Механизмы терапевтического действия саназола

НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН, Россия Инвестиционный Центр Кинки, г. Киото 606, Япония*

Саназол был впервые разработан как гипоксический радиосенсибилизатор для снижения дозы облучения при лучевой терапии онкологических больных. Начиная с 1960-х годов в качестве радиосенсибилизаторов были предложены различные нитроимидазолы, среди которых наиболее востребованными оказались метронидазол и мисонидазол. Тем не менее из-за высокой нейротоксичности нитроимидазолы не получили широкого клинического применения. При разработке более эффективных радиосенсибилизаторов с наименьшим побочным действием был синтезирован ряд нитросоединений, имеющих другую кольцевую структуру, таких как тиазолы, тетразолы и пиридины [57]. Среди них наиболее эффективным оказался препарат АК-2123, получивший название «саназол».

Клинические испытания саназола подтвердили его высокую радиосенсибилизирующую активность, особенно при внутриопухолевом введении [19, 25, 26]. Дальнейшие экспериментальные исследования выявили, что саназол обладает не только радиосенсибилизирующим, но и химиосенсибилизирующим, противоопухолевым, антиметастатическим и иммуномодулирующим действием [14, 32]. Кроме того, на основе саназо-ла синтезирован неинвазивный гипоксический зонд 99тТс-циклам АК-2123 для определения степени гипоксии тканей при ишемии миокарда, головного мозга и других органов, а также опухолевой ткани. Соотношение содержания "тТс-циклама АК-2123 в опухолевой и мышечной тканях (О/М) было 8,5, что сравнимо с другими известными гипоксическими зондами, такими как 99™Tc-(V) DMSA (3.07), 99тТс-цитрат (5.29) и 201Т1С1 (3.29) [45]. Предполагается, что использование в онкологии гипоксических зондов по- зволит в будущем перейти к более обоснованной индивидуализации противоопухолевой терапии [9].

Являясь нитроазольным соединением, сана-зол относится к классу нитрогетероциклических биоредуктивных агентов, молекулярный механизм цитотоксического действия которых состоит в образовании высокореакционных метаболитов, которые ковалентно связываются с нуклеиновыми кислотами, небелковыми тиолами, белками, ненасыщенными липидами и другими макромолекулами [9].

Структурная формула саназола (Ы-(2'-ме-токсиэтил)-2- [3"-нитро-1 "-триазолил] ацетамида) представлена на рис. 1.

Потенциал одноэлектронного восстановления саназола в водной среде, определенный методом пульсивного радиолиза, оценивается в — 0,33 ± 0,02 В [29]. Его растворимость в воде при 30 °С составляет 3,8 г; коэффициент распределения в системе октанол/вода равен 0,14—0,17.

Саназол оказывает радиосенсибилизирующий эффект при его введении в дозе 20—30 мг/кг массы перорально, внутривенно или интратумо-рально. Концентрация в сыворотке крови в первые минуты после внутривенного вливания взрослому человеку 2 г саназола может превышать 0,85 мМ (или 0,2 мг/мл), а при внутриопу-холевом введении концентрация в опухоли и регионарных тканях достигает 2,1—3,0 мМ (или 0,5— 0,7 мг/мл) [28]. В то же время противоопухолевое и антиметастатическое действие саназола проявляется при значительно более низких концентрациях (0,001-1,0 мг/кг массы) [32].

Свободнорадикальные механизмы действия саназола

В настоящее время показано, что для проявления как терапевтического, так и побочного действия нитрогетероциклических соединений необходимо их ферментативное или неферментативное восстановление [12]. Ферментативное восстановление биоредуктивных агентов в клетках организма может катализироваться внутриклеточными флавопротеиновыми редуктазами, включая ферменты, локализованные в цитозоле и микросомах, а также во внешней митохондриальной мембране [44]. Одноэлектронное восстановление биоредуктивных агентов выявлено такими ферментами, как липоамиддегидрогеназа, адре-нодоксин редуктаза, трипанотион редуктаза, NAD(P)H-uirroxpoM Р-450-редуктаза, NO-синтаза, изоферменты цитохрома Р-450 (сур2Ь,, сур2с, сурЗс), цитохром с-редуктаза и NADH-дегадрогёназа дыхательной цепи, альдегидокси-даза, ксантиндегидрогеназа и ксантиноксидаза [8, 20, 37, 39, 41, 58-60]. Одноэлектронное восстановление саназола обнаружено такими ферментами, как ксантиноксидаза и NADPH-цитохром Р-450-редуктаза [6, 54, 56].

Процесс восстановления саназола (R-NO2) одноэлектронными редуктазами и сопутствующую генерацию аниона супероксида (Oi~) в условиях гипоксии можно представить в следующем виде:

R-NO 2 —^e-> R-NO 2 "-^e-^2H+-* R-NO -^е-»

-» R-NCT-A 2н+_> RNHOH        (1)

R-NO 2 " + О₂ -* R-NO2 + О₂-          (2)

Мы предполагаем, что биологическая активация саназола в организме состоит в одно- электронном восстановлении его электронноакцепторной группы (нитрогруппы) до радикала нитроаниона. В гипоксических условиях нитрорадикалы быстро окисляются с образованием О2~, который затем подвергается спонтанной или ферментативной дисмутации с продукцией гидроксильного радикала (ОН) и перекиси водорода (Н2О2). В нормооксических условиях саназол не способен эффективно конкурировать с кислородом в качестве акцептора электронов [6].

Нами было показано, что в течение 3-часовой инкубации саназол переводит оксигемоглобин в метгемоглобин. Возможный биохимический механизм данного процесса может состоять в восстановлении саназола до его нитрозопроизводных, диссоциации NO-группы и образовании свободного оксида азота (NO). При инкубации саназола с опухолевыми клетками мастоцитомы Р815 и лимфомы EL-4 было подтверждено образование в среде нитрит-ионов, что косвенно свидетельствует о продукции в среде NO.

Восстановление саназола до его радикалов может также происходить неферментативно. Для ряда биоредуктивных агентов было показано неферментативное восстановление, например с участием аскорбиновой кислоты [50], катехоламинов [51] или гипоксантина [40]. Хотя активные промежуточные метаболиты биоредуктивных агентов, по-видимому, могут мигрировать из одних клеток в соседние, тем не менее локальное внутриклеточное восстановление и последующая гаптеноконъюгация с макромолекулами является основным механизмом токсического действия фармакологических агентов с электронноакцепторными свойствами.

Саназол способен взаимодействовать с гидратированным электроном (е^-) и радикалом СОг~, образующимися при радиолизе воды, с продукцией нитрорадикалов саназола [29]. Возможно, что радикалы саназола взаимодействуют непосредственно с ДНК опухолевых клеток. Изучение механизма радиосенсибилизирующего действия саназола на грибках Saccharomyces cerevisiae показало, что оно преимущественно обусловлено повреждением ДНК, а не нарушением активности системы ее репарации [47]. Тем не менее не исключается, что радиосенсибилизирующее действие саназола может быть связано с влиянием на метаболизм опухолевых клеток.

Модулирующее действие саназола на эффективность противоопухолевой терапии

Феномен усиления терапевтического действия противоопухолевых препаратов описан для ряда биоредуктивных агентов. Так, мисонидазол усиливает действие мелфалана [12], тирапазамин потенцирует действие цисплатина [16, 17, 43]. Подобный сенсибилизирующий эффект также описан для саназола в отношении других препаратов. Показано, что саназол усиливает повреждающее действие адриамицина, винкристина и цикло-фосфана на опухолевые клетки in vitro [24, 61], но не влияет на противоопухолевое действие цисплатина [42]. В экспериментах на животных с перевиваемыми опухолями установлено, что са-назол в низких дозах (0,1—10,0 мг/кг) значительно повышал эффективность средних и низких доз циклофосфана; при этом наиболее выраженный эффект наблюдался в отношении процесса метастазирования, а не первичного опухолевого узла. Так, у мышей с карциномой легких Льюис и меланомой В-16 использование саназола в сочетании с низкими дозами циклофосфана практически полностью подавляло метастазирование в легкие [3, 35].

На модели экспериментально полученных лекарственно-устойчивых штаммов лейкоза Р388, характеризующихся высокой экспрессией генов множественной лекарственной устойчивости, было выявлено, что саназол в дозах 1,0—10,0 мг/кг повышает чувствительность опухолевых клеток к митомицину С. Авторами было отмечено, что величина модулирующего эффекта саназола зависит от исходной чувствительности штамма к митомицину С и ассоциирована с наличием в клетках гена сорцина (цитозольный Саг+-связы-вающий белок) [21]. Это позволило предположить, что действие саназола определяется его влиянием на активный транспорт Са2+. Предполагается также, что саназол может усиливать проникновение алкилирующих противоопухолевых препаратов через поры в ядерной мембране и тем самым облегчать их взаимодействие с ДНК опухолевых клеток [31].

Способность саназола в низких дозах повышать эффективность цитостатической терапии может быть связана с его влиянием на процессы мембранного ионного транспорта, проявлением самостоятельного противоопухолевого и антиме-тастатического эффекта, регуляцией активности эффекторных клеток иммунной системы, моду-И ляцией опухолевых антигенов с повышением их иммуногенности.

Некоторые исследователи выявили увеличение саназолом противоопухолевой активности локальной гипертермии [15, 38, 46, 49], однако другие авторы не смогли обнаружить такого эффекта саназола [36, 42].

Противоопухолевое и антиметастатическое действие саназола

В экспериментах по изучению химиосенсибилизирующей активности саназола было показано, что он оказывает также существенное самостоятельное ингибирующее влияние на метастазирование карциномы легких Льюис и меланомы В-16, однако при этом подавление роста первичного опухолевого узла было отмечено только у мышей с меланомой в умеренной степени (около 20%) [32]. Впоследствии на модели меланомы В-16 эти авторы показали, что противоопухолевое и антиметастатическое действие саназола в низких и ультранизких концентрациях (от 10 мг/кг до 1СИ мг/кг) зависит от схемы его введения. Десятидневное курсовое введение препарата перед трансплантацией опухолевых клеток приводило к умеренному торможению роста первичной опухоли, частоты и интенсивности метастазирования (на 20—25%), в то время как его использование в течение 10 дней после опухолевой трансплантации было более эффективным. Наиболее выраженный терапевтический эффект наблюдался в том случае, когда саназол применяли как до, так и после трансплантации клеток меланомы В-16: торможение роста первичного опухолевого узла составило 50—60%, частоты метастазирования -60—70%, интенсивности метастазирования — 8098% [32, 33].

Высокоэффективное антиметастатическое действие саназола было также показано на моде-1 ли экспериментального метастазирования в печень аденокарциномы кишечника АКАТОЛ, которое было индуцировано внутриселезеночным введением опухолевых клеток. Курсовое введение саназола в дозе 10 мг/кг со 2-го по 9-й день после опухолевой трансплантации на 80—90% подавляло появление метастатических колоний в печени; по эффективности это соответствовало применению 5-фторурацила в терапевтической дозе [34].

Таким образом, введение саназола в низких дозах мышам-опухоленосителям приводило к торможению роста опухоли и ингибированию метастазирования. При этом в эксперименте in vitro мы показали, что саназол не оказывает прямого повреждающего действия на клетки меланомы В-16 и не подавляет их пролиферацию. Этот факт, наряду с более эффективным действием препарата на процесс метастазирования, чем на рост первичной опухоли, свидетельствует об участии эффекторных клеток иммунной системы организма в реализации биологической активности саназола.

Иммуномодулирующее действие саназола

Выше мы уже отмечали, что противоопухолевое и антиметастатическое действие саназола может быть обусловлено его модулирующим влиянием на активность клеток иммунной системы. Нами было показано , что повышение терапевтической эффективности циклофосфана при его сочетанном использовании с саназолом у мышей с карциномой легких Льюис было связано с усилением активности естественных киллерных клеток и цитостатических эффекторов селезенки [2].

На модели меланомы В-16 у мышей мы показали, что наибольший антиметастатический эффект саназола при его введении до и после трансплантации опухоли ассоциировался с максимальной цитостатической активностью перитонеальных макрофагов, лимфоцитов селезенки, а также с их высокой литической активностью [4].

Тестирование влияния саназола на иммуно-компетентньге клетки при курсовом введении препарата здоровым мышам (1,0—10,0 мг/кг, внутрибрюшинно) выявило его стимулирующий эффект на функциональную активность перитонеальных макрофагов и естественную киллерную активность спленоцитов на фоне повышения клеточности селезенки [13]. Саназол также существенно усиливал пролиферативную активность лимфоцитов [3, 27], которая служит одним из важных интегральных показателей, характеризующих способность к адекватному иммунному ответу на антигенные раздражители. Известно, что регуляция функциональной активности иммунокомпетентных клеток осуществляется цитокинами, которые продуцируются в процессе клеточной активации. Мы показали, что саназол ин- дуцирует экспрессию целого ряда ключевых им-мунорегуляторных цитокинов — интерлейкина-1, фактора некроза опухоли-Ct, интерферона-ОС [3]. Все эти данные указывают на возможность регуляции саназолом не только противоопухолевой активности клеток естественной резистентности, но и клеток, участвующих в формировании специфического иммунного ответа.

Наши исследования также показали, что сана-зол в концентрациях от 0,6 до 10 мМ приводит к повышению уровня спонтанной генерации активных форм кислорода (АФК) перитонеальными макрофагами, которая регистрировалась с помощью флуоресцентного красителя дихлор-флуоресцеиндиацетата. Максимальный эффект наблюдался при концентрациях саназола 1,25 и 2,5 мМ. В то же время было зарегистрировано ингибирующее действие саназола на продукцию АФК макрофагами, стимулированными форбол-12-миристат-13-ацетатом (ФМА).

Возможный механизм действия саназола в низких дозах

Как уже было отмечено выше, Н.В. Коновалова с соавт. [33] показали, что максимальное противоопухолевое действие саназола на модели меланомы В-16 наблюдается при его введении в дозе 1 мг/кг ежедневно по следующей схеме: в течение 10 дней до инокуляции опухолевых клеток и 10 дней после. Введение саназола только до или только после инокуляции клеток опухоли менее эффективно. По этой схеме было исследовано противоопухолевое действие 18 биоредук-тивных агентов, в том числе производных 2-нитроимидазола, 2-метил-5-нитроимидазола и 3-нитротриазола [33]. Подавление роста опухоли препаратами варьировало от 10 до 61%. Механизм противоопухолевого действия этих соединений, по-видимому, может быть феноменологически сходен с реакцией контактной чувствительности на высокореакционные низкомолекулярные соединения, являющейся вариантом гиперчувствительности замедленного типа.

Анализируя с этих позиций результаты работ Н.В. Коноваловой с соавт. [32, 33], можно предположить, что введение саназола до инокуляции опухолевых клеток приводит к сенсибилизации организма, а последующее введение препарата после трансплантации опухоли вызывает развитие воспалительной реакции и цитотоксического действия на опухолевые клетки клеточных факторов (Т-киллеры) иммунной системы вследствие селективного образования конъюгатов «саназол— опухолеассоциированный антиген» в гипоксической опухолевой ткани. Действительно, трансплантация опухоли меланомы В-16 путем введения под кожу мыши 5х10б клеток в объеме 0,2 мл должна создавать зону локальной гипоксии и приводить к селективному накоплению в этом участке электронно-акцепторных соединений. Связывание саназола с макромолекулами гипоксической ткани в организме показано с помощью недавно синтезированного препарата 99тТс-цик-лам АК-2123 [45]. Антиметастатическая активность саназола может быть объяснена тем, что опухолевые клетки, несущие эпитопы неоантигенов, на этапах метастазирования более доступны для действия цитотоксических иммунных факторов, чем в зоне первичной опухоли.

Исходя из этого, можно предположить, что один из механизмов противоопухолевого действия саназола при его использовании в низких дозах состоит в индукции иммунного ответа на опухоль в организме хозяина в результате образования «противоопухолевой вакцины in vivo» путем конъюгации активированного саназола с антигенами опухолевой ткани. Новые антигенные де- терминанты способны индуцировать синтез антител и формирование специфических Т-киллеров. Для этого гаптены должны презентироваться на поверхности лазматической мембраны после внутри- или внеклеточного образо- j вания. Более подробно данная гипотеза изложена •, нами в работах [7,53].

Саназол, однако, может модулировать активность опухолевых или иммунокомпетентных кле-; ток в результате связывания с другими, отличными от молекул главного комплекса гистосовместимости, поверхностными или внутриклеточ-; ными макромолекулами, которые осуществляют рецепторные функции и участвуют в физиоло-гаческом процессе регуляции экспрессии генов. На основе данных о противоопухолевом и анти-метастатическом действии различных нитроазолов (в том числе саназола) может быть построена математическая модель количественной взаимосвязи структура—активность [1, 30]. Подобные pa-боты позволяют выявить роль различных факторов молекулярного распознавания (электронная плотность, гидрофобные характеристики и объем заместителей), а также участие отдельных фрагментов молекул нитроазолов в проявлении указанных видов биологической активности. Найденные значения импакт-факторов для нитроазолов могут быть использованы в дальнейшем при de novo дизайне соединений с противоопухолевым действием.

Модуляция терапевтического действия саназола

Значительную роль в механизме защиты клеток от биоредуктивных агентов и АФК, генерируемых при аутооксилении их нитрорадикалов, играют эндогенные антиоксиданты глутатион и токоферол, а также антиоксидантные ферменты, такие как супер оксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза и др. Мы предполагаем, что, модулируя активность антира-дикальной ферментативной системы, можно, с одной стороны, повышать эффективность прямого противоопухолевого воздействия саназола, а с другой — снижать его побочное действие. В частности, показано, что витамин Bi и аскорбиновая кислота повышают радиосенсибилизирующую активность саназола в отношении бактерий Е. coli (AB 1157) [22, 23]. Дальнейшее направление исследований в этом плане может быть наме- чено путем анализа механизма действия других нитрогетероциклических соединений. Было показано, что саназол значительно снижает концентрацию восстановленного глутатиона в опухолевых клетках HeLa [62]. Увеличение расхода глУга-тиона клетками может происходить как в результате его взаимодействия с радикалами нитрогете-роциклических соединений, так и с Н2О2 в реакции, катализируемой глутатионпероксидазой. Анион-радикалы нитрогетероциклических соединений слабо взаимодействуют с глутатионом [48]. Более активно с глутатионом связываются нитрозопроизводные [18]. Показано, что ферментативное связывание нитрозофуранов с глутатионом катализируется глутатионтрансферазой. В ходе этой реакции освобождается нитрит-ион [11]. Возможно, что по сходному механизму происходит генерация нитрит-ионов саназолом.

Одноэлектронное восстановление нитросоединений в аэробных условиях может приводить к быстрому истощению в клетках NADPH вследствие его потребления МАО(Р)Н~редуктазами и глутатионпероксидазой. Снижение в клетках динамической концентрации NADPH вызывает увеличение уровня окисленного глутатиона [10] и снижение скорости глутатионзависимого процесса детоксикации этих агентов .

Заключение

Проведенный в настоящей работе обзор литературных данных и собственных результатов показал, что саназол (препарат АК-2123) обладает как радиосенсибилизирующим, так и противоопухолевым, антиметастатическим и иммуномодулирующим действием. В высоких дозах саназол проявляет радиосенсибилизирующую активность. Он усиливает повреждающее действие целого ряда цитостатических препаратов (адриами-цин, винкристин, митомицин С и циклофосфан) на опухолевые клетки in vitro. Способность сана-зола в низких дозах повышать эффективность цитостатической терапии in vivo, кроме этого, может быть связана с его влиянием на процессы мембранного ионного транспорта (активный транспорт Са2+), проявлением самостоятельного противоопухолевого и антиметастатического эффекта, регуляцией активности эффекторных клеток иммунной системы, модуляцией опухолевых антигенов с повышением их иммуногенно- сти. Терапевтическая эффективность саназола может быть положительно модулирована другими соединениями, в частности агентами с антиоксидантными свойствами.

При введении саназола в организм происходит его биологическая активация путем восстановления электронно-акцепторной группы (нитрогруппы) до радикала нитроаниона, с участием ферментов ксантиноксидазы и цитохром-Р-450-редуктазы. В гипоксических условиях нитрорадикалы быстро окисляются с образованием Ог~, который затем подвергается спонтанной или ферментативной дисмутации с продукцией АФК. Кроме того, нитрозопроизводные саназола могут быть источником оксида азота, цитотоксические и регуляторные свойства которого хорошо известны. В нормооксических условиях саназол не способен эффективно конкурировать с кислородом в качестве акцептора электронов. Проявление того или иного биологического эффекта са-назола во многом зависит от дозы, схемы и способа введения препарата, а также от степени ок~ сигенации в различных тканях организма.