Механизмы дизрегуляции апоптоза опухолевых клеток линии Р19 в условиях модуляции редокс-статуса

Актуальным направлением в изучении патогенеза опухолевого роста является анализ молекулярных механизмов дизрегуляции апоптоза. Формирование окислительного стресса при опухолевом прогрессировании вносит значительный вклад в определение судьбы клетки за счет вызванной посттрансляционной модификации белков. Оценка возможностей изменения редокс-статуса клетки и вклада процесса глутатиони-лирования белков в регуляторную активность ион-транспортирующих систем позволит вскрыть молекулярные механизмы модификации белковых молекул клетки и дизрегуляции апоптоза [1].

Роль изменений редокс-статуса в реализации программированной гибели клеток неоднозначна и во многом зависит от конкретных условий микроокружения клетки и типа клеточной линии [2]. Особый интерес для экспериментальной онкологии представляют исследования, направленные на изучение общих и частных редокс-механизмов дизрегуляции апоптоза опухолевых клеток. Согласно современным представлениям, модуляция редокс-статуса приводит к перестройке внутриклеточных сигнальных систем, в том числе за счет глутатионилирования белков.

Целью работы явилась оценка роли глута-тионилирования белков и изменения внутриклеточного редокс-статуса в дизрегуляции апоптоза опухолевых клеток линии Р19.

Материал и методы

Материалом для исследования служили опухолевые клетки линии Р19 (тератокарцинома мыши), полученные из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург). Культивирование опухолевых клеток проводили адгезионным методом в полной питательной среде α-MEM («БиолоТ», Россия), содержащей 10 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («БиолоТ»,

Россия), L-глутамин (0,3 мг/мл) («БиолоТ», Россия) и гентамицин (100 мкг/мл) («Микроген», Россия) в СО2-инкубаторе («Sanyo», Япония) при 37°С в атмосфере 5 % СО2. Культуру поддерживали в логарифмической фазе роста и пересаживали каждые 2 дня. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью 0,5 % раствора трипанового синего («Serva», США). Для постановки эксперимента использовались культуры, содержащие не более 5 % погибших клеток.

Модуляцию редокс-статуса клеток осуществляли с помощью добавления в культуральную среду блокатора SH-групп белков и пептидов N-этилмалеимида (NEM), предшественника синтеза глутатиона N-ацетилцистеина (NAC) и протектора тиоловых групп белков и пептидов 1,4-дитиоэритритола (DTE) («Sigma-Aldrich», США) в концентрации 5 мМ. Попадая в клетку, NEM необратимо взаимодействует со свободными SH-группами пептидов и белков, NAC принимает участие в синтезе глутатиона (основного низкомолекулярного антиоксиданта), а DTE обладает способностью восстанавливать дисульфидные связи.

Величину отношения восстановленной формы глутатиона (GSH) к окисленной (GSSG) определяли методом, предложенным M.E. Anderson (1985) в модификации I. Rahman et al. (2006) [3]. Определяли содержание белково-связанного глутатиона методом [4], основанным на способности 1 % боргидрида натрия высвобождать GSH из связи с белками. Результаты представляли в нмоль/мг белка. Содержание белка в клетках определяли по взаимодействию красителя Кумасси голубого G-250 с остатками аминокислот лизина и аргинина белковых молекул [5].

Статистическая обработка полученных данных выполнялась с использованием программы SPSS 17.0. Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Шапиро – Уилка. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрических критериев Краскела – Уоллиса и Манна – Уитни. Данные представляли в виде медианы (Ме), верхнего и нижнего квартилей (Q1–Q3). Статистически значимыми считались различия при р<0,05 [7].

Результаты и обсуждение

Восприимчивость различных типов опухолевых клеток к выраженному окислительному стрессу делает его хорошей потенциальной терапевтической мишенью для разработки новых противоопухолевых агентов. При этом возрастает количество обнаруживаемых молекулярных механизмов, вносящих вклад в формирование состояния окислительного стресса в клетке. К упомянутым механизмам в первую очередь относятся повышение продукции активных форм кислорода, а также истощение системы антиоксидантной защиты в клетке. По современным представлениям, нарушение работы системы антиоксидантной защиты может приводить к формированию состояния окислительного стресса и запуску программированной гибели опухолевых клеток [7]. В результате нашего исследования было установлено, что под воздействием блокатора SH-групп белков и пептидов N-этилмалеимида в клетках опухолевой линии Р19 возникали признаки нарушения редокс-гомеостаза, такие как снижение величины отношения восстановленного глутатиона к окисленному и увеличение концентрации белковосвязанного глутатиона (табл. 1) и активации апоптоза (табл. 2).

Проведена оценка состояния редокс-статуса клеток на основании величины отношения концентраций восстановленной и окисленной форм глутатиона после инкубации опухолевой линии Р19 с блокатором (NEM) или протектором (DTE) SH-групп, а также с предшественником синтеза глутатиона (NAC) в конечной концентрации 5 мМ. В результате установлено снижение в 9 раз величины отношения GSH/GSSG в клетках линии Р19 в условиях воздействия NEM (p<0,05) по сравнению с интактной культурой. Выявленные изменения указывают на нарушение редокс-гомеостаза и формирование состояния окислительного стресса.

Снижение редокс-статуса тиолдисульфидной системы в результате воздействия блокатора SH-групп сопровождалось повышением концентрации таблица 1

величина отношения восстановленного глутатиона к окисленному и содержание белковосвязанного глутатиона в опухолевых клетках линии р19 при культивировании в условиях модуляции редокс-статуса, Ме (Q1–Q3)

Исследуемые показатели	Условия культивирования опухолевых клеток линии Р19 Р19           Р19 + NEM         Р19 + NAC         Р19 + DTE
GSH/GSSG	18,44                   2,04                   14,49                  23,71 (13,15–20,29)           (1,69–5,36)*            (9,68–17,29)           (12,91–24,68)
Белковосвязанный глутатион, нмоль/мг белка	0,60                   2,45                   0,76                   0,78 (0,58 – 0,74)            (2,36–2,87)*             (0,72–0,78)             (0,67–0,83)

Примечание: * – различия между группами Р19 и Р19+N-этилмалеимид(NEM) статистически значимы (p<0,05).

таблица 2

Количество клеток со сниженным митохондриальным потенциалом, аннексин-положительных клеток, уровень экспрессии Cd95 и Cd120, внутриклеточная концентрация ионов кальция в опухолевых клетках линии р19 при культивировании в условиях модуляции редокс-статуса, Ме (Q1–Q3)

Исследуемые показатели	Условия культивирования опухолевых клеток линии Р19
	Р19	Р19 + NEM	Р19 + NAC	Р19 + DTE
Annexin V-FITC+, %	2,65	95,35	4,50	3,20
	(2,20–3,40)	(92,70–95,60)*	(3,70–5,20)**	(3,20–4,30)
CD120, у.е.	0,8	6,0	1,0	2,0
	(0,7–0,9)	(5,6–7,4)*	(0,9–1,0)	(1,7–2,2)*** #
CD95, у.е.	0,9	21,9	1,3	1,4
	(0,7–0,9)	(21,4–23,5)*	(1,2–1,3)**	(1,2–1,5)***
Клетки со сниженным	3,4	93,1	5,8	4,0
митохондриальным потенциалом, %	(3,2–3,5)	(92,5–96,2)*	(5,7–5,9)**	(3,9–4,1)*** #
Внутриклеточная концен-	7,84	29,04	8,03	9,82
трация Са2+, у.е.	(7,78–7,88)	(28,91–29,10)*	(7,96–8,04)**	(9,63–9,88) ** #

Примечание: * – различия между группами Р19 и Р19+N-этилмалеимид(NEM); ** – различия между группами Р19 и

Р19 + N-ацетилцистеин(NAC); *** – различия между группами Р19 и Р19 + 1,4-дитиоэритритол(DTE); # – различия между группами Р19 + NAC и Р19 + DTE – статистически значимы (р<0,05).

белковосвязанного глутатиона в 4 раза (p<0,05) по сравнению с интактной культурой. Таким образом, достигается защита функциональных тиоловых групп внутриклеточных белков от необратимого повреждения прооксидантами. Более того, глута-тионилирование белков, как один из механизмов обратимой окислительной модификации, играет важную роль в модуляции их активности, что приводит к изменению функциональных свойств опухолевых клеток [1].

Экспрессия молекул, участвующих в реализации рецепторного пути апоптоза (CD95 и CD120) в различных типах клеток, подвержена строгому контролю, поскольку её повышение делает клетки высокочувствительными к запуску апоптоза соответствующими лигандами. Однако механизмы такого контроля по-прежнему остаются изученными не полностью, в том числе и в опухолевых клетках. Вероятнее всего, значительное повышение презентации рецепторов смерти клетками тератокарциномы при воздействии блокатора SH-групп указывает на важную роль изменений редокс-гомеостаза в реализации программированной гибели клеток по рецепторному пути. Сопоставляя собственные данные с данными других авторов, можно заключить, что снижение редокс-статуса клеток способствует запуску рецепторного пути активации апоптоза [8]. Ранним маркером активации апоптоза по митохондриальному пути является снижение трансмембранного потенциала (ΔΨm), приводящее в дальнейшем к выходу цитохрома в цитоплазму и формированию апоптосомы. Увеличение количества опухолевых клеток со сниженным значением ΔΨm под действием блокатора SH-групп указывает на важную роль редокс-зависимых механизмов в регуляции митохондриального пути апоптоза в клетках линии Р19.

Система глутатиона может участвовать в регуляции внутриклеточной сигнализации также посредством глутатионилирования и сопутствующего изменения активности ион-транспортирующих систем. Показанное увеличение концентрации ионов кальция в цитоплазме опухолевых клеток линии Р19 в 3,7 раза относительно контроля (p<0,05) в условиях нарушения редокс-гомеостаза (при добавлении NEM в культуральную среду) приводило к запуску апоптоза в 95 % клеток в культуре. Как основные участники апоптоза белки семейства Bcl-2 модулируют внутриклеточные сигналы, многие белки данного семейства меняют свою активность при изменении внутриклеточного редокс-статуса. Например, проапоптотический белок Bax, требующий гомодимеризации для превращения в активную форму, активируется за счет формирования дисульфидных связей [9]. В связи с этим можно обсуждать роль редокс-статуса в молекулярных механизмах дизрегуляции апоптоза опухолевых клеток.

Однако воздействие DTE и NAC не приводило к значимому изменению величины отношения GSH/GSSG и концентрации белковосвязанного глутатиона, но вызывало достоверные изменения маркеров активации митохондриального и рецеп-торопосредованного путей запуска апоптоза. Нами выявлены изменения экспрессии CD95 и CD120, внутриклеточной концентрации Са2+ и митохондриального трансмембранного потенциала. Тем