Механизмы врожденного иммунитета. Изучение с использованием мышиной модели

Развитие экспериментальной биологии в конце XX – начале XXI века привело к прорыву в исследованиях клеточных и молекулярных механизмов иммунитета. Это относится в первую очередь к пересмотру ранее сложившихся представлений о роли врожденного иммунитета в общей системе иммунитета организма. Во многом этому способствовало развитие молекулярногенетических методов исследования. В настоящее время причины развития многих патологий человека интенсивно изучаются. Тем не менее генетическое разнообразие человека осложняет диагностику и лечение различных заболеваний. Так, например, известно, что предрасположенность к сепсису в ходе иммунного ответа на инфекцию находится под строгим генетическим контролем [58]. Более того, хорошо изучена роль полиморфизма в генах, кодирующих белки острой фазы септического шока, таких как TNF (фактор некроза опухоли, ФНО), IL-1, IL-6 [44]. Тем не менее наличия мутантной аллели по одному из этих генов далеко не достаточно для возникновения предрасположенности к сепсису, которая существенно зависит от окружения, расовой и этнической принадлежности [57].

Осознавая проблему индивидуального разнообразия человека, основоположники мышиной генетики использовали инбридинг для выведения генетически однородных мышиных линий ( inbred mouse lines , или classical inbred mice ), что позволило изучать экспериментальную инфекцию на строго определенном генетическом фоне [19], [42]. В то же время наличие отличающихся друг от друга инбредных линий позволяет использовать их в генетическом анализе [47]. В результате почти вековой работы было выведено около 200 инбредных линий мышей,

различающихся между собой фенотипическими характеристиками [49]. На рис. 1 представлена фотография мышей двух линий – MSM и MOLF. Различия в фенотипе между двумя инбредными линиями могут быть использованы в классическом (classical, или formal) генетическом анализе. В дополнение к этому наличие полностью секвенированного и аннотированного мышиного генома, полиморфных маркеров и других информационных ресурсов способствует развитию классической генетики в мышиной модели. В последние десятилетия было установлено, что многие из инбредных линий различаются по предрасположенности к бактериальным, вирусным и паразитарным инфекциям и, следовательно, могут быть использованы в классическом генетическом анализе [26]. Классический генетический подход исторически определяется как прямая (forward) генетика [5]. Такой подход основан на знании фенотипа, нахождении двух инбредных линий (в случае мышиной модели), различающихся по этому фенотипу, и определении (с помощью картирования) геномного локуса, отвечающего за фенотип. На последней стадии проводят скрещивание родительских линий с целью определения ассоциации (корреляции) между фенотипом и генотипом в полученном потомстве. Альтернативными прямой генетике являются методы так называемой обратной генетики [2], в соответствии с которыми сначала производится делеция (нокаут – knockout) гена с последующим изучением фенотипов, которые могли измениться в животном с нокаутированным геном [15]. Таким образом, в прямой генетике по функциональному тесту (фенотип) находят ген, в то время как в обратной генетике посредством нокаута проверяют предположение о функции гена. Обратная генетика эффектив- на, если очевидна функция гена; в противном случае предсказать функцию сложно, особенно в отсутствие ярко проявляемого фенотипа [7]. Практическая невозможность предсказания функции многих генов накладывает серьезные ограничения на обратную генетику [64]. Более того, учитывая, что функциональное разнообразие (число фенотипов) в природе значительно превышает число генов в млекопитающих (25 тысяч), можно заключить, что подавляющее большинство генов имеют не одну, а несколько функций, которые чрезвычайно трудно определить с помощью обратной генетики.

Таким образом, поскольку определить все функции с помощью обратной генетики невозможно, классическая генетика представляется единственным и наиболее перспективным подходом для нахождения функций генов [8]. Поэтому в данном обзоре мы ограничимся рассмотрением наиболее удачных примеров использования методов классической генетики для клонирования генов, ответственных за иммунный ответ.

Рис. 1. Мыши линий MOLF/Ei и MSM/Ms

РОЛЬ ЛПС-ГЕНА В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА

В течение долгого времени считалось, что ЛПС (липополисахарид) – это составная часть бактериального эндотоксина, который был впервые изолирован из грамотрицательных бактерий и идентифицирован К. Пфайфером в начале прошлого века [56]. Структура бактериального ЛПС представлена на рис. 2. В 1947 году Пфайфер доказал, что ЛПС и эндотоксин идентичны, после чего оба термина стали использоваться как синонимы. Чувствительность к ЛПС варьирует в широком диапазоне в различных видах [3]. Так, птицы, рептилии и амфибии почти нечувствительны к ЛПС. В то же время инъекция ЛПС способна вызывать лихорадку, шок и повреждение органов у многих млекопитающих [9]. Тем не менее некоторые из них, например мыши, крысы, павианы, относительно нечувствительны к ЛПС, а другие виды (человек, кролик) обладают наибольшей чувствительностью к ЛПС. Например, смертельная доза ЛПС для мыши и кролика различается на четыре порядка (104) и позволяет предположить, что чувствительность к ЛПС генетически обусловлена [68]. Гипотеза о гене, определяющем чувствительность к ЛПС, получила подтверждение в 1968 году после обнаружения ЛПС-резистентной линии мышей (C3H/HeJ), происходившей из одной линии с ЛПС-чувстви-тельными мышами линии C3H/HeN [63], которые были разделены на две независимые линии после спонтанной мутации в ЛПС-рецепторе, получившем название ЛПС-ген (LPS-gene, или Lps). Наличие двух конгенных инбредных линий, отличающихся между собой только чувствительностью к ЛПС, позволило постулировать наличие специфического рецептора к ЛПС. Мутантный фенотип в C3H/HeJ линии был описан в 1968 году, а в 1978-м была охарактеризована другая линия ЛПС-резистентных мышей C57BL10/SccR [14] и был установлен аллельный характер мутации в C3H/HeJ- и C57BL/10SccR-мышах (две разные мутантные аллели одного и того же гена ответственны за резистентность к ЛПС). Кроме того, было показано, что мутация в ЛПС-гене напрямую связана со способностью распознавания грамотрицательных бактерий, так как C3H/HeJ-мыши были нечувствительны к ЛПС, но чрезвычайно чувствительны к Salmonella typhimurium инфекции и умирали от инфекционной дозы, которую ЛПС-чувстви-тельные C3H/HeN-мыши переносили легко [45]. Таким образом, наличие функционального ЛПС-гена было критично для распознавания ЛПС и борьбы хозяина с патогенными микроорганизмами, а следовательно, его выживания.

0-антиген Сахаридное ядро            Липид А

I--------------------------------------------------------------------------------II-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------II----------------------------------------------------------------1

РЭтМКДО P-P-3tN у-х "1 ГлюМАц Гал Гел Р КДО Глюм]<Й%§§£ ,                             Т -WSR^

ООО ООО -Тлю—Гал—Тлю—Гел—Гел КДО— ГлюМ

П                          Р ApaN

Рис. 2. Структура липополисахарида Salmonella spp .

Показаны углеводы, входящие в состав липида А: глюкозамин (ГлюN) и 4-аминоарабиноза (ApaN), а также углеводы ядра 2-кето-3-дезоксиоктонат (КДО), адаптировано из: http://www.center-hc.ru/diseases/infection2.htm

Первые данные по картированию ЛПС-гена на 4-й мышиной хромосоме были опубликованы в 1978 году [69], но потребовалось еще 15 лет для начала работ по позиционному клонированию. За это время были накоплены данные о полиморфных маркерах, необходимых для картирования генов, а также были разработаны методы клонирования больших фрагментов ДНК – YAC (Yeast Artifi cial Chromosome) и BAC (Bacterial Artificial Chromosome), необходимых для установления геномной последовательности. Работы по позиционному клонированию ЛПС-гена нача- лись в 1993 году независимо в трех лабораториях (Beutler [53], Malo [54] и Shwartz) и успешно завершились в 1998 году публикацией статьи [51], в которой B. Beutler с коллегами охарактеризовали мутацию в мышином TLR4 (Toll-Like Receptor) гене, состоявшую в замене эволюционно консервативного пролина на гистидин (P712H) в цитоплазматическом домене рецептора (рис. 3). Важную роль в идентификации TLR4 как ЛПС-рецептора имели генетические исследования Толл-рецептора в дрозофиле, где Толл (Toll) важен не только в эмбриональном развитии [28], но и для защиты от грибковой инфекции [38]. Последнее обстоятельство поддерживало идею об иммунной функции мышиного гомолога Толла. Как и ожидалось, TLR4 оказался трансмембранным рецептором, содержащим цитоплазматический домен, способный передавать сигнал от ЛПС внутрь клетки, активируя таким образом транскрипционные факторы, отвечающие за продукцию воспалительных цитокинов и выработку защитных иммунных механизмов.

Рис. 3. Схема расположения мутации в мышином TLR4 ( Toll-Like Receptor ) гене. Мутация приводит к замене эволюционно консервативного пролина на гистидин (P712H) в цитоплазматическом домене рецептора [51]

Обнаруженная мутация P712H препятствовала правильной димеризации рецептора и его активации [71]. Последующие кристаллографические и биохимические исследования подтвердили, что пролин важен для сохранения конформации цитоплазматического домена, участвующего в димеризации рецептора. Рецептор присутствует на мембране в пресобранном состоянии, и добавление ЛПС индуцирует сближение и димеризацию двух соседних молекул рецептора [35]. Важная роль цитоплазматического домена, также называемого TIR-доменом (Толл Интерлейкин-1 Рецептор), состоит в передаче клеточного сигнала, который активирует транскрипционные факторы, участвующие, в свою очередь, в экспрессии и синтезе воспалительных цитокинов [31]. Замена пролина на гистидин препятствует димеризации TIR-домена и его взаимодействию с другими молекулами, такими как MyD88, TIRAP и TRIF [34]. И наконец, в подтверждение гипотезы об аллельном характере дефекта в C3H/HeJ- и C57BL10/SccR-мышах, было показано, что C57BL10/SccR-мыши не синтезируют Tlr4 из-за делеции в ЛПС-локусе размером примерно 75 кб [52]. Таким образом, завершилась тридцатилетняя история поиска гена, который стал одним из первых членов хорошо известного в настоящее время семейства Толл-подобных рецепторов, каждый из которых отвечает за узнавание разных компонентов бактерий (грампо-ложительных и грамотрицательных) и вирусов.

После идентификации TLR4 как рецептора к бактериальному эндотоксину стало понятно, что остальные Толл -подобные рецепторы тоже могут узнавать различные микробные компоненты. Действительно, функции остальных членов семейства были охарактеризованы с помощью обратной генетики (нокаут генов). Так, TLR2 в комбинации с TLR1 или TLR6 участвует в узнавании липопептидов, пептидогликана, липотей-хоевой кислоты и других бактериальных компонентов [20]. TLR3 [4], TLR7 [16], TLR8 и TLR9 [29] локализованы преимущественно в эндосомах, где они распознают нуклеиновые кислоты микробного происхождения [13]. Нокаут каждого из указанных рецепторов приводил к потере защиты мышей от различных бактериальных и вирусных инфекций [30]. Генетические открытия в области мышиных Толл -подобных рецепторов способствовали исследованиям полиморфизма гомологичных генов у человека. Несмотря на то что данные об ассоциации между полиморфизмами в TLR4 человека и предрасположенностью к бактериальным инфекциям были опубликованы, в этой области много противоречий. Так, например, предрасположенность к бактериальным инфекциям в детском возрасте в некоторых случаях объясняется мутациями в IRAK4 [50] и MYD88 [11], а некоторые больные вирусным энцефалитом имеют нефункциональные UNC93B1 [12] и TLR3 [72] из-за мутаций в этих генах.

МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА ОТ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ

Место проникновения бактерий в организм называется входными воротами инфекции. Здесь на борьбу с бактериями поднимаются фагоцитирующие клетки. Первый сигнал мобилизации эти клетки получают от самих бактерий-агрессоров в виде молекул их токсинов. Одновременно с фагоцитозом бактерий макрофаги начинают синтезировать и выделять воспалительные цитокины – интерлейкин-1, фактор некроза опухолей и др. Под влиянием цитокинов усиливается прилипание циркулирующих лейкоцитов к эндотелию сосудов и мобилизация в очаг инфекции. Те же цитокины усиливают антибактериальную активность фагоцитов. Если фагоцитирующие клетки не справляются с очищением очага инфекции от бактерий, интерлейкин-1 выполняет роль межклеточного сигнала. Он вовлекает в процесс активации Т-лимфоциты и включает механизмы специфического иммунного ответа.

Фагоцитоз является одним из наиболее эффективных методов устранения патогена хозяйской клеткой, которая использует низкое рН фагосом и лизосом для разрушения и расщепления микроорганизмов с помощью протеаз и ак- тивных радикалов. Поэтому среди разнообразных механизмов адаптации к хозяйской клетке некоторые микроорганизмы эволюционировали с целью избежать фагосом или даже изменить свойства самих фагосом. Так, например, упоминавшийся ранее NRAMP является одним из компонентов фагосомы, используемой клеткой для разрушения микроорганизмов. NRAMP локализован на мембране поздних эндосом / лизосом и быстро рекрутируется к мембране фагосом и содержащимся в них микробам. NRAMP способствует оттоку ионов кальция из фагосомы, что приводит к снижению уровня этого важного иона, обедняя микробное микроокружение и затрудняя микробную жизнедеятельность [21]. Таким образом, NRAMP конкурирует с бактериями за возможность модулировать функции фагосом.

Другим примером воздействия бактерий на клеточный аппарат является инфекция внутриклеточной бактерией Legionella pneumophila, к которой человеческие макрофаги обычно нечувствительны, а мышиные макрофаги чувствительны и быстро умирают. Исключение составляет линия мышей A/J, которая поддерживает рост бактерий. Этот дефект был картирован на 13-й хромосоме [17], а именно в локусе, содержащем несколько полноразмерных и неполных копий генов семейства Naip [6], [61]. Функциональная комплементация с использованием трансгенных мышей подтвердила, что геномом, отвечающим за фенотип, является NAIP5 [18], [70]. То обстоятельство, что ген принадлежит к NLR (Nod-Like Receptor) семейству, отвечающему за узнавание бактериальных компонентов, позволило предположить, что ген может распознавать компоненты Legionella [24]. Оказалось, что NAIP5 взаимодействует с бактериальным флагеллином, попадающим в клетку через секреторную систему 4-го типа [55]. После распознавания флагеллина NAIP5 активирует CASP1 каспазу, участвующую в синтезе IL-1 и клеточной смерти посредством пироптозиса. Недавние исследования с использованием CASP1-/-и IPAF-/- нокаутных мышей позволили предположить, что после распознавания компонентов Legionella NAIP5 активирует IPAF-dependent инфламмасому, что приводит к антибактериальной активности и клеточной смерти [70]. Более того, бактериальные мутанты флагеллина, но не дикие штаммы Legionella растут нормально в макрофагах линии С57BL/6, подтверждая таким образом критическую роль флагеллина в иммунном ответе к Legionella [55]. Исследования NAIP5-/- макрофагов пролили свет на механизм действия NAIP5. Наличие функционального NAIP5 ассоциируется с даун-регуляцией маркеров шероховатого эндоплазматического ретикулума и ап-регуляцией лизосомных маркеров, таких как LAMP-1 и cathepsin, что свидетельствует о созревании фагосомы [40]. Эти изменения протекают очень быстро, в течение нескольких часов после инфекции, что позволяет предположить активацию дополнительных внутриклеточных компонентов, способных бороться с бактерией. Идентификация этих компонентов представляет значительный интерес.

Идентификация так называемого BCG-гена является одним из первых примеров использования прямой генетики для позиционного клонирования генов [62]. Результаты этой работы были опубликованы в 1993 году, задолго до получения сиквенса мышиного генома и широкого распространения Интернета, что затрудняло биоинфор-матический анализ результатов генетического картирования. До появления этой публикации было показано, что Bcg отвечает за защиту от таких микроорганизмов, как S. typhimurium , Mycobacterium bovis (BCG) [10]. Было также известно, что различные инбредные линии мышей сильно отличаются по своей чувствительности к инфекции in vivo и in vitro [25], [65]. В ходе предварительного генетического анализа было показано, что защита от внутриклеточной инфекции находится под контролем одного гена, который получил название Bcg . Поскольку клонировать Bcg -ген приходилось в отсутствие достаточной информации о мышином геноме и детальной карты генома, группе под руководством Е. Ска-мене потребовалось самостоятельно клонировать генетические маркеры, строить геномный контиг из искусственных хромосом, заниматься обогащением локус-специфических кДНК и использовать другие молекулярно-биологические методы. Содержащийся в критической геномной области ген получил название Nramp1 ( Natural Resistance-Associated Macrophage Protein 1 ) и кодировал мембранный гликопротеин, содержащий 12 трансмембранных доменов [66]. Один из нескольких идентифицированных при сравнении различных мышиных линий полиморфизмов Gly169Asp (G169D) полностью коррелировал с устойчивостью к вышеуказанным инфекциям in vivo и in vitro [67]. Результаты позиционного клонирования Bcg подтвердились с помощью его геномного нокаута, который привел к резкому повышению чувствительности мышей 129SV линии к инфекциям S . typhimurium , L. donovani , M. bovis (BCG). Кроме того, перенос резистентной Nramp1G169 аллели на чувствительную линию мышей C57BL/6J ( NrampD169 ) приводил к увеличению устойчивости этих мышей к инфекции [27]. Было также показано, что замена G169D нарушает конформацию белка и его посттрансляционный процессинг, что приводит к отсутствию зрелого пептида на клеточной мембране [23]. Мутации в человеческом гене NRAMP1 ассоциируются с повышенной чувствительностью к туберкулезу в популяции из Африки и Азии, но не из Европы.

Предыдущий пример с NAIP5 демонстрирует, что апоптоз как результат отношений между хозяином и патогеном является предпочтительным, выигрышным для хозяина, и потому ассоциируется с устойчивостью к инфекции. Несмотря на то, что клетка умирает, на уровне организма происходит освобождение от патогена. Похожая стратегия используется в туберкулезной инфекции [61]. Важность проблемы туберкулеза трудно переоценить, учитывая глобальный характер заболевания. Согласно современным данным, около 32 % населения инфицировано Mycobacterium tuberculosis [39]. Инбредные мышиные линии используются для изучения туберкулеза в течение последних 60 лет. Экспериментальное инфицирование резистентных мышей, таких как C57BL/6, C57BL/10 и BALB, приводит к низким титрам инфекции, в то время как чувствительность к туберкулезу в линиях CBA, DBA, C3H ассоциируется со значительными инфекционными титрами в легких, воспалительной реакцией, приводящей к разрушению легочной ткани и в конечном счете смерти [1]. Действительно, макрофаги резистентных мышей в ходе инфекции более предрасположены к апоптозу, чем макрофаги чувствительных животных [33]. Эти исследования показали, что инфекция находится под контролем нескольких генов, из которых удалось идентифицировать только один локус на 1-й хромосоме. Генетический контроль ответа на Mycobacterium tuberculosis подтверждается данными на человеке, а именно: 1) семейной предрасположенностью к болезни; 2) фенотипическим анализом в моно- и дизиготных двойниках; 3) половыми и расовыми различиями в чувствительности к болезни [22]. Несмотря на то что генетические исследования велись исключительно на людях, первый ген был идентифицирован в мышах И. Крамником и сотрудниками. Он вместе с коллегами прокартировал Sst1 (Susceptibility to tuberculosis – чувствительность к туберкулезу) на центральном участке хромосомы 1 [37]. Исследования конгенных C3HeB/FeJ животных с резистентной B6sst1R аллелью выявили, что Sst1 оказывает разнообразный эффект по отношению к различным инфекциям, включая Listeria monocytogenes. Более того, экспрессия нормальной аллели этого гена в дефектных C3HeB/FeJ-мышах восстанавливала резистентность к туберкулезной инфекции и к устойчивости макрофагов in vitro. В результате многолетней работы был позиционно клонирован ген под названием Ipr1, функциональная копия которого присутствовала в резистентной к инфекции линии, но не в чувствительной линии мышей [46]. IPR1 мРНК активируется в ответ на интерферон, а продукт трансляции содержит сигнал ядерной локализации и транскрипционной активности. Человеческий гомолог IPR1 способен взаимодействовать с белками вируса гепатита С и вируса Эпштейна – Барр. Все это позволяет предположить, что IPR1 участвует в транскрипционной активации макрофагов в ответ на инфекцию [36].

МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА ОТ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

Особенность вирусов как паразитов состоит в том, что они предпочитают внутриклеточный паразитизм, то есть жизнь и размножение исключительно внутри клеток хозяина и за их счет. Как в таких условиях бороться против вируса-паразита? Остается два пути: или атаковать и убивать зараженные вирусами клетки вместе с вирусами, или каким-то образом воспрепятствовать внутриклеточному размножению вирусов, если не удалось помешать их внедрению. По первому пути идут разные типы цитотоксических клеток-киллеров, защищающих организм от вирусов. Распознав на поверхности зараженной клетки чужеродные антигены, клетки-киллеры впрыскивают в такую клетку-мишень содержимое своих цитоплазматических гранул (куда входит фактор некроза опухолей и другие молекулы, повреждающие клетку-мишень). Результатом атаки киллера, как правило, является гибель клетки-мишени вместе с внутриклеточными паразитами. Правда, гибель и разрушение собственных клеток организма не безразличны для его жизнедеятельности. При некоторых вирусных инфекциях такого рода защитные реакции приносят больше вреда, чем пользы.

Другой механизм защиты против вирусов – молекулярный. За противовирусную защиту ответственны молекулы интерферонов. Они способны «интерферировать», то есть противодействовать процессам биосинтеза вирусных частиц в клетке хозяина. Интерферон синтезируется клеткой-продуцентом в ответ на заражение вирусом и соединяется с соответствующими рецепторами на поверхности зараженных клеток. Взаимодействие цитокина (в данном случае интерферона) со своим специфическим рецептором влечет за собой передачу внутриклеточного сигнала к ядру клетки. В клетке включаются гены, ответственные за синтез белков и ферментов, препятствующих самовоспроизведению вируса.

Использование мышиной модели в изучении генетики иммунного ответа на вирусные инфекции привело к открытию гена, участвующего в защите от различных флавивирусов, – 2’,5’-олигоаденилат-синтетазы 1b (Oas1b) [48]. Кроме того, эти исследования выявили важный интер-ферон-зависимый механизм защиты хозяйского организма от вирусной инфекции. Устойчивые к этому вирусу мышиные линии содержат полноразмерную копию Oas1b. В отличие от них, чувствительные к вирусу мышиные линии содержат мутацию, приводящую к трансляции неполноразмерного OAS1 полипептида [43]. OAS1 активируется интерфероном и отвечает за синтез олигоаденилатов, активирующих РНКазу, которая деградирует вирусную и клеточную РНК. Анализ человеческой ДНК выявил ряд полиморфизмов, которые коррелируют с активнос- тью этого фермента, а также с уровнем ответа на вакцинацию против вируса желтой лихорадки. Таким образом, позиционное клонирование Oas1b стимулировало изучение полиморфизма у человека и в конечном счете улучшило диагностику этого вирусного заболевания.

В Западном полушарии вирус, вызывающий лихорадку Западного Нила, последний раз был обнаружен в 1999 году, когда он произвел эпидемию вирусного энцефалита в Нью-Йорке [41]. Однако этот и другие флавивирусы, включая вирус желтой лихорадки, Денги и японского энцефалита, представляют значительно бóльшую проблему на всей территории Африки и Ближнем Востоке, где эти вирусы являются постоянными возбудителями заболеваний. Большинство флавивирусов имеют РНК-вый геном размером примерно 10 кб, содержат РНК и реплицируются в клетке через двуцепочечные РНК-интермедиаты преимущественно в антиген-презентующих клетках. Большинство инфекционных случаев протекают без осложнений, но около 20 % заболевших имеют риск переноса инфекции в нервную систему, что может привести к менингиту, энцефалиту и параличу. Нейроны являются главной мишенью вируса, от репликации и распространения которого защищает интерферон. Было обнаружено, что инбредные линии мышей значительно различаются по своей чувствительности к экспериментальной вирусной инфекции. Большинство лабораторных линий мышей, таких как C57BL/6, C3H/HeJ, BALB/C, CBA, PERA, принадлежащих в основном к подвиду Mus musculus domesticus , очень чувствительны к экспериментальной флавивирусной инфекции, в то время как так называемые дикие мыши подвида Mus musculus musculus чрезвычайно устойчивы к инфекции [59]. Было также показано, что иммунный ответ на вирусную инфекцию находится под контролем одного локуса, получившего название Flv ( Flavivirus ).

Когда устойчивую к инфекции аллель Flv перенесли на чувствительную к вирусу линию C3H.PR1, мыши полученной конгенной линии C3H.PR1-flvR приобретали резистентность к инфекции и были использованы для точного картирования Flv локуса на 5-й мышиной хромосоме с разрешением до 0,5 сМ [60]. Последующий скрининг генов-кандидатов идентифицировал семейство генов, кодирующих 2’,5’-олигоаде-нилат-синтетазу (Oas), из которых только Oas1b был важен в иммунном ответе на вирус лихорадки Западного Нила (WNV – West Nile Virus). Все чувствительные к WNV линии мышей содержали замену Т на С, что приводило к замене аргинина на стоп-кодон и потере ферментативной активности. Было также показано, что активированная OAS участвует в синтезе олигоадени-латов, которые активируют РНК-азу L, разрушающую вирусную и клеточную РНК. Важная роль этого фермента в деградации вирусной РНК подтверждается тем, что мыши, дефектные по протеинкиназе R и РНК-азе L, демонстрируют повышенную летальность при инфицировании WNV и имеют более высокий титр вируса в периферийных тканях в первые часы инфекции. Недавние генетические исследования на пациентах, больных вирусом лихорадки Западного Нила, показали ассоциацию между Т210С-поли-морфизмом и предрасположенностью к болезни. Эти исследования также показали, что Т210С-замена приводит к альтернативному сплайсингу транскрипта OAS и образованию доминант-не-гативной изоформы фермента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенные примеры картирования генов позволяют сделать следующие выводы.

Во-первых, научное познание с точки зрения классической (формальной) генетики начинается с фенотипа и заканчивается «генетическим» объяснением фенотипа. В этом обзоре была рассмотрена лишь небольшая часть примеров таких фенотипов, основанных на взаимодействиях между хозяином и патогеном. Почти все они в течение десятилетий представляли загадку не только для генетиков, но и для инфекционистов, эпидемиологов и, что не менее важно, врачей. В этой связи инбредные линии мышей способствовали значительному прогрессу в понимании механизмов врожденного иммунитета. Поэтому трудно переоценить значение мышиной модели, которая нуждается в дальнейшей популяризации в биологических науках.

Во-вторых, несмотря на то что большинство представленных фенотипов привели к раскрытию функции одного гена, в действительности взаимодействие хозяина с микроорганизмом – многостадийный процесс, в котором участвует большое количество клеточных и вирусных компонентов. Поэтому выявленные гены были специфичны именно для выбранного фенотипического скрининга, например бактериального титра в макрофагах. Можно предположить, что для другого скрининга разница в фенотипе позволила бы идентифицировать другие гены. Все это расширяет возможности мышиной генетики.

И наконец, фенотипическая разница между инбредными линиями часто может объясняться не одним геном (моногенная характеристика), а несколькими (полигенная характеристика). В таком случае картирование привело бы к идентификации нескольких генов, хотя в реальности картирование комплексных фенотипов бывает затруднено. Можно надеяться, что совершенствование методов картирования, прогресс био-информатического обеспечения и появление новых мышиных моделей, особенно на основе уже упоминавшихся диких линий мышей, поможет решить эту и другие проблемы генетического изучения различных патологий, в первую очередь опухолевых и аутоиммунных.