Механизмы адаптации штамма Rhodococcus sp. SMB37 к физико-химическим условиям экотопов Верхнекамского месторождения солей

Разработка Верхнекамского месторождения солей (ВКМС) сопровождается трансформацией природного ландшафта и изменением физико-химических характеристик почв (Горбунова и др., 1990; Бабошко, Бачурин, 2009). Одним из основных селективных факторов, оказывающих давление на автохтонную микрофлору, в этой экосистеме является засоление. Помимо этого, регион характеризуется коротким вегетационным периодом, начало которого часто сопровождается возвратом заморозков. Поэтому здесь способны выживать бактерии, обладающие эффективными механизмами защиты от одновременного действия высокого осмотического давления и холода. Действие на клетки бактерий гиперосмотического и гипотермического стрессов в некоторых аспектах име- ет одинаковый эффект: приводит к дегидратации, инициируя развитее окислительного стресса (Chattopadhyay et al., 2011; Uysal et al., 2022). Поэтому в адаптации к этим экологическим факторам задействован одинаковый механизм совместимых веществ (осмопротекторов) – накопление низкомолекулярных соединений, не нарушающих метаболизм клетки (Chattopadhyay et al., 2011; Uysal et al., 2022).

Из техногенных экосистем (шламохрани-лища), а также прилегающих к ним засоленных почв района солеразработок ВКМС (г. Березники, Пермский край) выделены га-лотолерантные грамположительные бактерии рода Rhodococcus (Anan’ina et al., 2011; Ананьина и др., 2025). Бактерии рода Rhodococcus обладают устойчивостью к воздействию неблагоприятных факторов среды. Они обнаружены в различных засоленных

Работа лицензирована в соответствии с CC BY 4.0. Чтобы просмотреть копию

этой лицензии, посетите

экосистемах, таких как моря, почвы мангровых лесов, нефтяные рассолы и нефтезагрязненная почва (Bell et al., 1998; Claverías et al., 2015). Несмотря на высокий интерес к представителям рода Rhodococcus , сведения о механизмах адаптации к неблагоприятным факторам среды ограничены отдельными статьями и касались изучения роли аминокислот и трегалозы (Комарова и др., 1998; Комарова и др., 2002; Cappelletti et al., 2016).

Целью исследования являлось изучение роли эктоина и его гидроксипроизводного в ответ на совместное воздействие низкой температуры и повышенной солености среды на примере галотолерантного штамма Rhodococcus sp. SMB37, способного к деструкции полиароматических углеводородов (Anan’ina et al., 2011).

Материалы и методы исследования

Объект исследования. В работе использовали штамм Rhodococcus sp. SMB37 из разлагающего нафталин консорциума бактерий SMB3, выделенного из техногенной засоленной почвы района солеразработок ВКМС (Пермский край, Россия) (Anan'ina et al., 2022). Штамм идентифицирован на основе анализа почти полной нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК (Anan'ina et al., 2022). Бактериальная культура хранится в рабочей коллекции Лаборатории микробиологии техногенных экосистем «ИЭГМ УрО РАН», а также во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером Rhodococcus sp. SMB37 (=Ac-2603).

Среды культивирования. В исследовании использовали минеральную среду Раймонда (МСР) (Плотникова и др., 2011), где источником углерода и энергии служила глюкоза. При необходимости в среду добавляли хлорид натрия в конечной концентрации 2 или 5 %. Для получения плотной среды вносили агар в количестве 18 г/л.

Условия культивирования. Изучение роста при разных температурах (0, 5, 25, 35, 40° C) проводили, культивируя штамм бактерии на плотной МСР, содержащей 2 % хлорида натрия и глюкозу в конечной концентрации 1 г/л. Инокулятом служила культура, выращенная до стационарной фазы в жидкой МСР с тем же количеством хлорида натрия и ростового субстрата. Инкубирование осуществляли на шейкере УВМТ-12-250 («ЭЛИОН», Россия) при 100 об./мин. Биомассу на плотную питательную среду наносили штрихом микробиологической петлей. Культивирование осуществляли в термостатируемых шкафах ТС-1/80 СПУ (Россия) или холодильной камере.

Подготовка биомассы для экстракции органических соединений. Бактерию выращивали на плотной МСР как без хлорида натрия, так и в его присутствии в концентрации 5 %. Глюкозу вносили в среду до конечной концентрации 1 г/л. Инкубирование осуществляли при 5º C. После завершения инкубирования с поверхности плотной среды биомассу собирали микробиологической петлей и переносили в 1 мл 80 %-ного раствора этанола. Далее из клеток проводили экстракцию органических соединений согласно методике, описанной (Bernard et al., 1993). Высушенные экстракты хранили при 5º С до проведения анализа. Осадок клеток, полученный после экстракции, сушили и определяли массу.

Анализ состава вторичных метаболитов клеток. Соединения разделяли высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на приборе Shimadzu prominence LC-20AD (Shimadzu corporation, Япония), снабженном UV/VIS-детектором CPD-20A (Shimadzu corporation, Япония), на колонке Сепарон SGX 100 NH 2 , 4,6×150 мм, 5 мкм (Dr. Maisch GmbH, Германия) согласно методике, описанной (García-Estepa et al., 2006). Идентификацию соединений проводили сравнением времени удерживания с коммерческими препаратами эктоина и гидроксиэктоина (Fluka, Германия). Количество совместимых веществ рассчитывали на мг сухого веса биомассы (мг СБ).

Амплификация ect-генов. Амплификацию ect -генов на матрице ДНК исследуемого штамма проводили на приборе С1000 Touch (Bio-Rad, США), используя пару праймеров G2F/G2R при условиях, описанных (Ананьина и др., 2018). Секвенирование генов проводили с помощью праймера G2R, коммерческого набора реактивов GenSeq («Синтол», Россия) на приборе «Нанофор 05» («Синтол», Россия), следуя инструкциям фирмы-производителя.

Биоинформационный анализ. Сравнительный анализ полученной нуклеотидной последовательности с типовыми штаммами видов рода Rhodococcus осуществляли с помощью программы Blastn . Выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей велось с помощью программы Mega 2.0.

Результаты и их обсуждение

Изучен температурный диапазон роста штамма Rhodococcus sp. SMB37 при культивировании на плотной минеральной среде, в которой глюкоза служила единственным источником углерода и энергии. Галотолерантный штамм Rhodococcus sp. SMB37 рос в температурном диапазоне 0– 35º C, оптимальной для роста являлась температура 25ºC (табл. 1). В связи с тем, что штамм проявил свойство сохранять физиологическую активность при 0º C, его можно отнести к группе психротолерантных бактерий. Интересным наблюдением было то, что для штамма не характерны высокие показатели роста при 5º C, но тем не менее он рос при 0º C.

Поскольку галотолерантная бактериальная культура Rhodococcus sp. SMB37 была способна к росту при 0º C, было изучено накопление ее клетками осмолитов при низкой температуре. Показано, что в условиях низкой температуры (5º C) данный штамм аккумулировал в клетках эктоин в количестве 0,19 мкмоль/мг СБ, при этом содержание гидроксиэктоина было низким и составляло 0,003 мкмоль/мг СБ, отмечена высокая вариабельность его количества в биологических повторах (табл. 1). Таким образом, продемонстрирована роль эктоина в адаптации родококков к низкой температуре. Ранее для бактерий рода Rhodococcus в условиях холода было показано увеличение внутриклеточного количества трегалозы (Комарова и др., 1998).

Совместное воздействие низкой температуры (5º C) и повышенной солености (5 % NaCl) приводило к значительному увеличению внутриклеточной концентрации гидроксиэктоина до 0,1 мкмоль/мг СБ. Кроме того, возрастало содержание эктоина до 0,32 мкмоль/мг СБ. Ранее накопление клетками бактерий рода Rhodococcus эктоина и гидроксиэктоина было отмечено в условиях дегидратации, т.е. в условиях засухи (Alvarez et al., 2004). Однако в этих условиях количество гидроксиэктоина значительно превосходило содержание эктоина.

Таблица 1. Характеристика штамма Rhodococcus sp. SMB37

Признак	Результат
Филогенетически близкородственный типовой штамм вида по гену 16S рРНК*	Rhodococcus artemisiae YIM65754T
Рост при разных температурах	Температура, °C/Длительность культивирования, сут.
	0/28	5/21	25/7	35/7	40/7
	±	+	+++	++	─
Накопление эктоина и гидроксиэктоина (мкмоль/мг СБ) при 5° C	Без NaCl		5 % NaCl
	Эктоин	Гидроксиэктоин	Эктоин	Гидроксиэктоин
	0,19 ±0,06	0,003±0,003	0,32 ±0,09	0,1± 0,03
Амплификация фрагмента ect -оперона	Праймеры	Длина ожидаемого фрагмента ДНК	Длина амплифицированного фрагмента ДНК
	G2F/G2R	Около 800 п.о.	Около 800 п.о.

Примечание: «–» – отсутствие роста; «±» – едва видимые колонии диаметром менее 1 мм в основании штриха; «+» – множество мелких колоний диаметром менее 1 мм в основании штриха; «++» – видимые колонии по штриху; «+++» – пигментированные колонии по штриху; «п.о.» – пар оснований; * – согласно Anan’ina et al., 2022.

Проведена амплификация фрагмента ect -оперона, кодирующего ферменты синтеза эктоина, на матрице ДНК-штамма Rhodococ-cus sp. SMB37. Получен фрагмент ожидаемой длины (табл. 1). Определена нуклеотидная последовательность полученного участка ДНК. Сравнение нуклеотидной последовательности фрагмента ect -оперона штамма Rhodococcus sp. SMB37 с таковыми из публичного банка данных выявило наиболее высокий уровень сходства с нуклеотидными последовательностями гена, кодирующего диаминобутиратаминотрансферазу бактерий рода Rhodococcus . Этот фермент катализирует первую реакцию биосинтеза эктоина: перенос аминогруппы с глутамата на L-аспартат-β-полуальдегид с образованием

L-2,4-диаминобутирата.

Проведен сравнительный анализ филогенетических деревьев, построенных на основе гена 16S рРНК и фермента диаминобутиратаминотрансферазы (рис. 1, 2). На филогенетическом 16S рДНК-дереве штамм SMB37 входил в кластер « Rhodococcus rhodochrous » (рис. 1). Штамм SMB37 с представителем вида R. artemisiae образовывал группу с высоким значением достоверности ветвления (99 %), формируя отдельную ветвь. Уровень сходства штаммов в группе Rhodococcus rhodochrous находился в пределе 95,2–99,3 % (табл. 2). Наиболее высокий уровень сходства штамм проявил к типовому штамму вида R. artemisiae YIM65754 ^T .

₉₅ .Rhodococcus biphenylivorans TG9 (KJ546454.1)

I------------- Rhodococcus lactis DW151В (KP342300.1)

Rhodococcus gordoniaeW4937 (NR 025730.1)

Rhodococcus pyridinivorans PDB9 (NR 025033.1)

Rhodococcus sp. SMB37

- Rhodococcus artemisiae YIM 65754 (NR 108785.1)

Rhodococcus rhodochrous MCC 13308 (GQ871830.1)

Rhodococcus coprophilus CUB 687 (NR 029206.1)

Corynebacterium diphtheriae NCTC 11397 (X84248.1)

I----------------------------------------------------------------------1

0.01

Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное на основе нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК с использованием алгоритма ближайшего соседа

Rhodococcus rhodochrous NCTC 10210 (SNV17468.1)

Rhodococcus pyridinivorans AK37 (EHK84985.1)

Rhodococcus gordoniae NCTC 13296 (SUE13553.1)

----- Rhodococcus coprophilus NCTC 10994 (SQI29474.1)

100 Г Rhodococcus artemisiae (WP_330131810.1)

I— Rhodococcus sp SMB37 (WP_054717731.1)

----- Streptomyces pactum ACT12 (AMY60489.1)

0,15

010          0Ю5          0,00

Рис. 2. Дендрограмма, построенная на основе аминокислотных последовательностей фермента диаминобутиратаминотрансферазы с использованием метода невзвешенной попарной группировки с усреднением

Таблица 2. Уровни сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и аминокислотных последовательностей фермента диаминобутиратаминотрансферазы

Вид	Штамм	ОО чо д и	U оо		да Q л	2 £ £ 2	2 2 ел	04 О н		н <	и н 04 и ^ -
Rhodococcus coprophilus	NCTC10994		97,4	95,6	96,9	95,2	95,4	96,3	95,2	н.д.	91,4
Rhodococcus rhodochrous	NCTC10210	93,1		96,7	97,6	96,2	96,5	98,2	97,1	н.д.	91,4
Rhodococcus gordoniae	NCTC13296	92,6	96,7		98,0	96,9	96,9	98,5	97,4	н.д.	89,9
Rhodococcus pyridinivorans	AK37	93,1	99,3	97,4		96,9	96,9	99,1	98,0	н.д.	90,3
Rhodococcus artemisiae	н.д.	89,5	88,5	89,0	88,5		99,3	96,9	96,5	н.д.	91,0
Rhodococcus sp.	SMB37	89,5	89,3	89,3	89,6	99,0		96,9	96,5	н.д.	91,4
Rhodococcus biphenylivorans	TG9	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.		98,9	н.д.	89,8
Rhodococcus lactis	DW151B	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.		н.д.	89,8
Streptomyces pactum	ACT12	67,5	69,5	69,5	69,5	67,3	67,8	н.д.	н.д.		н.д.
Corynebacterium diphtheriae	NCTC 11397	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.

Примечание: н.д. – нет данных. Курсивом выделен уровень сходства аминокислотных последовательностей диаминобутиратаминотрансферазы. Полужирным шрифтом выделен уровень сходства 16S рДНК.

В публичных базах данных проведен поиск аминокислотных последовательностей диаминобутиратаминотрансферазы типовых штаммов видов из кластера Rhodococcus rhodochrous. Для видов Rhodococcus lactis и Rhodococcus biphenylivorans они не были обнаружены в базах данных. На филогенетическом дереве, построенном на основе аминокислотной последовательности белка, штамм SMB37 группировался c представителем вида R. artemisiae с высоким уровнем достоверности (100 %), формируя отдельную линию на дереве (рис. 2). Уровень сходства между видами кластера варьировал от 88,5 до 99,0 % (табл. 2). Наиболее высокое значение, составляющее 99,0 %, штамм SMB37 имел с видом R. artemisiae. Полученные данные подтверждают филогенетическое родство исследованного штамма и представителей вида R. artemisiae.

Заключение

Проведенные исследования показали, что штамм-деструктор полиароматических углеводородов Rhodococcus sp. SMB37 обладает эффективными механизмами защиты от одновременного действия высокой солености среды и холода. Полученные данные можно учитывать при разработке технологий ремедиации территорий с применением биопрепаратов на основе бактерий рода Rhodococcus с целью увеличения их выживаемости и сохранения биодеградационного потенциала.

Исследование осмолитов в клетках бактерии выполнено при финансовой поддержке РНФ и Министерства образования и науки Пермского края в рамках научного проекта № 24-26-20070; молекулярнобиологическая часть выполнена в рамках государственного задания АААА-А19-119112290008-4. При выполнении работы использовали оборудование ЦКП «Исследования материалов и вещества» ПФИЦ УрО РАН.