Мастоциты в репродуктивной системе и возможности биотестирования факторов риска

Величайший ученый прошлого Ж.Б. Ламарк (не признанный современниками и недооцененный потомками) в книге «Философия зоологии», рисуя будущее человечества, предполагал возможность «гибели» природы не от воин, а в процессе «созидательного» труда. Ламарк предупреждал - человечество может уничтожить себя, сделав непригодной для жизни собственную среду существования.

Для обеспечения здоровья нации и безопасности будущих поколений необходимо иметь всеобъемлющую информацию о качестве окружающей среды, факторах риска и статусе живых систем (клеток, тканей, органов, организмов, экосистем). Критерии и методы оценки качества среды существования, мониторинга окружающей среды, расчеты экологических нагрузок антропогенных факторов и регистрация реакций животных на факторы риска – ключевые задачи ветеринарно-санитарной и экологической экспертизы сельскохозяйственных объектов . Особенно актуален в этой связи выбор методов и определение критериев оценки реакции позвоночных животных на стрессовые и экологические факторы [5, 10, 11].

В живой природе имеет место специфическая особенность - высокая степень дифференциации клеток, специализация тканей и органов Metazoo, сложные многоуровневые механизмы регуляции функциями формируют скрытые компенсаторные реакции у высших животных, которые трудно соотнести с данными фитоиндикации, с результатами биотестирования на простейших или беспозвоночных. Слабые воздействия могут не вызывать у позвоночных регистрируемых ответных реакций до тех пор, пока, накопившись, они не приведут к развитию бурных динамических процессов. При этом в цепи «внешнее воздействие – отклик живой системы» нет линейной зависимости, и могут интегрироваться различные факторы. А изменения физиологических, морфологических, биохимических, иммунологических пока- зателей в организмах фиксируют «post factum», когда анализируемые параметры уже имеют отклонения от нормы.

Метод дифференциального анализа топографии и функциональной активности тучных клеток в тканях и органах позвоночных может позволить диагностировать изменения на клеточно-тканево-органном уровне в случае, когда еще невозможно регистрирование физиологических сдвигов или структурных изменений [4, 7, 8, 9, 13, 14].

Как метод биотестирования реакций у позвоночных на клеточном уровне предлагаем использовать гистохимический метод морфофункционального анализа активности тучных клеток в тканях и органах позвоночных .

Цель работы: разработка адекватной модели для выявления воздействия факторов риска на клеточном уровне у позвоночных с последующей рекомендацией к внедрению в практику ветеринарно-санитарной и экологической экспертизы.

В соответствии с целью сформулированы задачи :

• -    изучение методом гистохимического дифференциального анализа динамики функциональной активности и топографии тучных клеток тканей животных в норме;

• -    выявление закономерностей изменения в популяциях тучных клеток при конструктивных перестройках на примере послеродовой инволюции миометрия матки крыс.

Материал и методы. Для морфофункционального анализа активности тучных клеток позвоночных использовались гистологические пробы от нелинейных 84 белых крыс-самок послеродового периода. Контрольная группа была сформирована из 8 виргинных крыс. Животные содержались в стандартных лабораторных условиях и забивались в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Животные и органы взвешивались. Для исследования брались фрагменты матки (на расстоянии 1/3 длины рога от шейки). Рассчитывался весовой коэффициент как относительная масса органа к массе тела.

Материал фиксировался в жидкости Буэна, фиксаторе Карнуа и после парафиновой проводки были приготовлены серии срезов с диапазоном между срезами не менее 100 мк. Срезы окрашивали крезиловым фиолетовым. Плотность тучных клеток измерялась на срезах при помощи сетки Вайбеля при увеличении х 400.

Для дифференциации функциональной активности тучных клеток была использована цитограмма тучной клетки, и в зависимости от количества (визуальной плотности) гранул и степени метахромазии их делили на классы:

• 1    класс - функционально неактивные, клетки темные, плотно заполнены гранулами, не видно ядра;

• 2    класс - стадия начальной активации , в клетках различимо ядро и рыхлое наполнение гранулами, в перицеллюлярном пространстве выявляются гранулы;

• 3    класс – активные клетки , гранул в цитоплазме мало, их нет перинуклеарном пространстве.

Функциональную активность популяции тучных клеток рассчитывали по индексу гранулярного насыщения и индексу дегрануляции.

Полученные данные вносили в базу данных и статистически обрабатывали с помощью электронных таблиц Excel. Определяли средние и относительные величины, проводили оценку их с помощью вычисления ошибки, достоверность различий оценивалась с использо- 35

ванием коэффициента Стьюдента. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05 и 0,01.

Результаты исследования и обсуждение . Окрашивание срезов крезиловым фиолетовым позволило нам визуализировать тканевые базофилы и другие тканевые компоненты органа, в том числе базальные мембраны тонких кровеносных сосудов, вплоть до капилляров, и базальные мембраны подслизистых оболочек (рис. 1).

Фенотип тучных клеток определяется особенностью микроокружения ткани, где они созревают. Мастоциты, расположенные по ходу микрососудов, как правило, имеют вытянутую, уплощенную форму (рис. 2), а если они локализованы в рыхлой соединительной ткани – округлую (рис 1).

Гистохимический анализ топографии тучных клеток тканей матки крыс в послеродовый период показал преимущественное представительство мастоцитов в миометрии. В эндометрии матки тучные клетки встречаются редко. Через циркулярный слой миометрия проходят отдельные мелкие сосуды в эндометрий, и нами было отмечено, что большинство мастоци-тов расположено вокруг кровеносных сосудов. Некоторые тучные клетки свободно лежат между миоцитами как продольных, так и циркулярных мышечных пучков.

Первые сутки после родов идет быстрая инволюция матки за счет редукции всех тканей. В период 4-6 суток отмечалась стабилизация морфометрических показателей матки (веса, толщины миометрия, весового коэффициента).

Рис.1. Тучная клетка (1) крупная, округлой формы. Поперечный срез капилляра (2). Микроокружение формируют структурные, биохимические и функциональные признаки ТК. Окраска крезиловым фиолетовым. х 400

Нами исследован период нормальной физиологической послеродовой инволюции матки у крыс - это 20 суток после родов. Гистохимический анализ органа показал тенденции в изменении числа тучных клеток в миометрии и позволил выявить два пика роста их плотности на 6-е и 16-е сутки (табл. 1). Полученные данные указывают на активную роль тучноклеточной популяции в ремодернизации тканевых структур органа.

Таблица 1

Динамика плотности тучных клеток на единицу площади миометрия матки крыс послеродового периода

Сутки после родов	Плотность тучных клеток на ед. площади ± ошибка сред.
0	0,15 ± 0,09
2-4	0,59 ± 0,12*
6 – 8	1,13 ± 0,26*
10 -12	1,12 ± 0,23
14 – 16	1,56 ± 0,39
18 -20	1,28 ±0,42
контроль	0,22 ± 0,09

*Достоверность P< 0.01

Анализ метахромазии выявленных тучных клеток выявил тенденции в динамике функциональной активности популяции (табл. 2). В первые сутки после родов наблюдается периваскулярная локализация и незначительная степень дегрануляции мастоцитов, в основном встречаются клетки 1 и 2 класса. На четвёртые сутки более половины мастоцитов оказывается свободно лежащими вне сосудистой системы. Плотность их резко возросла – приблизительно в 4 раза (Р<0.05). Появились отдельные тучные клетки с высокой степенью дегрануляции.

На 6-8 сутки после родов - происходит значительное увеличение числа тучных клеток на единицу объема гладкой мускулатуры и диагностируется их активация.

Функциональную активность тучных клеток наблюдают как дегрануляцию внутриклеточных гранул в перицеллюлярное пространство. Значительная часть выявленных мастоци-тов на 6-8 сутки позиционируются как пул функционально активных клеток 2-3 класса. В них отмечалось визуальное уменьшение плотности гранул, просматривалось ядро и наблюдались метахроматические ареолы в перицеллюлярном пространстве (рис. 2 и рис. 3). Дегрануляция в некоторых случаях достигала такой степени, при которой идентификация тучной клетки затруднена – в цитоплазме почти не остается гранул, нет их и в перицеллюлярном пространстве.

Полученные нами данные о динамике популяции тучных клеток миометрия крыс в послеродовый период показали высокую вариабельность активности пулов в исследуемых группах. Гистохимический анализ выявил тенденцию к возрастанию функциональной активности в тучноклеточных популяциях при перестройке ткани. Было показано их преимущественное представительство в периваскулярных областях. При анализе также учитывались сво-боднолежащие мастоциты в миометрии (табл. 2).

Рис. 2. Дегрануляция тучных клеток (1,2) миометрия матки крысы. Гранулы выявляются в перицеллюлярном пространстве клеток. Окраска крезиловым фиолетовым. х 400

Рис. 3. Тучные клетки в миометрии матки крысы. ТК (1) плотно заполнены гранулами и опустошенные ТК (2) в стадии высшей функциональной активности.

Окраска крезиловым фиолетовым. х 400

Таблица 2

Динамика активности тучных клеток миометрия на единицу площади в % к общему числу выявленных клеток

Сутки после родов	Активность тучных клеток на ед. площади в % ± ошибка средняя
контроль	15,8±3,2
0	13,4± 4,5
2-4	44,3± 10,3
6 – 8	128,1± 29,3
10 -12	130,9± 33,9
14 – 16	163,8± 33,9
18 -20	160,9±52,8

Выявленные тенденции в топографии, изменении плотности и активности тучных клеток указывают на их участие в компенсаторно-адаптивных процессах направленных на поддержание структурно-функционального гомеостаза.

В тканях и органах тучные клетки описывают как полифункциональных агентов, организующих нормальные физиологические и патологические процессы, например: инициируют аллергические реакции [1, 2], координируют реконструкцию и регенерацию тканей [8], инициируют и поддерживают хронические воспалительные процессы, регулируют постнатальный ангиогенез в норме и в патологии [12, 13].

Популяции тучных клеток различных органов имеют выраженный полиморфизм, который определяется особенностями микроокружения ткани и органов, где они созревают и формируются их структурные, биохимические и функциональные признаки [1, 3, 8,].

Обобщение результатов ряда авторов [1-4, 6-9, 12-14] позволяет нам различать субпопуляции тучных клеток с учетом следующих признаков:

• •    тканевой локализации;

• •    формы и размеров клеток;

• •    количества, размеров, типа и ультраструктуры гранул;

• •    набора протеаз и других медиаторов;

• •    чувствительности к биологически активным веществам;

• •    по степени и формам дегрануляции клеток;

• •    чувствительности к активаторам/ингибиторам дегрануляции.

Дегрануляцию ТК могут вызывать факторы различной природы: гипоксия, сдвиг рН, белки, иммуноглобулины, амины, нейропептиды, охлаждение/нагрев, ультразвук, электромагнитное излучение, стресс.

Локальная активация секреторной деятельности тучных клеток может продемонстрировать провоспалительную реакцию на клеточном уровне. Показатели плотности тучных клеток на единицу площади, общая активность и индекс активности, локализация их в тканях дают информацию о функциональном напряжении органа и предпосылках к реконструкции архитектоники района, мобилизации в данный микрорайон факторов воспаления, направленности динамических процессов в органе.

В настоящее время накоплены данные об участии тучных клеток в перестройках половой систе мы самок животных. Топография и активность тканевых базофилов также коррелиру- 39

ется с гормональным статусом организма. Работы последних лет [3, 7, 8, 9] существенно дополнили и расширили представления о роли тканевых базофилов в морфофункциональных тканевых перестройках органов репродуктивной системы, что исключительно важно при решении проблем воспроизводства животных в экстремальных экологических и современных технологичных условиях.

Выводы. В настоящее время имеющиеся данные позволяют утверждать, что тучные клетки выступают в роли регуляторов местного гомеостаза как в экстремальных ситуациях, так и в нормальных конструктивных процессах. Полученные нами данные могут использоваться как модель локальной морфофункциональной регуляции на клеточном уровне в общей реакции адаптации системы и представляют несомненный интерес для биотестирования факторов риска специалистами в областях репродуктивной зоотехнии и ветеринарии, экологической физиологии, акушерства и гинекологии, адаптивной экологии.

Возможные области/направления применения данного метода.

Ветеринарная экспертиза . Метод позволит выявлять поллютанты, ксенобиотики, конта-минанты в продукции, подлежащей оценке на безопасность. Данным методом в комплексе с другими (биохимическими, микробиологическими, иммуногенетическими, физиологическими, морфометрическими, др.) можно оценивать характер и направленность изменений на клеточно-тканевом уровне у позвоночных.

Э кологическая экспертиза и мониторинг окружающей среды. Метод позволит диагностировать экологические факторы, потенциально и реально входящие в группу факторов риска (аллергены, патогены, токсины, новые корма, стресс, поллютанты, пестициды, экоциды и т.п.) для здоровья высших животных и человека. Возможно проведение оценки воздействия антропогенных факторов (физических, химических, биологических, стрессовых) на клеточнотканевом уровне организмов. Выявление клеточных реакций высших организмов на стимулы в дозах ниже ПДК, ПДУ, ОБУВ (ориентировочный безопасный уровень воздействия), ДСД (допустимые суточные дозы) и т.п.

Производство экологически чистой/безопасной продукции растениеводства и животноводства. Метод позволит оценивать экологическую безопасность для человека и животных с/х продукции на промежуточных и конечных стадиях производства.

Оценка безопасности (антигенной, токсической, микробной, ксенобиотической) новых добавок и кормов в условиях интенсификации животноводства и при производстве экологически чистой/безопасной продукции.