Механизмы взаимодействия мелатонина с лимфоцитами

Мелатонин (N-ацетил-5-метокситриптамин) – гормон, который секретируется преимущественно эпифизом и является одним из самых многофункциональных регуляторов в организме: он контролирует ритмы сна и бодрствования, репродукцию и костный метаболизм, а также нервную, сердечнососудистую, пищеварительную и эндокринную системы [Mahmood, 2019; Ferlazzo et al., 2020]. Кроме того, мелатонин обладает антиоксидантными, противовоспалительными, противоопухолевыми свойствами [Cutando et al., 2012; Tan et al., 2015; Favero et al., 2017] и является потенциальным терапевтическим средством при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, нейродегенеративных расстройств и нарушений метаболизма [Srinivasan, Cardinali, Srinivasan, 2011; Cardinali et al., 2011; Sun, Gusdon, Qu, 2012; Lin et al., 2013; Xu et al., 2019; Spinedi, Cardinali, 2019; Shen et al., 2022].

Наряду с этим, гормон участвует в работе иммунной системы: иммунокомпетентные клетки экспрессируют специфические рецепторы для мелатонина, а также его неспецифические мишени, и эффективно регулируются гормоном, что подтверждено многочисленными работами [Drazen et al., 2000; Guerrero, Reiter, 2002; Pozo et al., 2004; Ragonda, Diederich, Ghibelli, 2010]. Но если в отношении мелатонин-зависимой регуляции клеток неспецифического иммунитета большинство исследователей единодушны [Calvo, Gonzalez-Yanes, Maldonado, 2013; NaveenKumar et al., 2020], то данные по влиянию гормона на эффекторы адаптивного иммунитета, в частности, на Т-лимфоциты, крайне противоречивы [Raghavendra et al., 2001; Arias et al., 2003; Carrillo-Vico et al., 2013; Gupta, Haldar, 2013; Alvarez-Sanchez et al., 2015]. И разрешить эти противоречия можно, очевидно, только с учетом наличия и уровня экспрессии мишеней для мелатонина в исследуемых клетках – именно такой анализ является предметом настоящего обзора.

Мелатонин-зависимая регуляция лимфоцитов

Роль мелатонина в регуляции иммунной системы и, в частности, основных эффекторов адаптивного иммунитета, лимфоцитов, известна давно. Тем не менее, имеющиеся на сегодняшний день данные по проблеме вызывают больше вопросов, чем ответов. С одной стороны, показано стимулирующее действие гормона как на ранние этапы активации лимфоцитов, так и на их функциональную дифференцировку. Так, мелатонин усиливает продукцию IL-2, экспрессию рецептора для IL-2 (IL-2-зависимый сигнал необходим для индукции пролиферации) [Garcia-Maurino et al., 1997; Carrillo-Vico, Lardone, Naji, 2005; Gupta, Haldar, 2013] и пролиферативный ответ Т- и В-лимфоцитов [Drazen et al., 2000; Raghavendra et al., 2001; Arias et al., 2003; Gupta, Haldar, 2013]. Более того, в экспериментах in vitro показана собственная продукция мелатонина Т-лимфоцитами в ответ на поликлональную активацию, причем в количествах, превышающих его верхний физиологический уровень, и участие такого эндогенного мелатонина в качестве аутокринного или паракринного фактора в индукции синтеза Т-клетками IL-2 и IL-2-рецептора

[Carrillo-Vico et al., 2004, 2005; Lardone et al., 2006, 2010; Naranjo et al., 2007] – это позволяет рассматривать гормон в качестве облигатного эндогенного костимулятора Т-лимфоцитов. В подтверждение этих данных выявлено гормон-зависимое повышение экспрессии активационного маркера лимфоцитов CD69 [Garcia-Maurino et al., 1997], костимулирующей мембранной молекулы CD28 и маркера Т-клеточной активации р21 наивными CD4⁺Т-лимфоцитами [Yoo et al., 2016], а также маркеров пролиферации Ki67 и Bcl2 антиген-специфичными Т-лимфоцитами [Yoo et al., 2016]. Одновременно показано стимулирующее действие мелатонина и на функциональную дифференцировку Т-хелперов (Th): он повышал продукцию ключевого Th1-цитокина IFNγ [Garcia-Maurino et al., 1997, 1999], а мы в недавней работе выявили гормон-зависимую стимуляцию дифференцировки Т-хелперов, продуцирующих IL-17 (Th17) [Куклина, Глебездина, Некрасова, 2015]. Наряду с этим, продемонстрирована способность мелатонина ингибировать апоптоз лимфоцитов, индуцируемый различными стимулами [Espino et al., 2011; Espino, Rodriguez, Pariente, 2013], что также вносит вклад в активацию клеток. Эти эффекты подкрепляются и данными in vivo : у грызунов Funambulus pennantii экзогенный гормон повышал Т-зависимый иммунный ответ, усиливая реакцию гиперчувствительности замедленного типа, и вызывал бласттрансформацию спленоцитов [Gupta, Haldar, 2013], а в исследовании на цыплятах-бройлерах пролиферация тимических Т-лимфоцитов позитивно коррелировала с концентрацией мелатонина в плазме, тогда как пинеалэктомия, сопровождавшаяся снижением уровня гормона в циркуляции, снижала Т-клеточную пролиферацию, как и блокада мелатонинового рецептора МТ1 [Chen et al., 2016].

С другой стороны, имеется не меньшее количество работ, демонстрирующих иммуносупрессивную активность мелатонина. В частности, мелатонин снижает продукцию IFNγ CD4⁺Т-лимфоцитами в ответ на поликлональную активацию ex vivo , но повышает уровень IL-4 и IL-10, сдвигая цитокиновый профиль в направлении Th2-типа [Raghavendra et al., 2001], а в работе Alvarez-Sanchez с коллегами стимуляция мононуклеарных клеток лимфоузлов аутоантигеном pMOG на фоне гормона приводила к снижению числа TNF-позитивных CD4⁺Т-лимфоцитов, не влияя на уровень IL-17⁺CD4⁺ и IFNγ⁺CD4⁺Т-лимфоцитов [Alvarez-Sanchez et al., 2015]. В то же время, Farez с соавторами продемонстрировали способность мелатонина ингибировать дифференцировку наивных CD4⁺Т-клеток в Th17 in vitro в Th17-поляризующих условиях, не оказывая влияния на развитие Th1, Th2 и классических Treg [Farez et al., 2015]. В экспериментах in vivo введение экзогенного мелатонина мышам сопровождалось снижением уровня IFNγ и одновременным повышением IL-4 в сыворотке [Shaji, Kulkarni, Agrewala, 1998], а также снижением продукции IFNγ и TNF CD4⁺Т-лимфоцитами ex vivo [Alvarez-Sanchez et al., 2015]. А у мышей, стимулированных аутоантигеном MOG, экзогенный мелатонин снижал численность IFNγ⁺CD4⁺, TNF⁺CD4⁺ и IL-17⁺CD4⁺Т-лимфоцитов в ЦНС [Alvarez-Sanchez et. al., 2015], а также IL-17⁺IFNγ⁺CD4⁺ и IL-17⁺GM-CSF⁺CD4⁺Т-лимфоцитов в селезенке, лимфоузлах и в ЦНС [Farez et al., 2015].

При анализе приведенных выше данных обращает на себя внимание, что непосредственные эффекты гормона в отношении лимфоцитов, как правило, стимулирующие [Drazen et al., 2000; Arias et al., 2003; Espino, Rodriguez, Pariente, 2013], тогда как основная часть иммуносупрессивных эффектов получена в экспериментах in vivo . И в этой связи важно учитывать, что мелатонин контролирует синтез целого ряда других гормонов гипоталямо-гипофизарно-адренальной и/или гонадальной осей, многие из которых сами являются эффективными иммуномодуляторами [Gupta, Haldar, 2013], поэтому действие мелатонина in vivo могут опосредоваться и нивелироваться другими гормонами, в частности, такими мощными иммуносупрессорами, как глюкокортикоиды или половые стероидные гормоны. Однако различия в методических подходах не позволяют полностью разрешить противоречия в эффектах мелатонина в отношении лимфоцитов – для этого необходимо разобраться с вопросом о специфических и неспецифических мишенях гормона в лимфоидных клетках.

Лимфоцитарные рецепторы для мелатонина и неспецифические внутриклеточные мишени

У млекопитающих идентифицировано два типа высокоаффинных мембранных рецепторов для мелатонина, MT1 и MT2 [Reppert, Weaver, Ebisawa, 1994; Reppert et al., 1995; Dubocovich, Markowska, 2005]. В недавних работах были представлены структуры этих рецепторов, полученные рентгеновской кристаллографией и криоэлектронной микроскопией [Johansson et al., 2019; Okamoto et al., 2019; Stauch et al., 2019]. MT1 и MT2 являются типичными G белок-связывающими рецепторами, имеющими 55% идентичности [Dubocovich, Markowska, 2005]. Оба рецептора действуют в основном через ингибиторные G-белки, Gi, подавляя аденилатциклазу и, как следствие, вызывая снижение уровня cAMP и активности сАМР-зависимой протеинкиназы PKA в клетке [Comai, Gobbi, 2014; Emet et al., 2015], а для МТ2 показано действие и через гуанилатциклазную систему [Dubocovich, Markowska, 2005; Comai, Gobbi, 2014]. MT1 и MT2 имеют разную аффинность к мелатонину – 80.7 и 383 pM, соответственно [Kato et al., 2005]. Оба рецептора широко представлены в иммунной системе, в том числе на мембране лимфоцитов

[Pozo et al., 2004; Ekmekcioglu, 2006; Lardone et al., 2011; Espino, Rodriguez, Pariente, 2013; Kuklina, 2014; Куклина, Глебездина, Некрасова, 2015; Глебездина и др., 2019a, b].

Наряду с мембранными рецепторами, идентифицирован высокоаффинный ядерный рецептор для мелатонина – это транскрипционный фактор, принадлежащий семейству ассоциированных с ретиноевой кислотой орфанных рецепторов (retinoic acid-related orphan receptor, ROR), RORα [Wiesenberg et al., 1995; Lardone et al., 2011], хотя в настоящее время непосредственное взаимодействие гормона с RORα оспаривается [Slominski et al., 2014]. Так, в 1995 г. I. Wiesenberg с коллегами идентифицировали RORα как ядерный рецептор для мелатонина [Wiesenberg et al., 1995], определив с помощью классического скэтчардовского анализа константу диссоциации для взаимодействия RORα с мелатонином (Kd = 1 .71 nM). В 2011 г. P.J. Lardone с коллегами «переоткрыли» RORα как рецептор для мелатонина [Lardone et al., 2011], показав на Т-лимфоцитарной линии Jurkat, что мелатонин копреципитируется (иммуноблоттинг) и колокализуется с RORα (иммунофлуоресцентный анализ), а также в наномолярных концентрациях вызывает перераспределение RORα внутри клетки, регистрируемое с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии [Lardone et al., 2011], что, хотя и косвенно, но убедительно указывает на взаимодействие гормона с RORα. Однако в 2014 г. A.J. Slominski с коллегами не выявили специфического связывания мелатонина с RORα в ходе кристаллографического исследования лиганд-связывающего домена RORα, а также функционального анализа способности мелатонина напрямую регулировать RORα [Slominski et al., 2014]. Следует отметить, что, несмотря на высокий методический уровень, работа имеет как минимум два слабых момента: во-первых, авторы никак не объясняют и не упоминают работы своих предшественников, оценивших конкретные параметры лиганд-рецепторного взаимодействия; во-вторых, представленные в статье результаты функциональных тестов явно неубедительны – мелатонин использован в работе в микромолярных концентрациях, в которых он неспецифически взаимодействует с другими внутриклеточными мишенями, которые будут рассмотрены ниже, и эффекты мелатонина, опосредуемые этими мишенями, вероятнее всего, просто перекрывают RORα-зависимое действие гормона. Так или иначе, вопрос о том, является ли RORα специфическим рецептором для мелатонина, до сих пор остается открытым [Ма et al., 2021]. Однако независимо от того, регулирует ли мелатонин RORα напрямую или такая регуляция опосредуется другими факторами (например, сигналами от мембранных рецепторов МТ1/МТ2), участие RORα в реализации эффектов мелатонина подтверждено многочисленными исследованиями [Lardone et al., 2011; Куклина, Глебездина, Некрасова, 2015; Garcia et al., 2015; Farez et al., 2016; Глебездина и др., 2019a, b; Ding et al., 2019; Huang et al., 2020; Li et al., 2020; Zang et al., 2020]. Важно отметить, что RORα имеет непосредственное отношение к иммунорегуляции – он выявляется как в миелоидных [Pozo et al., 2004], так и в лимфоидных [Lardone et al., 2011; Куклина, Глебездина, Некрасова, 2015; Глебездина и др., 2019a, b] клетках и служит одним из двух ключевых транскрипционных факторов, ответственных за дифференцировку и функционирование Т-хелперов, продуцирующих IL-17 (Th17), наряду с RORγt [Yang et al., 2008; Kojima, Muromoto, Takahashi, 2012]. Активация RORα промотирует дифференцировку Th17 и значительно усиливает продукцию IL-17А и IL-17F, тогда как дефицит этого фактора сопровождается снижением экспрессии IL-17 in vitro и in vivo [Yang et al., 2008; Kojima, Muromoto, Takahashi, 2012]. Кроме того, RORα является негативным регулятором активации Treg [Du et al. 2008].

Помимо прочего, в микромолярных концентрациях мелатонин может взаимодействовать с другими внутриклеточными мишенями, такими как кальмодулин, глутатион трансфераза [Leon et al., 2000; Ra-dogna, Diederich, Ghibelli, 2010] или хинон-редуктаза 2, идентифицированная как еще один, цитоплазматический рецептор для мелатонина, МТ3 [Calamini et al., 2008]. А поскольку указанные факторы являются облигатными для организма, большинство клеток служат потенциальными мишенями для мелатонина, хотя низкая аффинность этих факторов делает возможным такое взаимодействие только при концентрациях мелатонина, значительно превышающих физиологические.

В целом, что касается лимфоцитов, эти клетки экспрессируют как минимум два высокоаффинных рецептора для мелатонина – мембранные МТ1 и МТ2 [Reppert, Weaver, Ebisawa, 1994; Reppert et al., 1995], а для Т-хелперной популяции Th17 и для части регуляторных Т-лимфоцитов (regulatory T cells, Treg) к мембранным рецепторам добавляется ядерный, RORα [Wiesenberg et al., 1995; Lardone et al., 2011]. И все специфические рецепторы имеют разную аффинность к мелатонину: между мембранными рецепторами разница в 5 раз [Kato et al., 2005], что соответствует физиологическим колебаниям уровня гормона в течение суток, а аффинность ядерного на два порядка ниже, чем мембранных. Кроме того, в микромоляр-ных концентрациях мелатонин способен связываться с другими внутриклеточными мишенями, такими как хинон-редуктаза 2, идентифицированная как еще один, цитоплазматический рецептор для мелатонина, МТ3 [Calamini et al., 2008], или кальмодулин [Leon et al., 2000; Radogna, Diederich, Ghibelli, 2010], также присутствующие в лимфоцитах и участвующие в антиген-зависимой активации клеток. Связывание разных рецепторов запускает, по-видимому, различные сигнальные механизмы, приводящие к разным последствиям. Как следствие, физиологические, патологические и фармакологические концентрации мелатонина могут иметь совершенно разные иммуномодулирующие эффекты, и противоречия в данных по действию мелатонина на иммунную систему могут быть связаны, в том числе, и с этим фактом.

Заключение

Наличие у лимфоцитов большого количества мишеней для мелатонина с разной аффинностью к гормону свидетельствует о том, что ключевым моментом, определяющим направленность эффектов гормона в отношении этих клеток, является его концентрация. При этом важно учитывать и собственную продукцию мелатонина лимфоцитами, возрастающую при активации и превышающую его физиологические уровни в экспериментах in vitro [Carrillo-Vico et al., 2004; Carrillo-Vico, Lardone, Naji, 2005; Lardone et al., 2006, 2010; Naranjo et al., 2007], поскольку мелатонин, синтезируемый лимфоцитами, может маскировать эффекты как эндогенного гормона, секретируемого эпифизом, так и экзогенного. Не случайно стимулирующий эффект гормона в отношении продукции Т-лимфоцитами IL-2 и IFNγ in vitro выявлялся только для неактивированных клеток или в случае слабой активации, и для физиологических концентраций мелатонина [Garcia-Maurino et al., 1997]. И анализ других данных подтверждает это предположение: стимулирующие эффекты гормона выявляются в основном в физиологических условиях или при иммунодефицитных состояниях [Garcia-Maurino et al., 1997; Drazen et al., 2000; Arias et al., 2003], тогда как иммуносупрессивная активность мелатонина часто демонстрируется в условиях избыточной активации иммунной системы [Carrillo-Vico et al., 2005; Wu et al., 2012]. С этих позиций не выглядят неразрешимыми противоречия в данных о гормон-зависимой регуляции дифференцировки клеток Th17: мы показали стимулирующее действие для физиологических и низких фармакологических концентраций мелатонина [Куклина, Глебездина, Некрасова, 2015; Глебездина и др., 2019b], укладывающихся в диапазон аффинности его специфических рецепторов, в то время как в работе М.F. Farez с соавторами, продемонстрировавшей ингибиторные эффекты мелатонина, гормон использован in vitro в концентрации 500 нг/мл, которая несопоставима ни с физиологическими, ни с фармакологическими уровнями гормона. А в микромолярных концентрациях эффекты мелатонина реализуются преимущественно через неспецифические (низкоаффинные) мишени, такие как хинон редуктаза 2 или кальмодулин, – к слову, в ряде исследований мелатонин в таких дозах эффективно подавляет пролиферацию опухолевых клеток и индуцирует их апоптоз [Sanchez-Barcelo et al., 2005; Pariente et al., 2017], то есть демонстрирует эффекты, противоположные многократно подтвержденным эффектам для физиологических концентраций гормона. Важно также отметить, что при обсуждении RORα-зависимого действия мелатонина нужно учитывать ограниченную экспрессию RORα в лимфоцитах – он является облигатной молекулой в клетках Th17, для которых служит дифференцировочным фактором, а также в части регуляторных Т-клеток, но не представлен в остальных Т-хелперных популяциях, таких как Th1 или Th2, и не может опосредовать гормональные эффекты в этих клетках.

В целом, обсуждая и прогнозируя эффекты мелатонина в Т-лимфоцитах, следует учитывать два основных момента: во-первых, наличие у этих клеток трех типов специфических рецепторов и множества неспецифических мишеней для гормона, с разной аффинностью и разными сигнальными механизмами, что определяет прямую зависимость эффектов гормона от его концентрации, а также от наличия и уровня экспрессии соответствующих мишеней; во-вторых, участие мелатонина in vivo в синтезе целого ряда других гормонов, многие из которых являются эффективными иммунорегуляторами и могут как усиливать, так и нивелировать эффекты самого мелатонина.