Место анаэробных микроорганизмов рода Veillonella в инфекционных осложнениях у онкологических больных

ные микроорганизмы. Для их «выращивания» необходимо специальное оборудование, так как анаэробы культивируют в «строгих» условиях, в бескислородной среде. Кроме того, нужны подготовленные микробиологи, знающие технологию культивирования анаэробов [2]. Большая часть лабораторий в России не располагает такими ресурсами. В результате при назначении терапии врачи не учитывают возможность наличия анаэробной инфекции, что, в свою очередь, ведет к неэффективности стартовой антибактериальной терапии, росту показателей атрибутивной летальности, увеличению количества койко/дней и финансовых затрат, а также к росту резистентности анаэробной инфекции к антибиотикам, используемым в лечебном учреждении [3]. В настоящее время появилось большое количество устойчивых к стандартным антибактериальным препаратам анаэробов [4]. Veillonella spp. – один из наиболее проблемных анаэробных грамотрицательных кокков. Veillonella spp. является этиологическим агентом инфекций кровотока [4–6], эндокардитов [7, 8], менингитов [9], пневмоний [10]. Чаще всего в биоматериале микроорганизм выделяется в ассоциациях с другими госпитальными патогенами. Пристального внимания заслуживают штаммы Veillonella parvula, Veil-lonella dispar и Veillonella atypica. Идентификация бактерий методом секвенирования гена 16SpPHK является «золотым стандартом» лабораторной диагностики. Однако точность метода неоднозначна. Необходимы дополнительные исследования [11, 12]. Прямой MALDI-масc-спектрометрический метод позволяет экономически более выгодно и быстро идентифицировать анаэробные микроорганизмы, заменив трудоемкие биохимические и антигенные методы идентификации [13–19]. Внедрение масс-спектрометрического метода идентификации в микробиологию явилось крупным прорывом в систематике бактерий за последнее десятилетие [13]. В результате возможно своевременно диагностировать анаэробную инфекцию и грамотно планировать лечебную тактику.

Цель исследования – оценить уровень резистентности штаммов Veillonella spp. к пенициллину, метронидазолу, амоксиллин/клавуланату, имипенему при различных инфекционных осложнениях у онкологических больных.

Материал и методы

Работа выполнялась c 2004 по 2016 г. на базе лаборатории микробиологической диагностики и лечения инфекций в онкологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Изучено 70 биоматериалов онкологических больных: раневое отделяемое, содержимое полостей, абсцессов, желчь, кровь. Выделен и проанализирован 71 штамм анаэробных грамотрицательных кокков. Первичный посев биоматериала производили на агар Шедлера (с добавлением гемина, ме- надиона и 5 % дефибринированной крови крупного рогатого скота) и тиогликолевый бульон. Инкубация осуществлялась в строго анаэробных условиях с использованием газогенерирующих пакетов Gas Pak или системы Anaero Gen при температуре 37ºС в течение 48–72 ч. После получения роста колоний на агаре Шедлера штаммы повторно рассевали на чашки с агаром Шедлера и чашки с 5 % кровяным агаром. Далее инкубировали в течение 24 ч: чашки с агаром Шедлера – в анаэробных условиях, с 5 % кровяным агаром – в аэробных. Рост колоний на 5 % кровяном агаре через 24 ч свидетельствовал об отсутствии строго анаэробной флоры в данном материале.

Последующую идентификацию микроорганизмов осуществляли с использованием современных микробиологических анализаторов: Walk Away, Vitek-2, Micro Scan. C использованием прямого MALDI-масс-спектрометрического метода дополнительно изучалась вариабельность MALDI-масс-профилей штаммов Veillonella spp., выделенных по единому протоколу от онкологических больных. Согласно инструкции производителя, коэффициент достоверности (Score Valuе) – биостатический параметр, который отражает степень совпадения спектра неизвестного микроорганизма со спектром референсного микроорганизма. Чем выше Score Valuе, тем полнее совпадение. Score 2.000–3.000 – достоверная идентификация до вида. Score 1.700– 1.999 – достоверная идентификация до рода. Score 0.000–1.699 – недостоверная идентификация.

Из клинического образца мы выделили 1 штамм Acidаminococcus intestine, который по структуре генетически сходен с Veillonella spp., поэтому включили его в наши исследования [20]. Фенотипическая и биохимическая дифференциация между видами затруднена. Большинство Veillonella spp ., а также виды других анаэробных грамотрицательных кокков не были включены в базы данных экспертной системы Walk Away. Содержали, например, только один вид Veillonella – V. рarvula. В работе с оборудованием Micro Scan и Vitek мы использовали Rapid 32A или Vitek – 2 ANC.

Штаммы хранили при температуре –70ºС. Чувствительность определяли с помощью Walk Away, Vitek-2 и Е-тестов. Контрольные минимально ингибирующие концентрации антибиотиков оценивали согласно критериям EUCAST (табл. 1).

Результаты

Чаще всего выделяли V. parvula – 37 штаммов (53 %), а затем V. dispar – 16 (23 %) и V. atypica – 16 (23 %). Основным источником выделения Veil-lonella spp. была желчь – в 25,7 %; отделяемое из брюшной полости – в 24,3 %; нижние дыхательные пути – в 22,9 %; раневое отделяемое – в 20 %; из облаcти эндопротеза – в 4,3 %; из крови и мочевыводящих путей – по 1,4 % случаев (табл. 2).

Таблица 1

Минимально ингибирующие концентрации МИК (мкг/мл) антибиотиков по EUCAST

Антимикробный препарат	≤S	>R
Бензилпенициллин	≤0,25	>0,5
Амоксициллин/клавуланат	≤4	>8
Имипенем	≤2	>8
Метронидазол	≤4	>4

Таблица 2

Штаммы Veillonella spp., выделенные из различных клинических образцов

Клинические образцы n=70	Штаммы Veillonella spp.
	V. parvula (n=37, 53 %)	V. dispar (n=16, 23 %)	V. atypica (n=16, 23 %)	V. denticariosi (n=1, 1 %)
Инфекции нижних дыхательных путей 16/70 (22,9 %)	8/37 (21,6 %)	4/16 (25 %)	4/16 (25 %)	-
Интраабдоминальные инфекции 17/70 (24,3 %)	11/37 (30 %)	3/16 (18,7 %)	3/16 (18,7 %)	-
Желчь 18/70 (25,7 %)	10/37 (27 %)	1/16 (6,3 %)	7/16 (43,8 %)	-
Раневое отделяемое 14/70 (20 %)	6/37 (16,2%)	6/16 (37,4 %)	2/16 (12,5 %)	-
Инфекции эндопротеза 3/70 (4,3 %)	1/37 (2,6 %)	1/16 (6,3 %)	-	1/1 (100 %)
Мочевые инфекции 1/70 (1,4 %)	1/37 (2,6 %)	-	-	-
Кровь 1/70 (1,4 %)	-	1/16 (6,3 %)	-	-

Одновременно из одного клинического образца (плевральная жидкость) были выделены два разных вида: V. atypica и V. dispar. Поскольку V. atypica образует более крупные колонии, чем V. dispar, одним пересевом удалось получить «чистые» культуры Veillonella spp. Единственный штамм Veillonella denticariosi был выделен из аспирата перипротезной области у ребенка с хондросаркомой бедренной кости. Всего лишь один штамм Acidаminococcus intestine выделили из абсцесса в брюшной полости пациента с раком прямой кишки. V. рarvula и V. atypica наиболее часто выделялись из образцов желчи, всего лишь один штамм V. dispar был выделен из желчи. Однако V. parvula и V. dispаr по сравнению с V. atypica чаще выделялись из абсцессов и хирургических ран. Все изоляты Veil-lonella spp. были выделены в сочетании с аэробной микрофлорой, и ни один изолят не был выделен в монокультуре, включая образцы крови.

Результаты идентификации MALDI-TOF MS показали спектры хорошего качества: всего 68 изолятов (95,7 %) были идентифицированы с оценкой совпадения выше 2.000, среди которых 17 изолятов (23,9 %) были идентифицированы с оценками выше 2.300. Только один изолят V. dispar и 2 изолята V. parvula были идентифицированы с показанием Scores от 1.900 до 1.999. Виды dispar/ рarvula анаэробных бактерий рода Veillonella имеют генетическое сходство, и их дифференциация затруднена. Выделенный из аспирата перипротез-ной области штамм V. denticariosi сгенерировал оценку 2.323, и Acidаminococcus intestine, выделенный из кишечника, обозначил оценку совпадения – 2.346 (табл. 3).

Рассмотрим распределения МИК среди 64 изолятов, представленных в табл. 4. Количество чувствительных штаммов к пенициллину среди V. parvula и V. dispar составило 14,3 % (5/35) и 15,4 % (2/13). Ни один из 15 штаммов V. atypica не был чувствителен к пенициллину. Минимально ингибирующие концентрации пенициллина G варьировали от 0,25 мкг/мл до 32 мкг/мл. Единственный изолят V. denticariosi показал устойчивость к пенициллину.

Таким образом, мы обнаружили, что изоляты Veillonella spp. обладают очень высокой устойчивостью к пенициллину, который мы не можем использовать в клинической практике для лечения инфекционных осложнений. Показатель в клинике колеблется от 85 до 100 %, в зависимости от вида. Среди изолятов Veillonella spp. также прослеживается устойчивость к амоксициллин/клавуланату. Так, для изолятов V. parvula и V. dispar диапазон MIC составлял 0,12 мкг/мл – 32 мкг/мл, а для изо-

Таблица 3

Распределение изолятов анаэробных грамотрицательных кокков на основе полученных оценок совпадения Scores (n=70)

Анаэробные Грам(-) кокки /	Количество штаммов с оценкой спектра MALDI
количество штаммов/	2.300–2.500	2.000–2.299	1.900–1.999

Veillonell aparvula /37/ 4 (23,5 %) 31 (61 %) 2 (66,3 %) Veillonella dispar /16/ 4 (23,5 %) 11 (21,5 %) 1 (33,3 %) Veillonella atypica /16/ 7 (41,2 %) 9 (17,5 %) - Veillonella denticariosi /1/ 1 (5,9 %) - - Acidаminococcus intestine /1/ 1 (5,9 %) - - Всего 17 (24 %) 51 (71,8 %) 3 (4,2 %) лятов V. atypica характерны более узкие показатели минимально ингибирующей концентрации: 1 мкг/мл – 16 мкг/мл. 19 (61,5 %) штаммов V. par-vula, 6 (46,1 %) V. dispar и 9 (60,0 %) V. atypica были чувствительны к амоксициллин/клавуланату.

Неожиданные результаты были получены для бактерий рода Veillonella по отношению к метронидазолу. Чувствительность к метронидазолу V. dispar и V. atypica составляла 46,2 % (6/13) и 60 % (9/15) соответственно. Всего лишь 11,4 % (4/35) штамма V. рarvula были чувствительны к метронидазолу. Для одного изолята V. рarvula значения минимально ингибирующих концентраций были крайне высоки и составили 128 мкг/мл, а для двух штаммов определились на уровне >256мкг/мл. Доля изолятов V. рarvula, V. dispar и V. atypica умеренно устойчивых/устойчивых к метронидазолу составляла 54,3 %, 46,2 % и 26,7 % соответственно.

Все исследуемые штаммы были высокочувствительны к имипенему.

Обсуждение

Риск развития инфекции у онкологических больных несравненно выше относительно других пациентов хирургического профиля. Предрасполагающим фактором выступают иммунодефицитное состояние, большое количество инвазивных диагностических и лечебных вмешательств. Наиболее часто Veillonella spp. выделялись из абсцессов, хирургических ран, при перитонитах, холангитах, эмпиемах и распаде опухоли. Чаще всего выделялись V. рarvula, как правило из полости абсцесса и желчных путей. V. dispar чаще всего выделялись из ран и плевральной жидкости. За исследуемый период выделен один штамм V. dispar из желчи. В то же время штаммы V. atypica чаще выделялись из желчных путей и плевральной жидкости.

Поскольку Veillonella spp. редко выделяется в монокультуре из клинического материала, этому микроорганизму не уделяется достаточного внимания как этиологически важному агенту в возникновении инфекции. В литературе мало данных о частоте высеваемости и местах локализации Veil-lonella spp. Как правило, этот анаэроб выделяется из ротовой полости, бронхоальвеолярных лаважей, легких [16, 21].

В наших исследованиях Veillonella spp . выделяли в основном из желудочно-кишечного тракта и желчных путей. Поскольку грамотрицательные анаэробные кокки могут вызывать ряд серьезных инфекций, их родовая и видовая идентификация необходима.

Некоторые авторы продемонстрировали высокую достоверность определения Veillonella spp . до уровня видов на аппарате MALDI-TOF MS. Veloo et al. определили 10 штаммов V. рarvula с Scorе между 2.822 и 2.416 [19]. Barreau et al. идентифицировали 28 изолятов V. parvula и один штамм V.ratti со счетом выше 1.900 [16]. Эти исследования доказывают, что на сегодняшний момент MALDI-TOF MS является более надежным, точным, быстрым способом для определения родовой и видовой принадлежности не только аэробных, но и анаэробных микроорганизмов.

В нашей лаборатории все штаммы были идентифицированы – 100 % до уровня рода и 95,8 % до вида. Использование MALDI-TOF спектрометра позволяет сэкономить время, что очень важно в работе микробиолога. Онкологические больные подвергаются химиотерапевтическому и радиационному лечению, которое может изменить биохимический профиль патогена. В связи с этим фенотипическая идентификация становится проблематичной.

Из-за отсутствия достаточного количества научных статей, материалов о Veillonella spp. в литературе мало данных об антимикробной чувствительности этого микроорганизма. Стратегия лечения инфекций, вызванных анаэробными бактериями рода Veillonella, давно не пересматривалась. В 70-х годах для лечения Veillonella- ассоциативных инфекций как препарат выбора был предложен пенициллин. В последнее время было обнаружено, что виды Veillonellа продемонстрировали высокий уровень резистентности к пенициллину G (до 85 %), хотя были чувствительны к амоксиллин/ клавуланату [22, 23]. Ready et al. исследовали чувствительность к пенициллину трех основных видов – V. рarvula , V. dispar, V. atypica, – выделен-

Таблица 4

Распределение 64 изолятов Veillonella в соответствии с MIC (мг/мл)

Антибиотики Вид 0,03–0,06 0,12–0,25 Количество изолятов с MIC (мг/мл) 0,5 1 2 4 8 16 32–64 128–256 V. parvula (n=35) 5 9 18 3 - - - - -- Имипенем V. dispar (n=13) 2 7 4 - - - - - -- V. atypica (n=15) - 14 - 1 - - - - -- V. denticariosi (n=1) - 1 - - - - - - -- V. parvula (n=35) - 1 4 3 1 2 2 1 21         - Пенициллин V. dispar (n=13) - - 2 1 - 3 1 1 5- V. atypica (n=15) - - - - 5 4 2 - 4- V. denticariosi (n=1) - - - 1 - - - - -- Амоксициллин/ V. parvula (n=35) - 4 3 4 4 5 5 3 7- V. dispar (n=13) - 2 1 1 2 4 2 1- клавуланат V. atypica (n=15) - - - 4 2 3 5 1 -- V. denticariosi (n=1) - - - 1 - - - - -- V. parvula (n=35) - - - - 1 3 12 7 93 Метронида- V. dispar (n=13) - - - - 1 5 1 5 1- зол V. atypica (n=15) - - - - 9 2 3 1- V. denticariosi (n=1) - - 1 - - - - - -- ных с поверхности десны у детей. Самую высокую устойчивость к пенициллину показали штаммы V. dispar (73,4 %) [24]. В нашем исследовании наиболее устойчивыми к пенициллину были V. atypica (100 %), V. рarvula (85,7 %) и V. dispar (84,6 %). Исследования показали, что все пенициллин резистентные изоляты были чувствительны к «защищенным» пенициллинам.

В отличие от результатов некоторых авторов, в нашем исследовании 28,6 % изолятов V. рarvula , 23,1 % штаммов V.dispar и 6,7 % изолятов V. atypica были устойчивы к амоксиллин/клавуланату (МIC 16 мкг/мл – 32 мкг/мл) Тот факт, что все штаммы V. atypica были устойчивы к пенициллину и 6,7 % изолятов были устойчивы амоксиллин/кла-вуланату, подтверждает, что механизм выработки устойчивости к пенициллинам у Veillonellа spp. связан с продукцией β-лактамаз.

В литературе имеются ограниченные данные о чувствительности штаммов Veillonellа spp. к метронидазолу. Наши исследования показали высокий уровень устойчивости Veillonellа spp. к метронидазолу, особенно V. рarvula (88,6 %). Метронидазол считается «золотым стандартом» в лечении анаэробной инфекции, в связи с чем он давно используется во многих клиниках в составе лечебных комбинаций. Однако Veillonellа spp. яв- ляется исключением. Основываясь на критериях EUCAST, показатели устойчивости к метронидазолу (MIC>8 мкг/мл) V. рarvula, V. dispar и V. atypica были следующими: 88,6 % (31/35), 53,8 % (7/13) и 40 % (6/15) соответственно. Мы не нашли публикаций, описывающих механизм выработки устойчивости Veillonellа spp. к метронидазолу. Такой высокий процент и уровень устойчивости штаммов Veillonellа spp. к метронидазолу должен насторожить врачей по поводу излишне частого использования препарата в клинике.