Механизмы нейропротекции у больных ремиттирующей формой рассеянного склероза, получающих терапию глатирамера ацетатом

Наиболее перспективным направлением в лечении нейродегенеративных заболеваний является нейропротективная терапия [7, 11]. В связи с тем, что в последнее время в патогенезе рассеянного склероза (РС) большое значение придают не только аутоиммунному компоненту, но и неизбежному развитию нейродегенерации, перспективным направлением лечения становится поиск препаратов, способных замедлить этот процесс и затормозить прогрессирование заболевания. В то же время раскрытие новых эффектов в механизме действия известных препаратов позволяет избежать полипрагмазии и сделать лечение наиболее рациональным с точки зрения патогенеза заболевания.

Одним из препаратов, способных замедлить прогрессирование рассеянного склероза путем подавления его аутоиммунных механизмов является глатирамера ацетат (ГА). В результате ряда исследований в нашей стране и за рубежом установлено, что ГА достоверно снижает число обострений и замедляет прогрессирование инвалидизации при рассеянном склерозе. У пациентов не возникает гриппоподобных симптомов, утомляемости, изменения лабораторных показателей [6, 11].

Установлены три основных направления действия препарата:

• 1.    Известно, что препарат в месте инъекции связывается с тримолекулярной структурой основного комплекса гистосовместимости класса I. Предполагается, что он обладает большим сродством к данной структуре, чем основной белок миелина (ОБМ) и другие энцефалитогены, и способен конкурентно их вытеснять. Таким образом, ГА играет роль “ложной мишени”, при взаимодействии с которой запускается пролиферация супрессорных Т-лимфоцитов, тормозится

• 2.    Под действием ГА активируются клоны Т-лимфоцитов, способные проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и вырабатывающие противовоспалительные цитокины [15].

• 3.    ГА участвует в апоптозе активированных Т-лимфоцитов, при этом общими иммуносупрессорными свойствами не обладает [6, 11. 15].

выработка воспалительных цитокинов, что сдерживает развитие аутоиммунной реакции против ОБМ [4].

Задачей настоящего исследования явилось изучение влияния ГА на стратегические направления в патогенезе РС, к которым, несомненно, относятся мембранодестабилизирующие механизмы.

Материал и методы.

Для решения поставленных задач было изучено влияние ГА на клинические проявления и ряд биохимических показателей в процессе двухлетнего применения препарата у 46 больных ремиттирующим рассеянным склерозом (РРС): 35 женщин и 11 мужчин. Контрольную группу составили 20 практически здоровых доноров аналогичного возраста.

В качестве модели для биохимических исследований выбран эритроцит периферической крови. Эритроциты получали из крови локтевой вены. Мембранный комплекс (тени эритроцитов) получали методом осмотического гемолиза. Для приготовления липидных экстрактов использовали 0,1 мл теней эритроцитов. Конечные результаты пересчитывали на миллиграмм липидов, для чего в одном из экстрактов у каждого больного рассеянным склерозом определяли общее содержание липидов с помощью стандартных наборов Био-Ла-Тест.

Исследовали следующие биохимические параметры:

• 1.    Уровень антиоксидантной защиты оценивали на основании:

• а)    определения содержания α-токоферола – жирорастворимого антиоксиданта [ 12 ] ;

• б)    исследования активности супероксиддис-мутазы – фермента антирадикальной защиты [ 14 ] ;

• в)    исследования активности каталазы – фермента антиперекисной защиты [ 3 ] ;

• г)    исследования активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [1].

• 2.    Структуру липидной фазы эритроцитарных мембран оценивали на основании определе-

• ния содержания фосфолипидов в мембранах эритроцитов методом тонкослойной хроматографии на силикагеле [8] и определения холестерина методом, основанном на реакции Злат-киса [10].

• 3.    Активность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали на основании изучения содержания продуктов ПОЛ в мембранах эритроцитов:

  – определение концентрации диеновых конъюгатов (ДК) полиненасыщенных жирных кислот фосфолипидов [ 13 ] ;

  – определение концентрации шиффовых оснований (ШО) [ 9 ] .

• 4.    Исследовали фосфолипазную активность эритроцитов (ФЛα 2 ) [2].

Специальные исследования проведены у каждого больного группы сравнения дважды (перед началом исследований и по их завершению – через 2 года); у каждого больного группы наблюдения первые 6 месяцев исследования – один раз в месяц, в дальнейшем – каждые три месяца (всего 11 исследований у каждого больного в течение 2 лет). Здоровые (контрольная группа) исследованы однократно.

В качестве критериев для определения активности мембрано-дестабилизирующих процессов мы исследовали уровень функциональной активности эндогенных фосфолипаз и динамику накопления продуктов перекисного окисления липидов – диеновых конъюгатов и шиффовых оснований.

Результаты и обсуждение.

Результаты исследования представлены в таблице 1.

В процессе двухлетнего динамического наблюдения была установлена прогредиентная тенденция к снижению исходно повышенного уровня активности фосфолипазы-α₂ и уменьшению содержания продуктов перекисного окисления липидов (диеновых конъюгатов и шиффовых оснований) в мембранах эритроцитов у пациентов на фоне лечения глатирамера ацетатом , наиболее выраженная к концу второго года наблюдения. У больных в группе сравнения, не получавших лечения ГА, сохранялись довольно высокие показатели активности фосфолипазы и содержания продуктов перекисного окисления липидов, достоверно отличные от параметров нормы.

Таблица 1

Активность фосфолипазы-α 2 и содержание липоперекисей в мембранах эритроцитов у больных РРС (M±m)

Анализируемые периоды и клинические группы		Величины анализируемых показателей
Показатели нормы		ФЛα 2 , % гемолиза (4,43±0,21)	ДК, Нмоль/мл (48,4±3,5)	ШО, у.е.флюор. (18,3±1,02)
У больных РРС при первичном обследовании, n=46		19,1±0,21*	125,37±4,1*	28,5±3,5*
В основной группе в процессе лечения глатирамера ацетатом n=23	через 1 месяц	9,83±0,6* **	107,2±5,1* **	20,33±1,8**
	через 2 месяц	5,65±0,1* **	105,8±6,3 * **	19,21±1,1**
	через 3 месяцев	5,57±0,3* **	106,2±3,5* **	21,7±1,3**
	через 4 месяца	5,65±0,2* **	106,7±3,6* **	18,7±1,2**
	через 5 месяцев	6,8±0,1* **	95,48±8,1* **	21,3±1,0**
	через 6 месяцев	6,14±0,1* **	100,1±4,3* **	19,0±1,3**
	через 9 месяцев	5,35±0,2**	112,2±3,3* **	19,1±1,0**
	через 12 месяцев	6,6±0,1* **	76,4±2,8* **	20,3±1,1**
	через 15 месяцев	7,4±0,2* **	86,2±3,1* **	19,6±1,2**
	через 18 месяцев	5,62±0,16* **	100,1±2,3* **	20,0±1,4**
	через 21 месяц	5,35±0,2**	98,3±3,2* **	19,4±1,04**
	через 24 месяца	6,11±0,17* **	96,6±3,4* **	18,8±1,01**
В группе сравнения через 2 года наблюдения, n=23		18,9±0,22*	128,4±3,8*	29,9±2,1*

Примечание: * – достоверность статистических различий между показателями у здоровых и больных РРС;

** – достоверность статистических различий между показателями до назначения глатирамера ацетата и на фоне применения глатирамера ацетата в разные периоды наблюдения

Данное положение свидетельствует о сохраняющейся дестабилизации клеточных мембран на фоне проводимой стандартной терапии и о способности ГА нивелировать данные изменения.

Анализ состояния отдельных звеньев системы антиоксидантной защиты у больных РРС позволил выявить положительные тенденции в результате применения ГА в комплексе лечебных мероприятий (табл. 2).

Так, при исходно сниженном уровне активности ферментов антиоксидантной защиты и истощении пула α-токоферола в мембранах эритроцитов у больных РРС, на фоне применения ГА отмечено повышение активности глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы, супероксиддисму-тазы, каталазы, начиная с конца 1-2 месяца от начала лечения и далее стабильно в процессе двухлетнего наблюдения. Мы установили также постепенное повышение содержания α- токоферола в мембранах эритроцитов больных РС на фоне применения ГА в комплексе лечебных мероприятий. В то же время в группе сравнения отмечен низкий уровень активности ферментов антиоксидантной защиты и истощение пула α-токоферола как на старте, так и в финале исследований (через 2 года от начала исследований).

В целом можно утверждать, что применение ГА в комплексе лечения позволяет уменьшить проявления «оксидантного стресса» в организме больных РРС. Применение ГА препятствует истощению пула альфа-токоферола в организме больных РРС, что оказывает косвенно мембранопротекторное действие.

Подтверждением мембранопротекторного действия ГА являются изменения в структуре липидной фазы эритроцитарных мембран у больных РРС на фоне применения препарата в комплексе лечебных мероприятий.

Таблица 2

Активность ферментов антиоксидантной защиты и содержание альфа-токоферола в мембранах эритроцитов у больных РРС на фоне лечения глатирамера ацетатом в динамике наблюдения (М±m)

Анализируемые периоды наблюдения	Анализируемые показатели у больных РРС (у здоровых)
	Г6ФДГ, мU мл (662,9±29,9)	СОД, % торм. (45,3±2,9)	Каталаза ммоль мин. мл (3,9±0,1)	α-токоферол нмоль. мл (5,8±0,28)
до назначения глатирамера ацетат	485,3±15,6*	42,6±1,3	3,16±0,09*	4,4±0,17*
через 1 месяц	607,13±14,8* **	48,36±1,2  **	3,19±0,09*	4,0±0,18*
через 2 месяца	822,25±15,6* **	59,1±1,6*  **	3,99±0,1  **	4,02±0,19*
через 3 месяца	547,2±19,6 * **	56,4±2,0*  **	3,70±0,08 **	5,21±0,2 **
через 4 месяца	440,8±18,2 *	52,6±2,1*  **	3,61±0,1 *  **	4,35±0,19*
через 5 месяцев	646,5±12,4   **	64,0±1,7*  **	4,14±0,09 **	4,16±0,21*
через 6 месяцев	706,25±21,4  **	40,6±1,9	3,85±0,1 **	4,95±0,  **
через 9 месяцев	749,2±21,6 *  **	54,9±2,8*  **	3,82±0,0 **	4,8±0,2  *
через 12 месяцев	623,8±18,5    **	68,3±2,0*  **	3,7±0,09 **	4,4±0,17 *
через 15 месяцев	783,2±24,3 *  **	55,6±2,3*  **	3,8±0,1   **	4,77±0,21*
через 18 месяцев	843,1±18,9 *  **	59,9±1,8*  **	3,25±0,09*	5,5±0,21  **
через 21 месяц	940,1±27,9 *  **	58,3±1,9*  **	4,61±0,1 *  **	6,1±0,12  **
через 24 месяца	847,9±19,6 *  **	62,3±1,2*  **	4,52±0,08*  **	6,0±0,14  **
В группе сравнения через 2 года наблюдения	476, 2±13,5*	43,4±1,2*	3,21±0,07*	4,0±0,16*

Примечание: * – достоверность статистических различий между показателями у здоровых и больных РРС;

** – достоверность статистических различий между показателями до назначения глатирамера ацетата и на фоне применения глатирамера ацетата в разные периоды наблюдения

Таблица 3 Точкой отсчета в наших исследованиях яв- Соотношение свободный холестерин / эфиры ляется состояние липидной фазы эритроцитар- холестерина в мембранах эритроцитов у больных РРС ных мембран у больных РРС до начала лечения Клинические группы Анализируемый коэффициент ГА. Эти изменения заключаются в повышении содержания в мембранах эритроцитов больных Контрольная группа 4,0 РРС как свободного холестерина, так и его эфи- До назначения глатирамера ацетата 3,5 ров с относительным преобладанием эфиров через 1 месяц 2,8 холестерина. через 2 месяца 5,3 Было установлено, что начиная со второго через 3 месяца 3,5 месяца применения ГА в комплексе лечения, через 4 месяца 4,0 прослеживается тенденция к уменьшению отно- через 5 месяцев 3,1 сительного содержания в мембранах эритроцитов эфиров холестерина, а начиная с девятого через 6 месяцев 1,98 через 9 месяцев 4,4 месяца лечения, эта тенденция приобретает ха- через 12 месяцев 5,1 рактер устойчивой закономерности. Выявленные через 15месяцев 5,2 изменения являются свидетельством мембрано- через 18 месяцев 4,5 стабилизирующего действия ГА, поскольку эфиры холестерина не способны удерживаться в через 21месяц 6,7 через 24 месяца 6,0 мембранах, что значительно снижает микровязкость липидного бислоя (табл. 3).

В целом, полученные данные являются обоснованием мембранопротективного действия ГА при рассеянном склерозе, что существенно расширяет представления о механизме действия препарата. При этом основной механизм реализации мембранопротекции – ограничение мембранодестабилизирующих процессов