющих данную территорию [9]. В итоге была не только выявлена циркуляция опухолсролных вирусов в популяциях Сибири и Дальнего Востока, но и установлены некоторые, важные для онкоэтшдемиологии, закономерности, а именно:

• 1)    титры антител к ВЭБ у жителей Заполярья повсеместно выше, чем у жителей Средней и Южной Сибири. Данное соотношение отсле-живаегся и у коренных жителей Севера, принад лежащих к популяции малочисленных народов, и у проживающих на севере европейцев, что сви детельствует об относительной инвариантности его по отношению к генотипическкм факторам;

• 2)    тенденция к нарастанию титров антител имеет направление с востока на запад - по на правлению от Чукотки к устью Оби, с макси мумом в Ханты-Мансийском национальном

округе (долготный эффект), и с юга на север (широтный эффект);

• 3)    онкологическая заболеваемость у корен ного населения в национальных округах выше, чем у пришлого; при этом, несмотря на высо кие титры антител к ВЭБ, какие-либо признаки учащения заболеваемости опухолями назофарингеальной локализации на Севере отсутствуют;

• 4)    высокие титры антител к вирусу ВЭБ, по вышенная, по сравнению с русским населени ем, онкологическая заболеваемость и снижение числа Т-лимфоцитов у коренных жителей Севе ра позволяют видеть в этих признаках "северную триаду", настораживающую в отношении возможности риска возникновения онкологической ситуации.

При обследовании больных, находившихся на лечении в клиниках НИИ онкологии ТШ СО РАМН, установлено повышение уровня антител к комплексу ранних антигенов вируса Эпштейна — Барр, связанному со способностью вируса вступать в литическую фазу инфекцион- ного процесса и вирусному капсидному антигену (ВКА), позднему продукту функции генома ВЭБ, при ряде локализаций опухолевого про-, цесса [9]. Так, в группе больных раком легкого уровни антител к вирусному капсидному антигену ВЭБ составили 219,4 против 38,7 у здоровых лиц; IgG-антител к комплексу ранних антигенов - 4,1 против 1,1 (р<0,001). У больных раком легкого более чем в половине случаев зарегистрированы аномально высокие (>1:320) титры IgG-антител к вирусному капсидному антигену ВЭБ, тогда как лишь у 2,8% здоровых лиц были отмечены соответствующие значения данного показателя (р=0,0001). Максимальное значение уровня IgG-антител к ВКА ВЭБ (332,6) показано при недифференцированном раке легкого, что в 1,3 раза превысило аналогичный показатель при аденокарциноме и в 1,9 раза — при плоскоклеточном раке. При этом уровни IgG-антител к комплексу ранних антигенов, более чем в 1,5 раза превышающие аналогичные показатели при плоскоклеточном и недифференцированном раке, отмечены у больных аденокарциномой. Так как имеются многочисленные наблюдения, свидетельствующие о высокой степени вероятности перехода хронических заболеваний верхних дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта в злокачественные, мы: сочли целесообразным провести вирусологическое обследование больных хроническими бронхитами с I диспластическими изменениями бронхиального эпителия и без них. При этом было установлено, что уровень ВЭБ-специфических антител у этой группы пациентов близок к таковому у больных раком легкого, превышая более чем в 5 раз аналогичные показатели у здоровых лиц. Нами были разработаны критерии, на основе которых сформирована группа динамического наблюдения. В нее вошли 37,9% обследованных больных хроническими бронхитами. В течение 3летнего срока наблюдения у 9,3% из них был диагностирован рак легкого, в то время как у больных, не попавших в группу риска, неоплазий не выявлено. Эти данные свидетельствуют о целесообразности применения ВЭБ-специфи-ческих серологических маркеров в качестве одного из критериев формирования групп повы-шейного риска по раку легкого.

Заключение об этиотропной роли вируса в том или ином злокачественном процессе требует, кроме выявления эпидемиологической ситуации, доказательств присутствия генетической информации вируса непосредственно в опухолевых клетках, выяснения механизмов, лежащих в основе злокачественной трансформации клеток, возможности их экспериментальной вирус-ассо-циированной малигнизации и способности вызывать развитие экспериментальных опухолей.

Методом полимеразной цепной реакции мы выявили генетическую информацию вируса Эпштейна—Барр в клетках опухолевой ткани 63% обследованных больных раком легкого ((^=18,3; р—0,0001). Геном вируса присутствовал также у 62% больных хроническим бронхитом (ХБ) с дис-пластическими изменениями бронхиального эпителия ((^=17,48; р-0,0001), 45% больных ХБ без дисплазии и лишь у 28% здоровых лиц.

Анализ генетических последовательностей ДНК ВЭБ у больных разными гистологическими формами опухоли показал присутствие генома вируса у 50% больных мелкоклеточным раком легкого и у 65,3% больших немелкоклеточным РЛ. При этом не выявлено существенных различий изученного показателя для больных с низко- и умереннодифференцированным плоскоклеточным раком легкого.

Определение вирусного материала методом ПЦР проводилось в ДНК, выделенной из образцов, состоящих не только из опухолевых клеток, но и из инфильтрирующих опухоль клеток хозяина (лимфоцитов, макрофагов). Таким образом, мы не можем однозначно утверждать о наличии ВЭБ только в опухолевых клетках. В этой связи на гистологических препаратах опухоли было проведено иммуногастохи-мическое исследование экспрессии ядерного антигена ВЭБ (EBNA, Epstein — Barr nuclear antigen) в ядрах эпителиальных клеток. У 34,73 % обследованных больных РЛ отмечена экспрессия ядерного антигена вируса Эпштейна — Барр, причем в среднем она была одинакова у больных с высокой и низкой степенью дифференцировки опухоли, а при умереннодифференцированной форме плоскоклеточного рака отмечалось снижение изученного показателя. Формирование метастазов достоверно увеличивало процент EBNA-позитивных больных (44,2% против 23,3 %, р<0,01).

Анализ полученных данных показал также высокую корреляционную зависимость между активностью гуморального ответа на литические белки (ВКА, РА) вируса Эпнгтейна — Барр и детекцией генетического материала вируса в опухолевых клетках бол-ьных раком легкого, что указывает на реактивацию ВЭБ у этих больных. Полученные данные делают актуальным исследование роли ВЭБ в этиопатогенезе рака легкого.

Онкогенные вирусы и рак шейки матки

Вопрос о вероятных взаимосвязях между инфицированностью вирусом Эпштеина — Барр и риском малигнизации эпителия шейки матки изучается уже более 10 лет, при этом БЭБ обнаруживается у значительного числа (18-38%) пациенток соответствующего профиля [4, 8].

Следует отметить, что роль ВЭБ как фактора развития цервикальной патологии должна рассматриваться, прежде всего, в аспекте вирусного канцерогенеза. Не исключено, например, что инфицирование лимфоцитов вирусом Эп-штеина — Барр ведет к нарушениям локального противоопухолевого иммунного ответа, что на фоне папилломатозной инфекции облегчает ви-русиндуцированный процесс малитнизации цервикального эпителия [7]. Тем не менее вопрос об этиологической роли ВЭБ в развитии цервикальной дисплазии подлежит дальнейшему изучению,

После того как в середине 70-х гг. прошлого века было высказано предположение, что вирусы папиллом человека (HPV, humam papilloma virus) являются этиологическим агентом рака шейки матки, эта обласгь онкологии и вирусологии получила стремительное развитие. Были получены бесспорные доказательства этиологической роли HPV при данной форме рака, что окончательно подтверждено пресс-релизом ВОЗ от 3 июля 1996 г. Действительно, к настоящему моменту роль HPV в патогенезе рака шейки матки не вызывает сомнений [25]. Многочисленные исследования последних лет доказали, что не менее 95% неоплазий шейки матки содержат разновидности HPV, принадлежащие к так называемым типам "высокого риска" (HPV16, 18, 31, 33, 45 и т.д.). Более того, многие специалисты склонны относить редкие случаи HPV-негативных PIIIM скорее к диагностическим артефактам, чем к биологической разновидности заболевания. Папилломавирусы человека — семейство эпителиотропных ДНК-содер-жащих вирусов, включающее в себя более 75 типов и 120 изолятов. Среди них максимальной онкогенной активностыо обладают HPV 16/ 18, ассоциированные с развитием у человека таких опухолей, как рак шейки матки, верхней части глотки, области головы и шеи, кожи и, возможно, пищевода [14, 29]. Несмотря на высокую потенциальную опасносгь, цапилломавиру-сы являются условно патогенными агентами. Действительно, HPV достаточно часто (примерно в 10-30%) выявляются у абсолютно здоровых женщин. Таким образом, носительство этих вирусов свидетельствует не о злокачественном процессе как таковом, а о многократно повышенном риске его возникновения. Факторы, модифицирующие патогенностъ HPV и, как следствие, провоцирующие опухолевый рост у инфицированных женщин, неизвестны [27].

Диагностика HPV-инфекции обладает очень высокой клинической значимостью. Она позволяет выявить тех пациенток, для которых жизненно необходимы активные, комплексные меры, направленные на профилактику и раннюю диагностику РШМ, Большинство существующих в настоящее время технических подходов для выявления HPV основаны на высокоразрешающем методе — полимеразной цепной реакции [24].

Сотрудниками НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН впервые проведено изучения инфицированности онкогенными типами (HPV 16/18) вируса папилломы человека женского населения Томска и Томской области, Всего было обследовано более 1000 женщин. Частота папилломавирусной инфекции онкогенных типов (HPV-16/18) составила около 15%. Наиболее часто среди онкогенных вирусов наблюдался HPV1,8, который обнаружен в 72,2%, гораздо реже отмечалось наличие как HPV 16 (16,5%), так и смешанного инфицирования (11,3%). Комбинация ПЦР-метода с цитологическим и кольпоскопическим обследованием значительно повышает эффективность выявления патологических изменений шейки матки. На основе полученных нами данных разработан алгоритм ранней диагностики вирус-позитивного рака шейки матки у вирусоносителей онкогенных типов HPV-инфекции [5].

Папилломавирусы "высокого риска" (16, 18, 31, 33 и 45-й типы) часто ассоциированы и с инвазивной карциномой ротовой полости, оро фарингеальной области, глотки и носовой полости. Так, ДНК HPV16 обнаруживают в 31— 68% случаев плоскоклеточной карциномы [28], 19% - карциномы гипофарингса, 38% - орофа-рингса, 10% — назофарингса и в 8 — 47,6% при раке глотки [17, 22]. Типирование вируса в клетках карциномы гортани показало присутствие генетической информации HPV 6/11,16/18 31/ 33 в 8, 40 и 30% случаев, соответственно. Авторы сходятся во мнении, что вирус папилломы является этиологическим фактором малигниза-ции слизистой гортани.

В перспективе вопрос о механизмах вирусного канцерогенеза сконцентрируется, вероятно, на изучении онкогенных потенций уже известных и вновь открываемых вирусов и их генов, ключевых белков систем передачи сигналов в инфицированных вирусом клетках, выявлении ко-факгоров, необходимых для реализации онкогенных свойств вируса, идентификации трансформирующих вирусных белков, на анализе взаимоотношений вируса с иммунной системой хозяина, поиске удобных и чувствительных моделей in vivo и in vitro и др. В то же время уже сейчас можно с уверенностью сказать, что серологические и молекулярно-биологические маркеры ряда известных онкогенных вирусов очень важны как для диагностики определенных новообразований человека, так и для оценки эффективности проведенной терапии и прогнозирования клинического течения заболевания.