МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СОСТАВА ЛЕТУЧИХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, ВЫДЕЛЯЕМЫХ РАЗЛИЧНЫМИ ВИДАМИ ГРИБОВ РОДА LECANICILLIUM

А. Г. Кузьмин; Ю. А. Титов; Г. В. Митина; А. А. Чоглокова; A. G. Kuzmin; Yu. A. Titov; G. V. Mitina; A. A. Choglokova

doi:10.18358/np-31-4-i7178

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СОСТАВА ЛЕТУЧИХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, ВЫДЕЛЯЕМЫХ РАЗЛИЧНЫМИ ВИДАМИ ГРИБОВ РОДА LECANICILLIUM

Автор: А. Г. Кузьмин, Ю. А. Титов, Г. В. Митина, А. А. Чоглокова

Журнал: Научное приборостроение @nauchnoe-priborostroenie

Рубрика: Приборостроение для биологии и медицины

Статья в выпуске: 4 т.31, 2021 года.

Бесплатный доступ

Впервые изучен с помощью квадрупольного масс-спектрометра количественный и качественный состав летучих органических соединений (ЛОС), выделяемых штаммами различных видов энтомопатогенных грибов (ЭГ) рода Lecanicillium, применяемых в качестве альтернативы химическим пестицидам для защиты растений от вредителей. Основными обнаруженными компонентами газовой фазы над мицелием ЭГ на 10-й день роста на агаризованной среде Чапека были диоксид углерода (5–20%), кислород (0.1–15%), ацетон (0.2–12 ppm), пентан (до 0.5 ppm), уксусная кислота (до 0.15 ppm). Ацетон и пентан были обнаружены в составе ЛОС всех изученных штаммов, уксусная кислота — у 5 штаммов, принадлежащих к разным видам, у других штаммов она появлялась только через больший промежуток времени или полностью отсутствовала. Среди ЛОС некоторых штаммов были обнаружены в небольших количествах такие вещества, как гексилацетат, сернистый газ. Эти вещества могут отвечать за патогенные и репеллентные свойства изученных грибов в отношении фитофагов.

Еще

Масс-спектрометрия, анализ летучих органических соединений, энтомопатогенные грибы

Короткий адрес: https://sciup.org/142230398

IDR: 142230398 | УДК: 543.612/621/684, 632.937.3 | DOI: 10.18358/np-31-4-i7178

MASS SPECTROMETRIC STUDIES OF THE COMPOSITION OF VOLATILE ORGANIC COMPOUNDS RELEASED BY VARIOUS FUNGAL SPECIES OF GENUS LECANICILLIUM

For the first time, the quantitative and qualitative composition of volatile organic compounds (VOCs), released by strains of various species of entomopathogenic fungi (EF) of the genus Lecanicillium, was studied using a quadrupole mass spectrometer. Lecanicillium fungi are used as an alternative to chemical pesticides for plant protection. The main detected components of the gas phase over the EF mycelium on the 10th day of growing on the agar Czapek's medium were carbon dioxide (5–20%), oxygen (0.1–15%), acetone (0.2–12 ppm), pentane (up to 0.5 ppm), acetic acid (up to 0.15 ppm). Acetone and pentane were found in the VOCs of all studied strains, acetic acid — in 5 strains belonging to different species, in other strains it appeared after a longer period of time, or was absent completely. Among the VOCs of some strains, substances such as hexyl acetate, sulfur dioxide were found in small quantities. These substances may be responsible for the pathogenic and repellent properties of the studied fungi with respect to phytophages.

Еще

Текст научной статьи МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СОСТАВА ЛЕТУЧИХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, ВЫДЕЛЯЕМЫХ РАЗЛИЧНЫМИ ВИДАМИ ГРИБОВ РОДА LECANICILLIUM

Проблема повышения эффективности производства экологически чистой продукции в России и за рубежом особенно актуальна в замкнутых системах защищенного грунта. Использование микробиологической и биологической защиты растений является необходимой альтернативой химическим инсектицидам в связи с развитием резистентности фитофагов к инсектицидам и негативным влиянием остаточных количеств инсектицидов на окружающую среду и здоровье человека. Однако потенциал энтомопатогенных грибов (ЭГ) не реализуется полностью. Трудности, связанные с применением ЭГ, возникают из-за недостаточной изученности взаимного влияния многокомпонентных систем, включающих патогены, целевых и нецелевых хозяев и растения. Сведения о составе летучих органических соединений (ЛОС) энто-мопатогенных грибов и их влиянии на членистоногих, по данным литературы, весьма ограничены. В литературе [1] проведен сравнительный анализ ЛОС некоторых видов ЭГ, в результате которого показано, что они отличались по количественному и качественному составу: доминирующими среди них были эфиры, кислоты и терпеноиды.

Несмотря на то что грибы рода Lecanicillium широко распространены в природе как важнейшие регуляторы численности насекомых отряда Hemip-tera и клещей и более 30 лет используются в каче- стве продуцентов биопрепаратов, только недавно начато изучение влияние ЛОС мицелия и спор грибов этого рода на поведенческие реакции своих хозяев. Установлено, что споры и мицелий могут проявлять репеллентные или нейтральные свойства в зависимости от вида гриба [2].

Состав ЛОС, выделяемых различными видами и штаммами этих грибов, практически не изучен, хотя такие данные могут быть полезными как дополнительный инструмент при идентификации филогенетически близких, а также новых описанных видов. Поскольку состав ЛОС может быть разнообразным, а ожидаемые концентрации компонентов ЛОС не превышают единиц ppm, то для их изучения необходимо использовать неселективные аналитические методы с очень высокой чувствительностью. Оптимальным методом для высокочувствительного анализа состава ЛОС является масс-спектрометрия.

ЭКСПЕРИМЕНТ

Для изучения количественного и качественного состава основных летучих органических соединений (ЛОС), выделяемых штаммами различных видов грибов рода Lecanicillium , в данной работе применялся метод прямого газового масс-спектрометрического анализа. В качестве анализатора использовался разработанный в ИАП РАН

Табл. 1. Концентрации основных ЛОС на десятый день после посева

Штамм №	Вид	O 2 , %	CO 2 , %	Ацетон, ppm	Уксусная кислота, ppm
Vl 5	L. lecanii	0.1	19.8	0.65	0.00
Vl 21	L. muscarium	1.5	21.2	11.66	0.00
Vl 72	L. muscarium	7.3	14.8	0.43	0.15
Vl 78	L. psalliotae	1.1	17.9	2.78	0.07
8057	L. pissodis	4.5	15.9	0.27	0.05

малогабаритный квадрупольный масс-спектрометр с прямым капиллярным вводом пробы и ионизацией электронным ударом МС7-200, который нашел широкое применение для анализа состава выдыхаемого человеком и животными воздуха, а также состава различных газовых сред [3–7]. Данный прибор позволяет производить анализ ЛОС в диапазоне массовых чисел 1–200 а.е.м., имеет разрешающую способность 1 а.е.м., чувствительность по отдельным компонентам 50– 500 ppb. Ввод пробы осуществляется через прогреваемый капилляр длиной 3 м. Расход пробы составляет 1–2 мкл/с. Вес прибора 13 кг.

Методика исследования ЛОС, выделяемых различными штаммами ЭГ, была реализована следующим образом.

1. Культивирование ЭГ производилось в стеклянных хроматографических виалах емкостью 20 мл. Питательную среду Чапека с агаром разливали стерильно по 5 мл в виалы и фиксировали их под углом 30° к горизонтали. После застывания среды виалы засевались свежими десятисуточными культурами ЭГ и с не полностью прикрытыми крышками (чтобы культура могла дышать) выдерживались в термостате в течение 9 суток при 27 °С.
2. На десятые сутки крышки виал со штаммами герметично закрывались для того, чтобы в объеме накапливалось достаточное количество ЛОС в течение 24 ч.
3. Для ввода газовой пробы в масс-спектрометр на конец капилляра системы ввода герметично устанавливалась игла медицинского шприца.
4. Далее мембрана крышки виалы герметично протыкалась этой иглой и производился анализ состава ЛОС в режиме on-line, без проникновения в виалу атмосферного воздуха. После удаления иглы мембрана восстанавливала герметичность, и культура могла использоваться для последующих измерений.
5. Анализ производился в двух режимах чувствительности: стандартном — определение концен-
траций компонентов О2 и СО2 на уровне единиц процентов, и повышенном — определение низких концентраций ЛОС на уровне единиц ppm.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Всего за время исследований было проанализировано 13 штаммов, принадлежащих к 7 видам грибов рода Lecanicillium из коллекции патогенных микроорганизмов ФГБНУ ВИЗР (WFCC WDCМ № 760, УНО). Среди них отдельные штаммы (ARSEF 2332 и ARSEF 8057) получены из ARSEF-коллекции энтомопатогенных грибных культур USDA-ARS (США). Штаммы выращивались периодически в течение года, и для каждого штамма производился анализ выделяемых ЛОС до тех пор, пока субстанция не высыхала.

Типичный состав компонентов ЛОС для 6 штаммов (измерения 20.09.2020) представлен в табл. 1. Основными обнаруженными компонентами газовой фазы над мицелием ЭГ были диоксид углерода (14.8–21.2%), кислород (0.1–7.5%), ацетон (0.2–12 ppm), уксусная кислота (до 0.15 ppm).

За весь период измерений было обнаружено, что все образцы штаммов в процессе жизнедеятельности потребляли кислород и выделяли углекислый газ, но с разной интенсивностью. Кроме того, во всех образцах был обнаружен ацетон в разных концентрациях (в диапазоне 0.2–12 ppm).

В табл. 2 приведены результаты серии измерений ЛОС для всех штаммов на 10, 17 и 21-й дни после посева 28.10.2020. При этом с целью повышения достоверности результатов измерений посев каждого штамма производился в две идентичные виалы. Концентрации кислорода и диоксида углерода выражены в процентах (%), а уксусной кислоты и ацетона в ppb.

В этой серии измерений штаммы ЭГ одного вида имели схожие тенденции в изменении со временем газового состава в виалах. Так, например, измерения

Табл. 2. Концентрации основных ЛОС на десятый, семнадцатый и двадцать первый день после посева

Вид	5 a	Количество дней после посева
		10				17				21
		Компоненты ЛОС
		O 2	CO 2	ацетон	уксус	O 2	CO 2	ацетон	уксус	O 2	CO 2	ацетон	уксус
		%		ppb		%		^p	b	%		ppb
L. lecanii	Vl 5	10.5	7.9	400	120	13.0	5.3	360	120	0.1	14.2	500	0
L. lecanii	Vl 5-1	7.7	10.0	450	90	11.3	6.2	400	80	0.1	14.1	550	0
L. longisporum	Vl 13	0.3	17.5	570	0	9.5	9.3	440	210	0.1	14.1	510	0
L. longisporum	Vl 13-1	0.1	18.1	570	0	9.2	9.6	440	240	0.4	14.2	540	0
L.muscarium	Vl 21	0.1	16.5	520	0	20.5	0.2	150	60	20.6	0.3	250	0
L.muscarium	Vl 21-1	2.4	14.6	510	0	20.7	0.2	150	0	20.6	0.2	340	0
L. lecanii	Vl 29	0.1	16.8	510	0	7.6	10.2	400	130	0.2	13.2	400	0
L. lecanii	Vl 29-1	0.1	17.5	510	0	6.5	10.9	440	90	0.1	14.1	460	0
L. muscarium	Vl 61	15.3	5.1	220	120	15.0	4.0	340	110	0.1	12.6	480	0
L. muscarium	Vl 61-1	13.5	5.4	360	150	15.9	3.7	370	100	2.9	11.5	470	0
L. attenuatum	Vl 71	0.1	20.4	570	0	0.5	16.1	500	0	0.2	15.8	480	0
L. attenuatum	Vl 71-1	0.1	19.1	550	50	14.5	4.0	350	100	0.1	13.3	490	0
L. muscarium	Vl 72	8.8	9.7	250	90	11.2	6.8	300	110	0.1	15.0	540	0
L. muscarium	Vl 72-1	10.1	9.5	420	140	13.1	5.9	320	130	0.1	14.8	440	0
L. psalliotae	Vl 78-1	0.2	15.7	480	0	14.4	2.6	740	90	0.1	11.2	410	0
L. psalliotae	Vl 78-2	0.1	16.2	610	0	14.6	2.2	880	80	0.1	11.6	550	0
L. dimorphum	Vl 79	2.2	15.1	530	0	11.0	6.6	400	120	0.1	12.1	420	0
L. dimorphum	Vl 79-1	1.2	15.5	500	0	11.3	5.9	410	110	0.1	11.0	440	0
L. attenuatum	Vit 117	0.1	17.7	440	0	0.1	14.5	520	0	0.2	14.6	560	0
L. attenuatum	Vit 117-1	0.1	17.0	520	0	10.2	6.6	310	90	0.1	13.2	550	0
L. dimorphum	2332	0.1	17.4	550	0	6.1	9.1	390	0	0.1	14.9	550	0
L. dimorphum	2332-1	0.1	18.0	520	0	7.1	8.5	380	70	0.1	13.8	600	0
L. pissodis	8057	8.8	10.1	310	100	12.8	5.6	320	130	0.2	13.3	510	0
L. pissodis	8057-1	4.3	13.1	490	50	12.2	6.1	360	110	0.1	13.4	510	0
L. lecanii	F2	1.2	17.5	500	0	15.3	4.0	280	90	0.1	13.0	480	0
L. lecanii	F2-1	0.1	20.5	550	0	14.3	4.2	310	100	0.1	11.8	460	0

концентраций кислорода и ацетона для видов L. attenuatum , L. Dimorphum , L. muscarium показали сильные вариации. Значения концентрации кислорода в разные дни были от 0 до 20% (средний уровень порядка 10%), а концентрации ацетона могли варьировать в пределах от 200 ppb до 550 ppb. Это говорит о том, что во время измерений штаммы росли с переменной скоростью. Для штаммов видов L. longisporum, L. psalliotae , L. pissodis картина разброса данных была аналогичной.

Представленные данные также свидетельствуют о нерегулярности выделения ЛОС разными штаммами, поскольку результаты измерений не показали монотонных изменений концентрации ЛОС со временем.

Помимо основных компонентов (углекислый газ, ацетон), у некоторых штаммов были выявлены специфические ЛОС. Так, например, у всех трех штаммов (Vl 5, Vl 29, F2) вида L. lecanii , кроме

Рис. 1. Масс-спектр ЛОС штамма Vl 5 L. lecanii

Рис. 2. Масс-спектр ЛОС штамма Vl 21 L. muscarium

ацетона, были обнаружены пентан, гексанал, гексилацетат, этилацетат и сернистый газ. Масс-спектр ЛОС образца Vl 5 представлен на рис. 1. Те же компоненты, но в других концентрациях, были обнаружены у штамма Vl 21 вида L. muscarium , при этом наблюдалась также еще уксусная кислота (рис. 2).

Некоторые перечисленные ЛОС, такие как пентан, ацетон и уксусная кислота, как правило, наблюдались также в опубликованных ранее другими авторами экспериментальных данных хроматомасс-спектрометрических исследований ЛОС фитопатогенного гриба Fusarium culmorum [8]. Однако в наших измерениях в ряде образцов впервые был обнаружен сернистый газ, который может быть активным репеллентом для насекомых.

ВЫВОДЫ

Таким образом, можно сделать вывод, что большинство штаммов выделяют преимущественно ацетон с разной интенсивностью, наблюдаются пентан, уксусная кислота, а также для некоторых штаммов был обнаружен ряд не наблюдавшихся ранее ЛОС, таких как гексилацетат, сернистый газ.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект № 20-016-00241.

Измерения состава ЛОС энтомопатогенных грибов проводились в ИАП РАН на масс-спектрометре МС7-200 собственной разработки .

Список литературы МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СОСТАВА ЛЕТУЧИХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, ВЫДЕЛЯЕМЫХ РАЗЛИЧНЫМИ ВИДАМИ ГРИБОВ РОДА LECANICILLIUM

1. Bojke A., Tkaczuk C., Stepnowski P., Gołębiowski M. Comparison of volatile compounds released by entomopathogenic fungi // Microbiological Research. 2018, Vol. 214. Р. 129–136. DOI: 10.1016/j.micres.2018.06.011
2. Митина Г.В., Степанычева Е.А., Чоглокова А.А. Влияние разных видов энтомопатогенных грибов рода Lecanicillium на поведенческие реакции и выживаемость оранжерейной белокрылки Trialeurodesvaporariorum // Вестник защиты растений. 2020. Т. 103, вып. 4. С. 265–268. DOI: 10.31993/2308-6459-2020-103-4-13466
3. Кузьмин А.Г., Ткаченко Е.И., Орешко Л.С., Титов Ю.А., Балабанов А.С. Метод масс-спектрометрической экспресс-диагностики по составу выдыхаемого воздуха // Медицинский академический журнал. 2016. Т. 16, № 4. С. 106–107.
4. Manoilov V.V., Kuzmin A.G., Titov U.A. Extraction of information attributes from the mass spectrometric signals of air // Journal of Analytical Chemistry. 2016. Vol. 71, no. 14. P. 1301–1308. DOI: 10.1134/S1061934816140094
5. Шевченко А.Н., Кузьмин А.Г., Титов Ю.А. Массспектрометрическое измерение состава газовых смесей в ячейках квантового датчика вращения // Научное приборостроение. 2018. Т. 28, № 2. С. 62–68. URL: http://iairas.ru/mag/2018/abst2.php#abst9
6. Новиков Л.В., Манойлов В.В., Кузьмин А.Г., Титов Ю.А., Заруцкий И.В., Нефедов А.О., Нефедова А.В., Арсеньев А.И. Экспресс диагностика заболеваний по выдыхаемому воздуху на основе квадрупольного масс-спектрометра // Научное приборостроение. 2020. Т. 30, № 4. С. 94–105. URL: http://iairas.ru/mag/2020/abst4.php#abst10
7. Кузьмин А.Г., Титов Ю.А., Суворов Н.Б., Куропатенко М.В. Масс-спектрометрические исследования динамики состава выдыхаемого воздуха в процессе динамических постуральных воздействий // Научное приборостроение. 2020. Т. 30, № 4. С. 84–94. URL: http://iairas.ru/mag/2020/abst4.php#abst9
8. Савельева Е.И., Гаврилова О.П., Гагкаева Т.Ю. Исследование состава летучих органических соединений, выделяемых микроскопическим грибом fusariumculmorum, методом газовой хроматомассспектрометрии в сочетании с твердофазной микроэкстракцией // Экологическая химия. 2014. Т. 23, № 2.С. 110–118.

Еще