Механизмы активации филграстимом процессов восстановления гранулоцитарного ростка гемопоэза у больных раком молочной железы в условиях химиотерапии по схеме доксорубицин/доцетаксел

Схемы химиотерапии, включающие антраци-клины и таксаны, часто используются для лечения больных раком молочной железы (РМЖ) III–IV стадий [3, 11, 12]. При этом эффективность сочетания доцетаксела с доксорубицином в качестве I линии химиотерапии составляет 55–94 %, в качестве II линии – 36–59 %, и демонстрирует наиболее высокие показатели выживаемости [3, 8]. Однако частым осложнением при использовании как доцетаксела, так и доксорубицина является угнетение костномозгового кроветворения, в большей степени гранулоцитарного ростка, что проявляется развитием лейкопении с преимущественным снижением в периферической крови количества нейтрофильных гранулоцитов. Нейтропения III–IV степени развивается у 85–100 %, фебрильная нейтропения – у 30–40 % больных, получавших цитостатическую терапию данными препаратами [9].

В тех ситуациях, когда необходимо быстро увеличить количество гранулоцитов в крови, используют преимущественно препараты гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), в

частности филграстим [5, 10, 13]. Вместе с тем становятся известными новые эффекты Г-КСФ в отношении кроветворения, которые требуют дальнейшего изучения механизмов действия этих препаратов. Кроме того, в большом количестве экспериментальных работ показано, что реализация гемостимулирующих эффектов Г-КСФ на фоне различных режимов цитостатической терапии происходит через воздействие на совершенно разные звенья регуляции системы крови [4, 6, 7].

Целью исследования явилась оценка эффективности филграстима в качестве корректора нарушений, возникающих в системе крови у больных раком молочной железы III–IV стадий в процессе химиотерапии по схеме доксорубицин/доцетаксел, и изучение механизмов, лежащих в основе гемостимулирующего эффекта препарата.

Материал и методы

Было обследовано 77 больных с морфологически верифицированным раком молочной железы III–IV стадий. Все пациентки получали химиотерапию (ХТ) по схеме, включающей внутривенное введение

50 мг/м2 доксорубицина (адриабластин, Фармация и Апджон С.п.А., Италия) в 1-й день и 75 мг/м2 доцетаксела (таксотер, Авентис Фарма, С.А., Франция) – во 2-й день. Длительность цикла составляла два дня, интервал между курсами – 3 нед. Из представленной группы больных 30 пациенток в перерывах между курсами ХТ получали филграстим подкожно в дозе 300 мкг, который вводился на 8-й и 12-й дни от последнего введения доцетаксела.

Показатели системы крови оценивали на протяжении 3 курсов химиотерапии. Капиллярную кровь для исследования забирали до и после каждого цикла цитостатического лечения. Проведение стернальных пункций осуществляли до начала лечения, а также после I и II курсов химиотерапии. Определение показателей периферической крови (лейкоциты, гемограмма) и дифференциальный подсчет миелограмм в стернальном пунктате производили стандартными гематологическими методами [4].

Клонирование клеток-предшественников гранулоцитопоэза (КОЕ-Г) из неприлипающих кариоцитов костного мозга и периферической крови больных, выделенных на градиенте плотности Histopaque-1077 (Sigma, США) (концентрация клеток 2,0×105 мл), осуществляли в полувязкой питательной среде на основе метилцеллюлозы. Интенсивность дифференцировки гемопоэтических предшественников определяли по величине индекса созревания (соотношение колоний к кластерам). Пролиферативную активность КОЕ изучали методом клеточного самоубийства с использованием гидроксимочевины. Колониестимулирующую (КСА) активность супернатантов от прилипающей и неприлипающей фракций костного мозга тестировали микрометодом в 96-луночных планшетах, КСА выражали количеством выросших гранулоцито-макрофагальных колоний (на 105 миелокариоцитов) [2, 4]. Протокол исследования одобрен этическим комитетом Томского НИИ онкологии.

Статистическую обработку полученных данных проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Химиотерапия больных раком молочной железы приводила к статистически значимому снижению количества лейкоцитов после завершения 1, 2 и 3-го курсов. Со стороны показателей периферической крови гемостимулирующий эффект препарата Г-КСФ проявлялся в выраженном увеличении общего количества лейкоцитов на всех этапах исследования, причем не только за счет сегментоядерных нейтрофилов, но и за счет лимфоцитов, моноцитов и палочкоядерных форм нейтрофильных лейкоцитов (рис. 1А, Б).

Картина периферической крови пациентов в целом соответствовала изменениям со стороны ми-

Рис. 1. Изменения общего количества лейкоцитов (А); содержания сегментоядерных нейтрофилов (Б) в периферической крови и уровня КСА (В) в сыворотке крови больных РМЖ в процессе химиотерапии с использованием доксорубицина и доцетаксела (прозрачные столбики), либо их комбинации с филграстимом (заштрихованные столбики). По оси абсцисс – сроки исследования (1 – до лечения, 2 – после первого курса, 3 – перед вторым курсом, 4 – после второго курса, 5 – перед третьим курсом, 6 – после третьего курса), по оси ординат – значения показателя; доверительные интервалы при р<0,05

елоидного ростка кроветворения. Применение филграстима в комбинации с режимом доксорубицин/ доцетаксел вызывало значительное возрастание количества зрелых нейтрофильных гранулоцитов на всех этапах (в 1,1–1,2 раза) и достоверный рост числа активно пролиферирующих морфологически идентифицируемых элементов гранулоцитарного ростка гемопоэза перед 2-м курсом химиотерапии (в 1,14 раза) по сравнению с контрольной группой больных (рис. 2А, Б). Данный факт позволяет говорить о том, что введение цитокина приводит к выраженной активации не только процессов дифференцировки, но и пролиферации в отделе морфологически дифференцируемых элементов нейтрофильного ростка кроветворения.

Как известно, состояние костномозгового кроветворения во многом зависит от функциональной активности пула кроветворных клеток-предшественников, способных давать начало определенному числу зрелых специализированных клеток крови [1, 2]. Нами установлено, что число КОЕ-Г в костном мозге больных РМЖ при лечении по схеме доксорубицин/доцетаксел достоверно возрастало лишь перед вторым курсом ХТ – на 47,1 %. Введение филграстима демонстрировало значительно больший рост числа гранулоцитарных клеток-предшественников в костном мозге больных. Этот показатель в основной группе больных перед вторым курсом ХТ был на 114 % выше, перед третьим курсом ХТ – на 156,6 %, чем у пациентов, получавших химиотерапию без введения гемостимулятора (рис. 2В). Поскольку количественное состояние пула любых незрелых клеток определяется интенсивностью пролиферации и дифференцировки составляющих его элементов, мы обратили особое внимание на изучение этих процессов в отделе прекурсоров грануломоноци-топоэза [1].

Вызванное цитостатическим лечением снижение пролиферативной активности гранулоцитарномакрофагальных предшественников в последний срок исследования полностью нивелировалось под влиянием препарата Г-КСФ. Более того, он вызывал повышение содержания в костном мозге

Рис. 2. Изменения содержания незрелых (А) и зрелых форм нейтрофильных гранулоцитов (Б), количество КОЕ-Г (В), доля КОЕ-Г в S-фазе митотического цикла (Г), интенсивность созревания КОЕ-Г (Д), уровень КСА в супернатантах от адгезирующих (Е) и неадгезирующих (Ж) миелокариоцитов в костном мозге больных РМЖ в процессе химиотерапии с использованием доксорубицина и доцетаксела (прозрачные столбики), либо их комбинации с филграстимом (заштрихованные столбики).

По оси абсцисс – сроки исследования

(1 – до лечения, 2 – перед вторым курсом, 3 – перед третьим курсом), по оси ординат – значения показателя; доверительные интервалы при р<0,05

больных данной группы КОЕ-ГМ, находящихся в S-фазе митотического цикла, до 288,8 % от уровня данного показателя в группе без филграстима. Одновременно с этим в группе пациенток, которым вводили филграстим на фоне таксан-содержащей схемы химиотерапии, как и в группе без стимулятора, наблюдалось ускорение созревания КОЕ-ГМ. Однако интенсивность этого процесса значительно возрастала как перед вторым (в 1,34 раза), так и перед третьим (в 1,33 раза) курсами ХТ по сравнению с контрольной группой (рис. 2Г, Д).

Традиционное мнение о том, что гемостимулирующее действие Г-КСФ обусловлено непосредственным его эффектом в отношении кроветворных клеток, не исключает возможности изменения под его влиянием функции добавочных клеток, формирующих микросреду в гемопоэтической ткани. В связи с этим нами были исследованы уровни КСА супернатантов костномозговых нуклеаров в процессе химиотерапии. Введение препарата Г-КСФ больным РМЖ, леченным по схеме доксорубицин/доцетаксел, вызывало достоверный рост уровня КСА от прилипающих и неприлипающих миелокариоцитов к началу третьего курса ХТ (рис. 2Е, Ж).

Назначение филграстима в перерывах между курсами ХТ вызывало значимое повышение КСА