Масс-спектрометрия с мягкими методами ионизации в токсикологическом анализе (обзор)

В последние десятилетия масс-спектрометрия с мягкими методами ионизации является одним из наиболее интенсивно развивающихся методов анализа. Этот метод отличается высокой чувствительностью, что позволяет его использование во многих областях, касающихся биохимии и протеомики человека, в том числе и токсикологии. Ряд токсикологических задач, в которых масс-спектрометрия может являться основным или даже единственным средством решения, весьма широк, и в последнее время особое внимание уделяется такой значимой области, как поиск биомаркеров интоксикации [1]. Термин "биомаркер" включает в себя представление о результате взаимодействия биологической системы с агентом окружающей среды и используется для обозначения биологических, биохимических и молекулярных свидетелей, которые могут быть измерены с помощью химических, биохимических или молекулярных технологий. В случае интоксикации биомаркеры должны присутствовать в легкодоступных тканях, таких как кровь, клетки ротовой полости или моча [1] и по возможности могли бы быть достаточно легко выделены и определены.

Одно из многих преимуществ масс-спектрометрии с мягкими методами ионизации состоит в том, что для успешного детектирования искомого соединения, выступающего в роли биомаркера, не всегда необходимо выделять его из смеси остальных веществ, составляющих биологический образец или же подвергать дериватизации. Особенно это касается метода ионизация лазерной десорбцией в присутствии матрицы (Matrix-Assisted Laser Desorbtion/Ionization, MALDI). Этот метод на сегодняшний день является наиболее широко используемым для анализа высокомолекулярных соединений, в особенности белков, но также хорошо подходит и для детекции соединений, имеющих среднюю и низкую с точки зрения протеомики молекулярную массу (600–5000 Да). К основным преимуществам метода MALDI можно отнести низкую чувствительность к засоленности анализируемой пробы, высокий предел определения по молекулярной массе (400–500 кДа), реализацию быстрого анализа большого количества образцов, достаточно легкую интерпретируемость масс-спектра, а также возможность точечного МS/МS анализа соединений, представляющих интерес в ключе проводимого исследования, без получения лишнего фактического материала. В то же время при использовании данного метода могут возникнуть проблемы с определением биомаркеров, являющихся органическими молекулами и имеющими невысокую молекулярную массу (100– 400 Да), поскольку соответствующий диапазон масс в спектре обычно заселен сигналами, привнесенными матрицей. Кроме того, при анализе биологических образцов зачастую возникает перекрывание сигналов спектра за счет близкого значения масс соединений, содержащихся в пробе, что значительно усложняет интерпретацию данных и корректный МS/МS-анализ каждого из этих соединений. Для анализа таких образцов более удобен масс-спектрометр, снабженный таким источником ионов, как электроспрей (Electrospray Ionization, ESI), несмотря на то что данный метод имеет свои ограничения, например ограничение по массе анализируемого вещества (~20 кДа). Также следует отметить, что одним из основных требований к образцу при использовании данного метода анализа является растворимость соединений в воде и отсутствие в пробе солей или других примесей в концентрациях, превышающих концентрацию искомого биомаркера более чем на два порядка. Соответственно для проведения успешного масс-спектрометрического анализа требуется дополнительная стадия пробоподготовки — обессоливание. К тому же из-за образования многозарядных ионов в процессе ионизации регистрируемый масс-спектр становится гораздо более сложным для восприятия, чем в случае MALDI, и для его обработки требуется привлекать дополнитель- ные программные ресурсы. Но несмотря на перечисленные недостатки метод ионизации "электроспрей" является не менее широко используемым, чем MALDI, поскольку масс-спектрометр, оснащенный таким источником ионов, может быть соединен с жидкостным хроматографом, в результате чего происходит дополнительное фракционирование компонентов пробы непосредственно перед анализом, и дает возможность осуществлять потоковый МS/МS-анализ. Дополнительным преимуществом этого метода также является отсутствие заселенности диапазона низких масс, и биомаркеры, имеющие низкую молекулярную массу, могут быть успешно проанализированы.

Таким образом, в представляемом обзоре будут продемонстрированы возможности масс-спектрометрии с мягкими методами ионизации для поиска и идентификации биомаркеров интоксикации различными высокоопасными отравляющими веществами (ОВ), относящимися к химическому оружию.

Конвенция о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия (далее Конвенция) [2], которая стала международным законом 29 апреля 1997 г., является одним из наиболее комплексных и всеобъемлющих договоров по разоружению и контролю над вооружениями. Контроль за выполнением Конвенции возложен на Организацию по запрещению химического оружия (ОЗХО). Основные рекомендуемые ОЗХО процедуры в идентификации веществ, находящиеся в приложении к Конвенции, основываются на поиске самих веществ или продуктов их деструкции в окружающей среде и биопробах методами GC-MS (газовая хроматография—масс-спектрометрия) и LC-MS (высокоэффективная жидкостная хроматография—масс-спектрометрия).

Конец 20 и начало 21 века характеризуются возрастающей угрозой терроризма, и в частности возможности применения особо опасных химических веществ в террористических целях. В настоящее время считавшиеся ранее незначительными в военном отношении количества химикатов могут оказаться эффективными средствами уничтожения в случае их применения в местах массового скопления людей. Применение химического оружия в террористических целях имело место в 1995 г. в Японии. С того времени, когда секта "Аум Синрикё" произвела и применила зарин в населенном пункте и в метро, ранив сотни людей и убив двенадцать пассажиров метро, повторения подобной атаки, к счастью, не было. Тем не менее вызывают тревогу сообщения о попытках произвести либо накопить отравляющие вещества, которые могут быть использованы отдельными лицами или группами лиц в террористических целях.

К отравляющим веществам (ОВ), оборот кото- рых находится под контролем Конвенции, относятся вещества различного спектра действия. К ним относятся вещества нервно-паралитического действия, получившие названия по международной классификации, как G-агенты (GA-табун, GB-зарин, GD-зоман, GF-циклозарин) и V-агенты (вещества VX и VR) и являющиеся эфирами кислот пятивалентного фосфора (фосфорорганическими веществами, ФОВ). Большинство этих агентов родственны фосфорорганическим пестицидам и ингибируют активность ацетилхолинэсте-разы (АХЭ), важнейшего фермента нервномышечной передачи, контролирующего нейротрансмиттер ацетилхолин. К веществам кожнонарывного действия относятся алкилирующие агенты, такие как сернистый и азотистый иприты и люизит. Эти вещества менее токсичны, чем ФОВ, но также контролируются Конвенцией.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОВ И ПРОДУКТОВ ИХ ДЕСТРУКЦИИ МЕТОДАМИ LC-MS

Отравляющие вещества, попадающие в организм, могут быть выявлены в биологических образцах в виде продуктов их деструкции, метаболитов или же в неизменной форме. В большинстве случаев образуются полярные продукты, которые могут быть проанализированы с помощью масс-спектрометра с источником ионизации "электроспрей" без дополнительной дериватизации и трудоемкой пробоподготовки. В последние годы метод LC-MS находит все более широкое применение в области анализа ОВ, постепенно вытесняя общепринятый GC-MS-анализ [3].

Впервые возможности использования LC-MS для анализа продуктов деструкции были показаны на примере нервно-паралитических газов [4, 5]. Важное преимущество LC-ESI-MS состоит в том, что данный метод позволяет идентифицировать интактные ФОВ одновременно с продуктами их деструкции [6–8], например алкилфосфоновые кислоты, образующиеся в процессе гидролиза различных ФОВ. Однако необходимо отметить, что сернистый иприт в нативной форме не определяется этим методом, но продукты его деструкции — тиодигликоль и длинноцепочечные диолы — являются подходящими объектами для анализа методом LC-ESI-MS. Основные соединения, определяемые методами масс-спектрометрии, представлены в таблице [9–14].

Несмотря на то что описанный метод очень удобен для использования, он имеет значительные ограничения, т. к. ОВ и их метаболиты достаточно быстро выводятся из организма. То есть возможность установления факта интоксикации по перечисленным соединениям существует только несколько дней.

Использование масс-спектрометрии с мягкими методами ионизации для выявления маркеров интоксикации ОВ

Среда	Вид ионизации	Условия хроматографического анализа	Анализируемые соединения	Ссылка
Плазма крови	APCI (PI)	Сорбент — [–OD –H]; колонка — 250 × 4.6 мм; элюент — гексан/изопропанол; режим элюирования — изократический; скорость потока — 800 мкл/мин	Энантиомеры RVX	[9]
Сыворотка крови	ESI (PI), MALDI	Сорбент — [–С 18 ]; колонка — 150 × 0.30 мм; элюент — ацетонитрил/вода с 0.2 % муравьиной кислотой; режим элюирования — градиентный; скорость потока—– 6 мкл/мин	Аддукты альбумина с сернистым ипритом	[10]
Сыворотка крови	ESI (PI/NI)	Сорбент — [–С 18 ]; колонка — 150 × 1.5 мм; элюент — ацетонитрил/вода с 0.005 М ацетатом аммония; режим элюирования — изократический; скорость потока — 100 мкл/мин	Производные алкилфосфоновой кислоты	[11]
Сыворотка крови	ESI (PI/NI)	Сорбент — [–PRP–X100]; колонка – 200 × 0.32 мм; элюент — ацетонитрил/вода с 0.5 % муравьиной кислотой; режим элюирования — изократический; скорость потока — 20 мкл/мин	Изопропил метилфосфоновая кислота	[12]
Моча	ESI (PI/NI)	Сорбент — [–С 18 ]; колонка — 150 × 2.0 мм; элюент — ацетонитрил/вода с 0.05 % муравьиной кислотой; режим элюирования — градиентный; скорость потока — 200 мкл/мин	Метаболиты сернистого иприта	[13]
Моча	ESI (PI)	Сорбент — [–С 18 ]; колонка — 250 × 2.0 мм; элюент — метиловый спирт/вода с 0.02 % формиатом аммония; режим элюирования — градиентный; скорость потока — 200 мкл/мин	— ” —	[14]

Известно, что многие белки могут образовывать прямые ковалентные аддукты с остатками отравляющих веществ и эти аддукты могут быть выявлены и идентифицированы методами масс-спектрометрии в течение всего времени жизни белка.

АДДУКТЫ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ С БЕЛКАМИ

Фосфорорганические отравляющие вещества (ФОВ) по клинической классификации являются ОВ нервно-паралитического действия. Чрезвычайно высокая токсичность и особенности физико- химических свойств, позволяющие быстро создавать обширные очаги химического заражения, делают ФОВ наиболее опасными из всех известных ОВ. История развития ФОВ связана с именем академика Арбузова А.Е., который открыл в 1905 г. способ получения амилфосфиновых кислот, что способствовало прогрессу в химии ФОВ. Первые сообщения о токсичности ФОВ относятся к 1932 г. Было установлено, что ФОВ вызывают удушье, нарушение сознания, зрения. Исследования ФОВ в Германии накануне и в годы II мировой войны связаны с именем профессора Шрадера. Среди различных структурных аналогов ацетилхолина были найдены в 50-х годах V-газы. И наконец, 80-е годы ХХ века: в США были созданы бинарные боеприпасы ФОВ — зарина и V-газов. ФОВ рассматриваются как наиболее опасные средства ведения химической войны, т. к. они обладают высокой токсичностью при любых способах попадания в организм и вызывают многосторонние симптомы поражения организма [15].

Воздействие ФОВ на организм может протекать по двум механизмам:

• 1)    подавление активности АХЭ;

• 2)    нехолинергические механизмы действия ФОВ.

Классическим методом выявления воздействия ФОС является измерение активности холинэстеразы в крови. Обычно АХЭ локализуется в мембранах эритроцитов, а родственный фермент бути-рилхолинэстераза (БХЭ) присутствует в сыворотке или плазме крови. Для мониторинга действия ФОВ используется колориметрический / фотометрический метод Элмана [16] или его модификации. Этот метод обычно используется для контроля здоровья персонала, работающего с ФОВ, но рассмотрение холинэстераз в качестве биомаркеров накладывает ряд ограничений. Например, по уровню активности холинэстераз невозможно сказать о веществе, которое вызвало ингибирование фермента. Более того, ацетилхолинэстераза, бути-рилхолинэстераза являются специфичными в основном в случае острых отравлений. Диагностика интоксикации ФОС при действии малых доз затруднена отсутствием подавления активности АХЭ и появления холинергических симптомов.

В этой связи более перспективным методом установления факта интоксикации рассматривается детектирование аддукта, образованного активным центром бутирилхолинэстеразы с остатком ФОВ. Так, например, фосфонилированный пептид, принадлежащий БХЭ и содержащеий серин 226, может быть получен путем ферментативного гидролиза БХЭ, выделенной из плазмы крови [17] и выявлен методами масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Определение аддукта масс-спектрометрическими методами имеет ряд преимуществ перед методом Элмана: он более специфичен и позволяет не только выявить факт ингибирования активного центра холинэстеразы, но и установить соединение, которым ингибирование было вызвано. Биомаркером интоксикации при реализации описанного метода является модифицированный фосфо-нилированный пептид.

Кроме того, биомаркером интоксикации ФОВ может являться сам модифицирующий остаток, полученный путем реактивации фермента фторидами и детектированный в виде производных метилфосфоновой кислоты в ходе LC-MS-анализа [18]. Такой метод является достаточно чувствительным для детекции ингибирования холинэстераз и позволяет определить факт интоксикации даже при ингибировании менее 1 % БХЭ.

Однако фосфонилированный серин активного центра холинэстераз может подвергаться спонтанному деалкилированию, при котором отщепляется О-алкильная группа ("старение", или "эйджинг") [19]. Это приводит к потере информации о структуре действующего ФОВ, поскольку остатки таких соединений, как зарин, зоман, VX, в результате старения образуют одинаковый продукт — остаток метилфосфоновой кислоты. Различные остатки ФОВ подвергаются старению с разной скоростью; например, остаток зомана, присоединенный к холинэстеразе, стареет в течение нескольких минут [20], в то время как старение остатка VX занимает более 72 ч [21], после чего перечисленными методами очень сложно установить тип примененного ОВ. Соответственно при ретроспективном анализе, когда невозможно установить вид действующего агента по остатку, присоединенному к активному центру холинэстераз, следует рассматривать другие белки-мишени.

Кроме холинэстераз, целый ряд ферментов и структурных белков способен ковалентно присоединять различные ФОС. К этим белкам относятся сериновые протеазы (трипсин, химотрипсин, эластаза, тромбин), цистеиновые протеазы (папаин, бромелаин), сериновые амидазы (арилформамида-за, амидгидролаза жирных кислот), фосфолипазы (фосфолипаза А2, нейротоксиэстераза), мускариновые и никотиновые рецепторы, канабиоидный СВ1 рецептор, сывороточный альбумин и др.

Одним из наиболее перспективных биомаркеров интоксикации ФОВ является аддукт ФОС с сывороточным альбумином. Инкубация изотопно- и радиоактивно-меченных зарина и зомана с плазмой крови человека с последующим масс-спектрометрическим анализом (LC-MS/MS) позволила выявить новый сайт фосфонилирования альбумина по тирозину 411. Зарин, зоман, циклозарин и табун способны формировать аддукт с указанным остатком тирозина при инкубации плазмы человека in vitro. VX также способен образовывать аддукт, но только при высоких конечных концентрациях [22]. Были разработаны чувстви- тельные аналитические методы, основанные на LC-MS/MS по выявлению и идентификации этих аддуктов, которые позволяют детектировать аддукты зомана, циклозарина и табуна с альбумином при 10–20 % ингибировании БХЭ и 70 % ингибировании БХЭ для зарина. Еще одно отличие аддуктов ФОВ с тирозином от аддуктов с серином активного центра БХЭ — отсутствие старения остатков метилфосфоновой кислоты, что позволяет однозначно установить тип примененного ФОВ. Аддукты с зоманом и табуном были идентифицированы через 7 дней после однократного подкожного введения ФОВ в дозе ½ ЛД50 морским свинкам. Более того, эти аддукты сохраняются и после терапии оксимами, которые вызывают реактивацию активного центра холинэстераз после ингибирования ФОВ.

АДДУКТЫ СЕРНИСТОГО ИПРИТА С ДНК И БЕЛКАМИ

Сернистый иприт [S(CН2–СН2–Сl)2] относится к отравляющим веществам кожно-нарывного действия, которые способны вызывать местные воспалительно-некротические изменения кожи и слизистых оболочек.

Сернистый иприт известен с начала ХIХ века, но получен химически чистым веществом и подробно был изучен в 1886 г. в Германии в лаборатории В. Мейера совместно с академиком Н.Д. Зелинским. Впервые иприт был применен как ОВ германской армией против британских войск в июле 1917 г. неподалеку от бельгийского города Ипр. В этом сражении англичане потеряли 6000 человек, были и повторные применения против французских войск. При этом ввиду разносторонности действия иприта защита от него была весьма затруднительна. Затем в 1936 г. иприт применяла Италия против Абиссинии, а в 1943 г. Япония использовала иприт в Китае [15]. Последние боевое использование этого газа было зафиксировано во время ирано-иракского конфликта в 80-е годы 20го века.

Механизм действия и патогенез ипритных поражений весьма сложен и полностью до конца не изучен. Сернистый иприт — активный алкилирующий агент, который способен достаточно быстро формировать ковалентные аддукты с белками и ДНК в физиологических условиях. Целый ряд аддуктов сернистого иприта с белками и ДНК был обнаружен масс-спектрометрическими методами [23]. Некоторые из аминокислот в белках содержат нуклеофильные группы: цистеин, серин, тирозин, лизин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Ковалентные аддукты с белками часто являются долгоживущими биологическими индикаторами отравления, на период существования белка с аддуктом в организме. Наряду с альбумином вторым долгоживущим белком крови, доступным для анализа, является гемоглобин, период жизни которого составляет около 120 суток [24, 25]. Эти два белка легко взаимодействуют своими аминокислотными остатками с электрофильными соединениями, что успешно определяется методами масс-спектрометрии.

Сернистый иприт способен алкилировать ДНК в положении N7 остатков деоксигуанозина. После процедуры депуринизации можно обнаружить N7-(2-гидроксиэтилтиоэтил)-2’-деоксигуанозин и N7-(2-гидроксиэтилтиоэтил)-2’-деоксигуанин. Минорными компонентами являются N7-гуанин диаддукт и аддукт N3-аденина [26, 27].

Так как эти аддукты плохо поддаются GC-MS-анализу, был предложен способ определения этих аддуктов в моче с использованием LC-MS (привитая фаза С 18 в качестве сорбента) [28]. N7-(2-гидроксиэтилтиоэтил)-2’-деоксигуанозин был обнаружен этим способом в моче морских свинок при воздействии сернистого иприта, однако уровень этого аддукта значительно снижается через 36–48 часов после экспозиции. По сходной методологии N7-(2-гидроксиэтилтиоэтил)-гуанин был обнаружен в органах крыс [29].

Гемоглобин — основной белок эритроцитов, который способен образовывать аддукты с сернистым ипритом, сохраняющиеся на протяжении всего времени жизни белка [30].

Определение специфичных сайтов алкилирования гемоглобина было проведено как традиционными [31], так и современными масс-спектрометрическими методами [32]. LC-MS/MS-анализ триптических пептидов гемоглобина, алкилированного радиоактивным сернистым ипритом, позволил определить 6 различных остатков гистидина, 3 остатка глутамата и оба N-концевых валина, с которыми может связываться иприт. Также были обнаружены и другие аминокислоты, алкилированные ипритом: цистеин, аспартат, лизин и триптофан при гидролизе гемоглобина ферментом проназой [32, 11].

Алкилированные аддукты гистидина являются наиболее распространенными в гемоглобине, обработанном сернистым ипритом, и остаются стабильными после гидролиза белка в 6 N HCl. Полученные гистидины плохо подходят для GC-MS– анализа. Чувствительный метод определения таких аддуктов был разработан на основе LC-MS/MS-анализа после дериватизации [33].

Недавно была опубликована методика прямого определения интактного алкилированного гемоглобина с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии [34]. Был обнаружен целый ряд алкилированных форм гемоглобина после воздействия сернистого иприта. Однако в настоящее время нет данных о применении этого метода для диаг- ностики отравления, хотя данный подход очень перспективен с точки зрения быстроты и массовости анализа.

Также сернистый иприт способен алкилировать остаток цистеина-34 сывороточного альбумина человека [35–36]. Участок алкилирования был обнаружен после трипсинолиза альбумина из крови, обработанной радиоактивным 14C сернистым ипритом. Цистеин-34 является единственным свободным остатком цистеина в альбумине и имеет относительно низкое значение pKa.

Чувствительный метод определения аддукта сернистого иприта с альбумином был разработан на основе расщепления алкилированного альбумина ферментом проназой, и трипептид S-[2-(дигидроксиэтил)тио]этил-Cys-Pro-Phe выявлялся методом micro-LC-MS/MS [35]. Предел обнаружения для сернистого иприта в крови, обработанной in vitro, был определен в 1 нМ. Преимуществом этого метода является возможность быстрого выделения альбумина из крови методами аффинной хроматографии. Необходимо отметить, что по подобному механизму к Cys34 альбумина могут присоединяться различные цитостатики на основе азотистого иприта, такие как мелфалан и циклофосфамид [37].

Аналитическая процедура для определения S-[2-(дигидроксиэтил)тио]этил-Cys-Pro-Phe была успешно применена на образцах крови от 9 пострадавших в ирано-иракском конфликте, которые получили отравление через кожу. Образцы крови были получены через 8–9 дней после отравления и хранились при –70 °С. Аддукты альбумина были обнаружены во всех случаях, концентрация иприта соответствовала 0.4–1.8 мкМ по калибровке, построенной на образцах крови, обработанных ипритом in vitro [35]. Выявлены также аддукты сернистого иприта с глобином и альбумином по остаткам аспарагиновой и глутаминовой кислот [38], а также с кератином кожи [39], однако методы идентификации аддуктов с использованием методов LС-MS/MS или MALDI пока не разработаны.

В культуре эпидермальных кератиноцитов человека при действии сернистого иприта меченным 14С in vitro был выявлен также ряд белков, которые способны образовывать аддукты с ипритом. После разделения белков клеточного лизата с помощью 2D-электрофореза был проведен масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF) белков из пятен, имеющих радиоактивность. Был идентифицирован ряд белков, образующих аддукты с сернистым ипритом, включающий в себя актин, несколько цитокератинов I и II типа, стратифин (14-3-3сигма) и галестин-7. Полученная информация позволит лучше понять молекулярные основы патогенеза, вызванного сернистым ипритом [40].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Быстрый анализ биологических образцов, который стал возможным с развитием масс-спектрометрии с мягкими методами ионизации, имеет большое значение, поскольку в последние годы появилось несколько новых направлений в поиске биомаркеров интоксикации ОВ и возможности их клинического применения. Например, потоковый анализ большого количества образцов при определении аддуктов ОВ с нативными белками методом MALDI-TOF или же поиск новых белков-мишеней.

Кроме того, методы масс-спектрометрии способствуют улучшению методологии химического и биохимического мониторинга ОВ в объектах окружающей среды и в биологических образцах, изучению новых молекулярных и функциональных механизмов патогенеза интоксикации различными ОВ, а также разработке новых эффективных средств профилактики и терапии.