Матриксная металлопротеиназа-9 как потенциальная молекулярная мишень для терапии меланомы кожи

Актуальность. Матриксная металло- системы эндопептидаз, принимающих участие протеиназа-9 (ММП-9) является ферментом     в деструкции внеклеточного матрикса, обеспе- чении опухолевой инвазии и метастазирования. Кроме способности к процессам деградации компонентов межклеточного матрикса, отмечено участие ММП-9 в аутокринном типе регуляции апоптоза и клеточной пролиферации.

Цель исследования . Оценить роль матрикс-ной металлопротеиназы-9 (ММП-9) в развитии меланомы кожи и определить возможность использования данного фермента в качестве патогенетической мишени при меланоме кожи.

Материал и методы. Было проведено исследование биоптатов кожи 102 пациентов с меланоцитарными новообразованиями кожи. Образцы кожи фиксировали в 10 % нейтральном забуференном формалине, срезы подвергали иммуногистохимическому окрашиванию по стандартной методике с моноклональными антителами к ММP-9 (Abcam, разведение 1:250). Клетки меланомы кожи культивировали в среде RPMI в СО2-инкубаторе с 5 % содержанием CО2. По достижении концентрации 1,5x105 клеток мл-1 в клетки осуществлялась трансфекция интерферирующих РНК (иРНК) с помощью Lipofectamine 2000 (Invitrogen) и РНК. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток осуществлялось с использованием моноклональных антител к ММР-9 (Abcam, разведение 1:250), к PCNA (разведение 1:400). В отдельной серии экспериментов использовались скрамблированные последовательности РНК. В дальнейшем была создана экспериментальная модель меланомы кожи на мышах, линии C57 Bl6. Животные были разделены на 2 группы (контрольную и опытную) случайным образом. Трансплантация культуры опухолевых клеток меланомы В16 производилась путём подкожного введения 0,5 мл взвеси опухолевой ткани в растворе Хенкса (1:10). На 10-е сут после трансплантации опухоли животным опытной группы было начато введение Inhibitor MMP-9 I (Calbiochem) в концентрации 5nM. Животные контрольной группы оставались без лечения. Животные находились в эксперименте до естественной гибели, после чего производилась оценка выживаемости животных-опухоленосителей, производился расчёт торможения роста опухоли (ТРО) и увеличения продолжительности жизни животных (УПЖ).

Результаты. При оценке данных иммуногистохимического исследования было выявлено 3-кратное увеличение уровня ММП-9 в клетках меланомы кожи по сравнению с контролем. При оценке уровня экспрессии ММП-9 в клетках культуры меланомы иммуноцитохимический (ИЦХ) индекс в контроле составил 244,25. На культуре клеток меланомы было произведено селективное ингибирование ММП-9, таким образом, показатель ИЦХ-индекс снизился до 100, оставаясь при этом на уровне 237,7 в клетках, инкубированных со скрамблированными РНК. Ингибирование ММП-9 вызывало снижение уровня клеточной пролиферации в 3 раза. При оценке выживаемости животных средняя продолжительность жизни животных (СПЖ) опытной группы увеличилась в 1,5 раза по сравнению с контрольной группой, а показатель УПЖ составил 37 %. Таким образом, ингибитор ММП-9 оказывал биологически значимый эффект на продолжительность жизни животных-опухоленосителей.

Выводы . Селективное воздействие на активность матриксной металлопротеиназы-9 может быть использовано для формирования новых терапевтических стратегий при меланоме кожи.