Метаболиты базидиальных грибов, эффективные в терапии рака и их молекулярные мишени: обзор

Начиная с 2010 г. в мире регистрируется более 14 млн новых случаев онкологических .заболеваний в год, и если существующая тенденция ежегодного прироста заболеваемости сохранится, через 20 лет эта цифра увеличится примерно вдвое. Наиболее распространены рак легкого (1.8 млн случаев 、 13% от общего количества зарегистрированных .заболеваний), рнк груди (1.7 млн, 11,9%), рак толстой кишки (1.4 млн, 9.7%), при этом наиболее распросгра ненным и причинами смертности стали метастатическое поражение легких (1.6 млн_? 19.4% от общего количества), печени (0.8 млн_? 9.1%) и брюшной полости (0.7 млн, 8.8%) [Forman et al._? 2014].

Основными методами лечения в онкологии до сих пор являются радикальная хирургия, цитотоксическая химиотерапия и лучевая терапия, при этом достаточно определились эффективность и сфера применения каждого из перечисленных методов в лечении конкретных онкозаболеваний. Основная проблема, однако, заключается в меньшей химио- и радиочувствительности злокачественных новообразований в сравнении с нормальными пролиферирующими тканями, чем обусловлены крайне негативные системные эффекты и последствия традиционных методов лечения. На сегодняшний день известно много жизненно важных («витальных») молекулярных мишеней (ферменты метаболизма ДНК и РНК, белки цитоскелета н теплового шока, дыхательной цепи митоховдрий), но они не* специфичны для рака [Blagosklonny, 2005].

В последние десятилетия осознание этого фундаментального противоречия привело к выработке « принципа ком плементарной онкотерапии» [Klaschka, 1996], подразумевающего взаимно усиливающее терапевтическое действие традиционных методов и методов иммунотерапии, проявляющих базисные онкостатические эффекты, демпфирующих побочные эффекты химио- и радиотерапии (лимф ( кл^гпрессия_? миелосупрессия, интоксикация) и осуществляющих про 巾 илактнку рецидивов опухоли и сопз^твутощих инфекционных осложнений. Важной составляющей неспецифической и комбинированной иммунотерапии является использование биоактивных комплексов, синтезируемых рядом растительных и грибных организмов для активизации различных звеньев иммунной системы.

Целью настоящего обзора является оценка терапевтического потенциала метаболитов базиди-апьных грибов (Fungi, Basidiomycota), представление их молекулярных мишеней в нсопластичсски трансформированной клетке и рассмотрение основных онкостатичсских и иммуномодулир^тощих эффектов биоактивных комплексов, проецируемых базидиальными грибами.

Злокачественная ткань, ее ун и версал ьн ые свойства и молекулярные маркеры

Концепция злокачественных новообразований. В англоязычной традиции злокачественные новообразования именуются кратким термином cancer (рак), в то время как в отечественной традиции раком именуется наиболее распростри ненный класс злоі^ічественных образований, происходящих из эпителиальной ткани. То обстоятельство, что англоязычные публнкацнм определяют архитектору переднего края онкологии термины «рак» и «раковые клетки» используются в onpejeneHHOftf контексте при обсуждении не только карцином, но также гемобластозов, сарком и глиом в отечественной литературе* В некоторых контекстах б качестве синонима термина «злокачественные новообразования», помимо рака в широком смысле, используются также термины «неоплазии» и «неоплазмы». хотя, строго говорЯк они означают лю бое. а не только злокачественное новообралование*

В свете современных знаний о злокачественных новообразованиях рассмотрение их в качестве гнез 口 пролиферирующих клеток, не буд 户 к лишенным практического смысла, представляется недостаточным. Речь идет о комплексной ткани, отличительными признаками системообразующих элементов которой - раковых клеток - являются: 1) развитая способность к автономной генерации пролиферативных сигналов, 2) нечувствительность к экзогенным регуляторам и ингибиторам роста, 3) повышенная устойчивость к программируемой клеточной гибели - апоптозу. 4) преодоление пролиферирующими клонами лимита Хейфлика (репликативное бессмертие), 5) способность к стнму-.тяции ангиогенеза, 6) повышенная способность к диссеминации - тканевой дезинтеграции, образованию циркулирующих раковых клеток, микроэмболов, микрометастазов [Hanalian, Weinberg. 2000]. 7) перепрограммированным метаболизмом, 8) повышенной способностью уклонения от ИМ МУННОГО надзора* Эти особенности проявляются на фоне генетической нестабильности и адаптогенно-сти клонов, а таюке воспалительной реакции, усиливающей их злокачественные особенности [Hanahan, Weinberg, 2011].

Пролиферативная автоноуіизацпя и имуіор-талшация. Регуляция клеточного цикла в своей основе определяется взаимодействием регуглятор-ных слбъединиц - циклинов и каталитических субъединиц - циклинзависимых киназ (Cdk). интегрирующих митогенные и ингибирующие рост сигналы. В нормальной клетке Cdk находятся в комплексе с малыми ингибигорными молекулами -белками Семенегв INK4 (р15、р16, р18. р19) и С【Р/К【Р (p2L р27? р57); хз белки (а таюкс кодирующие их гены) получили название опухолевых супрессоров. 1к>мнз0 малых рінгиоріторньтх молекул регуляция акгивносги гирозинкина:^ определяется реглляп>рной активностью двух вах<ных п卩о-iVUHOB - Rb и Р53. I Іервый, находясь в норме в ги-пофосф op pi л ированном состоянии, связывает тран-скрипцрюнный 巾акт口卩 上2匕 препятствуя образованию им транскрипционно-атсгивньтх комплексов с эффекторами пролиферации - белками семейства Мус. Второй блокирует сразу несколько звеньев пролиферации, угнетая Cdk посредством активации p2L связываясь со многими факторами репликации, репарации и транскрипции, репрессируя ряд онкогенов (например. bcl-2; tbs; VEGF), стимулируя репарацию с параллельным ингибировп-нием репликации ДНК [Fukasawa et nL, 1997; Amundson et al., 1998: Sherr, McCormi* 2002; Deshpande et a].: 2005].

В норме все перечисленные молекулы действуют совместно в іквет на сигналы продолжения или осгановки КЛСГО4Н0Ш цикла. Мигогсн-акгиви- 口口阅 иные іірогеинкшіаізы запускаюг каскад собы-гий. и ісі ом когорого являсгся вхождение клегки в ми юз. Сгабильносгь зке пос гм и шги ческой фазы G0/G1 g возможностью на этом этапе клеточной ди ( | )( | ) срс н ци ров к и и специализации, включая необратимое «зистьтванис» в фазе G1, определяется слаженной работой пула ин гиб и горных молекул. Мутационные реаранжировки, амплификация pi л и гипсрэкспрсссия циклді новых генов, поломка гс-н or- рег\ляторов Rb и р53 ведут к разрушению сбалансированной системы контроля клеточного цикла. Фосфор ил ирован ие белка Rb пиклрінзави-симыми киназа.ми позволяет клетке безостановочно проходить ключевую точку GI — S. В результате дерепрессии транскрипционного фактора Е2Ғ теряется зависимость размножения клетки от негативной реглляии и пролиферации посредством экзогенных ростовых факторов и других системных сигнальных молекул |Testy; 1996. Копнин. 2000, 2002; Князькин. Цыган. 2007] и происходит интенсивная выработка клеткой собственник ростовых факторов (PDGF, FGF), рецепторов к экзогенным факторам роста (EGF-R, Ret. Rns) ： транскрипционных факгоров (Мус. Jun) [Hunter, 1997]. Так pea-лизукугся ива базовых свойсгва злокачссгвснных клеток - высокая с гснснь ав гоном нос ги в генерации пролиферагивных сигналов и нечувегви ІЧ^ІЬ-нпсть к ^к югенным pci уля горам рост

Кроме того, аітівизаңия путей бесконтрольной пролиферации и вовлеченных в то і веі с ] вующи с сигнальные каскадь ( белков семейства Мус 、 обладаю іцих тел ом с 卩 а зной активностью, позволяст клетке осуществлять элонгацию концевых участков хромосом, что разрунтаст «счстн ( . ) -ограннчи-тельный» механизм клеточных делений и ведет к потенпиальной иммортал 网 за ңирі клана [Greider.

1998; Kiyono et al.? 1998; Волкова. Немова. 2006]

Уклонение от нпоптоза. Апоптоз — одна різ разновидностей программируемой гибели клеток, реализуемая с участи ем каеппз и эндонуклеаз, которые, будучи активированными на me югообразных сигнальных путях, осуществляют последовательную разборку цитозольных белков, фрагментацию ДНК с сохранением целостности клеточной мембраны Претерпевшая апоптоз клетка распадается на многочисленные окруженные мембраной апопгозные ] ельца, у гили дуемые макрофаіями. Это - механизм отбраковки мпогоклеточЕіым ор- ІЯІ1ИЗМ0М МОДуЛСЙ, НОЛучаЮЩИХ ІфОГЯЖСіІІІЫС или міюжесгвепные повреждения Д] ІК. Процесс аноп-тиаа можег бы гь запушен как экзогенными, іяк и эндогенными сигналами, причем болыиинсгво его “¥】 с 百 прямо или косвенно рсіулируюгся главным клсгонным он косу 11 рессором - геном р53 (рис. 1).

Рис. 1* Основные звенья и си гневные п\т 网 апоптоза. Ингибирование TNF-нндуциро-ванного пути апоптоза транскрип црю нным фактором NF-кВ [по: Змитрвич, 2014]

Fas-зависимый путь апоптоза индуцируется контактом ряда лигандов (] as-ли ( анд_? I Nl -a. П.), предъявляемых иммуноңитами (Т-лимфоциты, ак-тнвнрова.нныс сстсствснньтс кріллерьт) под лежащим и перепрограммированию на гибель клеткам, имеющим на своей поверхности «домен смерти» (рецепторы Fns. TNF I и 2, DR. DCR) |Nagata, Gol stein. 1995], Взаимодействие Fas-л и ганда с Fas-рецептором приводит к кон форм анион н ы м изменениям последнего, ведущим к активации прокас-пазы-8 и последующим процессингом каспаз-3, 6-и -7 [Lacour et М , 2003]. Bcl-2-зависимый (мнто-хондриалыіый) путь апоптоза связан с экзогенными и элдогеиными нарушениями целосгносги мембраны митохондрий, набуханием митохондриального ма гр икса и выходом гв нет в цигопла^му клегки ряда іі^апоіггсггических агетов - ци го-хрпма С, прокаспа:^ -2 ： -3. -9 н флавопрогсинов АРЛҒ-1 и А1Г . Первый учасгвуег в акгивации кас-па:іы-9. когорая, н свою очередь, ірансакгивирусг каспазы -3, -6 н -7. а в горой индуцируе] процесс кондснсапии хроматина и фрагментацию я дерн ой

ДНК [Susin el aL 1999]. Ключевая роль в активации митохондриального пути апоптоза принадлежит находящимся под непосредственным контролем транскрипционного фактора р53 митохондриальным трансмембранным комплексам Вс12 Вс1-xL, Noxa и PUMA, а также цитоплазматическом^7 белку Вах, изменение активности которых приводит к открытию каналов и образованию пор, нерва которые в цитоплазму выбрасывается ряд про-апоптотических агентов tAshkenazi, Herbst. 2()()Х: Черешнев и др.: 2011].

Другие тактики пролиферирующих клонов, позволяющие им уклоняться от апоптоза, проявляются в отборе клеток с поврежденными генами Вах, Bad, Apaf-L цитохром С-зависимых каспаз и, соответственно, заблокированным м итокондриально-опосредованным апоптотическим путем [Wolf el al._? 2 001 ； Heiser et al.. 2004]. клеток с гиперэкс-прсссисй Bcl-2_t MDM2 - проектов, ингибирующих проапоігготичсскис факторы Вах и р53 [Rccdn 1999], клеток с подавленной экспрессией рецепторов «домена смерти», что позволяет им избегать Fas-опосредованный апоптоз [Friesen et aL 1999]“ то есть выходить из-под иммунного надзора.

Стимуляция ангиогенеза. Несмотря на относительно низкий катаболический потенциал, злокачественная ткань нугждается в притоке кислорода и пластических ресурсов и оттоке углекислоты и экскретируемых веществ. В условиях ГИПОКСИИ в злокачественной ткани фиксируется повышение ровней экспрессии фактора роста эндотелия VEGF [Ferrara. 2009] и фибробластов FGF [Baerisnyl, Christofbri. 2009] - основных индукторов ангиогенного сигнала* Эндотелиальные клетки сосудов микроокружения опухолевого узла, получая ангиогенный сигнал через рецепторные тиро-Зинкиназы 3-х типов (VEGFR-1-3). приступают к пролиферации. Гистологические картины неова-сқуляризашіи атипичны за счет большей разветвленности капиллярной сети и ее меньшей связности в совокупности с мозаичностью - наличием в стенках сосудов, помимо клеток эндотелия, трансформированных эпителиальных (раковых) клеток [На па nan, Folkiiian, 1996], В последнее время внимание исследователей привлекли перициты - мезенхимальные клетки, ассоциированные со стенками сосудов, главной функцией которых яв.іяется пролиферативная аутокринная деятельность, в частности, активная продукция VEGF [Gaengel 口 aL， 2009].

Опухачевая прогрессия. Концепция трех основных вех озлокзчесгвления опухоли - инициации, промоции и прогрессии [Boutwell, 1974; Foulds, 1976; Турусов, 1992] - не устарела и в эру молекулярной онкологии, хотя общепризнано, что границы стадии промоции достаточно вариабельны и вхождение клона в стадию прогрессии определяется масштабом геномных перт>^грбаций. а также качеством иммунного надзора. Данные, накопленные за последнее десятилетие, свидетельст- bjtot о том, что безусловными антагонистами рака среди имап нных клеток нвяяютсн лишь субпопу-.тяции макрофагов, цитотоксических Т-лимфоцтов (ЦТЛ) и естественных киллерных клеток (ЕКК)* в то время как функции других клеточных участников иммунного ответа (нейтрофилы, тучные клетки И даже отдельные С}^гбпОП}^гЛЯЦИИ Т- EI В-лимфоцитов) многообразны и в целом вписываются в сценарий опухолевой прогресснн* В ходе развития воспалительной реакции эти клетки распространяют такие сигнальные молекулы, как эпите-лиальный_? эндотелиальный и фибробластный факторы роста (EGF, VEGF_? FGF). хемокины и про-воспалительные цитокины, а также протеолитические ферменты, способствующие понижению плотности тканевого матрикса и опухолевой инвазии [Coffelt et al., 2010; Mantovani, 2010; Qian 、 Pollard, 2010].

Выход злокачсствснно-тра нсформ ирова иных клонов из-под контроля противоопухолевого крыла имшъной системы в период опухолевой прогрессии связан с истощением Т-депо, экранированием огп'холевых антигенов молекулами имш'ноглобу-лннов, отбором опухолевых клеток, экспресси-ртащих Fas-лигзнд. инициирующий апопточ ЦТЛ иЕКК. '

Диссеминация. Характер роста солидной опухоли определяется сигналами, поступающими из микроокружения. Ряд опосредоваиных интегрина-ми и Е-кадгерином сигналов может активировать транскрипционные факторы Snail. Twist, Zcbl/2_? запускающие в клетках карцином программу «эпителиально-мезенхимального перехода». «Эпителиально-мезенхимальный переход» характеризуется изменением адгезионных свойств клеток поверхностных слоев опухоли ， их инвазией в прилежащие ткани или преобразованием в популяции клеток локомоторного (амебоидного) фенотипа [Пожарисский. Савостьянов. 1976; Friedt Wolf 2010; Madsen* Sahai, 2010], Ключевая роль в ме-^енхимоидной и амебоидной трансформации эпителиальных клеток принадлежит уже упоминавшимся в связи с генерацией теломеразной активности белкам семейства Мус [Partanen et aL_? 2009]. В клетке белки семейства Мус, именуемые также белками раннего ответа* «представляют интересы» цитоскелета и ассоциированной с ним архаичной системы, обеспечивающей «инстинкт выживания» клетки вне связи с регуляторными и проапаптоти-ческими сигналами клеточного консорциума [Змитрович, 2014].

Диссеминация (метастазирование) опухоли -многофазный процесс, включающий как механическое распространение клеток и их агрегатов из первичного очага в отдаленные ткани, так и их последующую адаптацию к микроокружению, причем эта адаптация может включать десятки программ [Talmage, Fidler, 2010]. Единицами миграции Мут быть инвазионные клетки, но часто имеет место распространение микроэмболов. вк„тю-чающи^ инвазионные, клоногенные и детерминированные раковые клетки, а также «дружественную» им строму - оп ) холь-ассоциированные фибробласты. эндотелиальные клетки и клетки про-воспалнгельного крыла именной системы [Hanahan* Wcunbcrg. 2011]₊ Адаптация таких агрегатов к новому тканевом^⁷ оіфужению оказывается более успешной. В некоторых случаях первичный очаг может распространять системные факторы” угнетающие рост микрометастазов путем перевода их в «спящее» состояние. Активизация таких очагов может происходить б ситуации снятия ингибирующего влияния первичного очага [Demicheli et ]2008].

Столовые раковые кііеікн. Представления о стволовых раковых клетках еще не устоялись [Kreso, Dick* 2014]+ Изначально они были сформулированы применительно к миелоидной лейкемии [Bonnet. D 把к* 1997] и в дальнейшем распространены на і<арциномы. Стволовыми (по аналоши со стволовыми клетками нормальных тканей) были названы постоянно делящиеся раковые клетки - в противоположность их дериватам, имеющим детерм инирова нный рост и претерпевающим определенную дифференцировку. При иммунной или лекарственной атаке на опухоль дифференцированные клетки, составляющие ее основную пассу* погибают (регрессия оп)лхоли), а клетки с гиперактивными митогенными путями (что в большинстве случаев означает ингибирование п^тей апоптоза) естественно остаются, составляя так называемою пролиферирующую субтюпуляцшо (или «фракцию роста») опухоли, на основе которой опухоль может восстановиться. С другой стороны, опухолевые клетки, выходящие ПО тем или ИНЫМ Причинам на стабилизацию в фале G0 («заторможенна я с>бпо-пуляшш次 также способны возобновлять свой рост. Для обоих случаев более подходящим будет термин «опухоль-инициирутощие клетки» (tumor-initiating cells), нежели «стволовые раковые клетки» (stem cancer cells). По сути, ^стволовые раковые клетки» - зто наиболее агрессивные и адаптивные клоны, выживающие после стаңцартного именного и лекарственного воздействия. Вместе с тем, с точки зрения онкотерапии, такое «умножение сущностей» все же полезно, поскольку7 выводит на первый план необходимость особого подхода к резистентным клонам. Недавние исследования показали, что одним из механизмов усиления ре-зистхнтности раковых клеток к лекарственной терапии является отбор на аутофагозную активность -вакуолизацию периферической зоны цитоплазмы с упаковкой И пос吟дюпшм ЛИЗИСОМ лекарственных субстанций [White, DiPaola* 2009] + Уничтожение резистентных клонов возможно только с использованием комбинации «витальных» И «вспомогательных» токсических веществ (б частности, ЛИЗОСОМАЛЬНАЯ активность клетки снижается ингибиторами аутофагии - 3 -мети л аденином. бафило-мицином AI).

Имея б виду все упомянутые аспекты озлокаче-сгвления, таргетная молекулярная терапия рака, очевидно, в своей основе должна сводиться к блокировке и ингиброванию активностей его молекулярных мишеней - циклин-зависимых киназ, рецепторов ростовых факторов и ангиогенеза, про-воспалительных факторов, блокаторов апоптоза, по возможности - витальных мишеней, а также к стимулированию опосредсваиного ЕКК апоптоза трансформироваиных клеток.

История изучения лекарственных свойств бязидиальных грибов

Использование человеком базидиомицетов в лекарственных целях восходит к доисторическим временам [Pcintncr ct al._? 1998], С древности до наших дней сохраняются традиции терапевтіріе-ского использования грибов в странах Восточной Азии. Такие грибы, как Gano^erma lucidum (Рей-ши), Lentimda edodes (Шиитаке), 加口并 о 『"帛 obUquus (Чага), многие сотни лет используются народами Кореи, Китая, Японии и Сибири. В лечебнике «Бэньцао ганм>» («Компенди ) ^гм лекарственных веществ»)* написанном китайским ^еным Ли

Шичжэнем в 1578 г₊, упоминаются такие лекарственные базидиомицетЫк как Ganodenna /н 匚〃力〃乩 Poly рог us unibellatas^ ТенеМа faciformis [Wasser_h Weis. 1999]. На Западе интерес исследователей к лекарственным свойствам базидиальных грибов наметился после этноботанического труда Уоссонов «Грибы. Россия и история» [Wasson, WasgiL 1957] и вышедшей в том же году статьи Лукаса с соавторами, посвященной инпібированию роста опухолей экстрактами boletus e 』 W 污 и некоторых других видов [Lucas et aL, 1957]. Первый крупный обзор по онкоспітическийі свойстеам экстрактов базидиальных грибов принадлежит Грегори и соавторам [Gregory et al. _ч 1966].

В 1969 г. коллективом авторов, возглавляемым Коматсу [Komatsu ct al._? 1969], был выделен и испытан глюкановый биоактивный комплекс, названный шизофилланом. обладающий выраженным иммуномодулирующим эффектом. В том же году Икекавой с сотрудниками открывается цикл исследований противоогв^холевых эффектов базидиальных грибов, огюсредуемн 工 имш нной системой [Ikekawa et aL ： 196 9, 19 8 2, 1992^ к которым впоследствии присоединяется коллектив, возглавляемый Мнзуно [Mizuno. 1996; Mizuno el aL 1986“ 1992, 1996, 1998* 1999]_t В 1970 r_t из экстрактов Lentinula (Lentinns) erodes был вьщелен биоактивный комплекс, названный лентинаном [Chichara ct al._? 1970]. основу которого также составляла определенная фракция р-глюканов. Наконец, в 1984 г. было всесторонне изучено действие выделенного из Tranietes (СorioIns) versicolor полисахарид-белкового комплекса, названного крестином [Tsukagoshi et al.. I9S4].

Особое место в истории исследования противораковых базңдиильных грибов занимает чига (InomHus obhquus f. д7еп7м). Гриб активно использовался народами Сибири как полифункциональ-ное лекарственное сырье. Фарма кологическое изучение его было начато в 1864 г. Г. Драгендорфом в Юрьевском университете. После химических и клинических испытаний, проведенных профессорами П.А. Якимовым и П К. Булатовым [Булатов к др., 1959] лекарственное сырье чаги было признано фармакологическим комитетом Минздрава СССР в качестве паллиативного средства при распространенном опукилевом процессе. Прием экстрактов чаги достоверно улучшал показатели кроен, угнетал рост метастазов и улучшал общее са-моч^Бсгвие пациентов. В дальнейшем было показано, что основу биоактивных комплексов, поставляемых этим грибом* составляют полифснолы и тритерпеноид инотодиол. Таюке б сырье чаги были выявлены бетулин, траметеновая кислота* лано-становые производные, простые и сложные сахара” ароматические и жирные кислоты, адіинокислоты. полипептиды [Бал<1ндайкин_? 2(“3] 一 В последнее время изучение биомедицинских аспектов применения чаги вновь активизируется [Белова. 2014: Шнырева 、 Ван Гринсвен, 2014; Zhao et al., 2014:

BalandavkiiL Zmilrovich* 2015; Glamoclija el aL 2015].

Подмечаемые б 1970-е гг₊ японскими исследователями данные по им м}^тноопосрсдованном>^г онко-статичсском} действию шизофиллана* лентинана и других глюкановых комплексов, продуцируемых базидиальными грибами* не вызвали интереса у онкологов-клиницистов, имеющих дело в основном с опухолями на стадии прогрессии, когда им-муноопосредованная цитотоксичность уже недостаточна.

Однако исследования лекарственных грибов и их метаболитов были продолжены, и к концу 1990-X гг. накопление информации в этой области потребовало обобщения и систематизации [Денисова, 1998; Булах, 2001; Stamcts, 2005; Юй и 口 р., 2 00 9: Переведенцева, 2011; Феофилова и др._? 2013; ©н-липпова, 2013],

Начиная с 1980-х гг. формируется вторая волна клинических испытаний биоактивных субстанций грибов, в которых они использлтотся уже с учетом продшеств™щего опыта - в сочетании с химиопрепаратами и радиотерапией. Таковы испытания сочетанного действия лентинана, шизофиллана и крестина, показавшие достоверное увеличение медианы выживаемости пациентов с карциномами ЖКТ. улучшение их иммунологических показателей и качества жизни [Taguchi el aL 1982 ： Fujimoto et at. 1991 ； Mitomi et al.. 1992 ； Gordon et aL 1995: Kodama ct al._? 2002]. Были проведены таюкс клинические испытания цитотоксических компонентов биоактивных комплексов базидиальных грибов (в частности. Ganodema lucidum) на неоперабельных стадиях с достоверным улучшением гематологических, им мунологических показателей и качества жизни [Gao et al., 2(Ю2. 2(М)3],

Достаточно активно иғ?учзется действие грибных метаболитов на раковые клетки методами молекулярной онкологии. Действию грибных йіета- оолитов на основные мишени раковой клетки посвящен следующий раздел настоящего обзора.

Грибные метаболиты н механизм их воздействия на злокачественно-грянсформированные клегки

Индукция апоптоза, опосредованного естественными киллерными клетками. Цитотоксическая активность иммуноцитов против широкого спектра опухолевых клеток-мишеней, предсушествую та я направленной иммунизации грызунов, была выявлена сравнительно ледавло и названа естестве]той киллерной активлостыо; обладающие такой акгивностью клегки были названы есгесг-венными киллерными клегками [Herbernian, 1981 ]. ЕКК - филогенетически древняя разновидность Т-клсток, хотя и ряд других субполуляций Т-лимфоцитов обладает подобным действием. Распознавание цитотоксически м и лимфоцриами злокачественных клеток происходит в связи си значительным снижением экспрессии последними антигенов главного комплекса гистосовмест имости ] типа (МНСI). В ходе контакта с раковымы клетками клетки-киллеры индуцируют либо Fas(OHO)-зависимый апоптоз, либо неспецифический лизис клетки путем контаминации их цитол ити чески м и гранулами, содержащими перфорин и гранзим В [Kagi et aL, 1996; Froelich et aL, 1996].

Это основной тип противораковой активности, генерируемой веществамн грибного происхождения —р-D-глюканам и или глюкан-протеиновыми комплексами* Биологическая активность этих веществ зависит от растворимости в воде [Ishibashi et al.. 2001], молекулярного веса [Mueller et al., 20001, степени разветвленности и присутствия р-

(1^6)-связей по ходу основной р-( 1^3) цепи [Cleary et al., 1999].

Полисахариды клеточной стенки грибов ложно распознаются клетками врожденного иммунитета в качестве инвазивного клона микроорганизмов, поскольку у этой группы иммуноцитов сформирован целый класс рецепторов, настроенных на распознание молекулярных фрагментов самых разных клеточных стенок [Недоспасов, 2013]. Глюканы, маннаньц хитозан* являющиеся основными гидрофильными компонентами клеточных стенок грибов, выступают для иммунных клеток как один из «патоген-ассоин ированньтх молекулярных обра-зов», будучи ком пл ем е нта р н ы м и ряду их рецепторов (Toll— dectin-l рецепторы) [Brown, GordorK 2001J. Иммунная система распознает эти фрагменты и значительно активизируется.

Механизм этой активизации сегодня в общих чертах уже ясен. Поступающие в желудочно-кишечный тракт грибные полисахариды, не подвергаясь ферменга гивному разрушению, захвагы-ваюіся клегками слизисгой оболочки кишечника н переносятся нм и в подслизистый слой, где происходит их взаимодействие с рецепторами макрофагов и дендритных клеток, поглощающих, частично расщепляющих эти вещества и связывающих их фрагменты с молекулами МНС1. В селезенке и лимфатических узлах эти а нт и ген - репрезентирунощи е клетки стимулируют гранулоциты и клетки-киллеры, ответственные за местный иммунитет. На приводимой на рис. 2 схеме можно видеть набор рецепторов и м м ун о ком пете н тн ы х клеток, задействуемых теми или иными компонентами клеточной стенки грибов [Lee, Kim, 2013: Змитрович, 20141 ，

CL-маннан -Ы-Сйя^аічі-іий ^[Л][|1И11 -О-снлзанһьіи маннан -

MaiiiiJHiiL -

Маігнлзл -

В-маиііозильі ・

Dectin-2

[j-глюкапы — ^^paL'Meu'nipiusaiiiJhje р -        Н hl р-г;іюканғя —

[^-ГЛІПкіНТЫ —

Xid гш]<^ВҺ]й 匸丿】с它

Плазм ал ем ма

MR	NF-kB 丄
TLR4	MyDBS. NF・k
DC-SIGN
5IGNR1
Gaiectin 3	NF-kB 亠
г    Deetjn-J	Svk
、      CR3	Syk. PIM К
、 TLR2, TLRfi	MyD8B
、      LacCer	PI3K
	Рітк

TNF-a

IL-1, TNF-«

IL-8. TNF-otJFNb

IL-10

TNF-ci

IU TNF-p

忆 12 包 1 也 "A.23, ROS, TNF-a

GM-CSF

IL 10, TGF 屮

М;ікрофаі н> іріну 〃 “цніи>

J^elJ/^pL1■J■■lJҺJe KJitJ'KM, Г-ки/ыеры

Рис, 2. Полисахариды клеточной стенки, ком пл иментарные нм рецепторы иммунных клеток — медиаторов врожденного иммунитета, набор продуцируемых иммунными клетками цитокинов [по: Змитрович, 2014]

Часть глюканов с током крови попадает в пе- чень, где захватывается купферовыми клетками.

выделяющими в ответ на это взаимодействие тот же набор цитокинов и активирующих системный иммунитет. По современным представлениям _г роль развития имшъной реакщіи в условиях опу-холевой прогрессии противоречива: помимо нн-терферона и ФНО. имеющие выраженное онкоста-тическое действие, в тканевой жидкости фиксируется увеличение концентрации VEGF и EGF ， проецируемых гран>⁷лоцитами и В-лимфоцитам и; все клеточные участники реакции (включая злокачественные клетки) повышают уровень активности NF-кВ, Тем не менее, в ситуации неистощенных депо ЕКК такого рода провоцирование иммунной реакции себя оправдывает, поскольку стимулирует массовый ЕККчэпосредованный Fas-апоптоз либо перфорин-зависим ый цитолиз.

И нгибиров ание митоген ной активности. Прямое действие грибных метаболитов нн экспериментальные наборы злокачественно-трансфор-мированных клеток показнло, что ингибирование ими митогенной активности может быть связано с несколькими принципиально важными направлениями: 1) ингибированием протеинкиниз - основного генератора пролиферативных сигналов, 2) арестом клеточного цикла, 3) нарушением МАРК-сигнального каскада.

Изучено действие грибных метаболитов бензохиноновой природы кла вил актонов А, В и D, продуцируемых СШосуЬе clavipes на раковые клетки и показана их выраженная ингибирующая активность тирозинкиназ Ret/plcl, v-AbL gc・ рин/трионин-киназы и главное, рецептора эпидермального фактора роста EGF, запускающего внутриклеточный пролиферативный каскад [Cassinelli et al., 20001 ，

Арест клеточного цикла грибными метаболитами наиболее изучен на примере тритерпеноидов, продуцируемых грибом Ganockrma lucldum. воздействие которых приводит к остановке клеточного цикла на фазе Gl/S [Zhu et al., 2000: Hu et al., 200 2; Yang, 2 005] или G2ZM [Jiang et al., 2004; Muller et al.、2006]. К настоящему времени известно 316 различных тритерпеноидов, продуцируемых грибами рода Ganodema - ганодеровых кислот, люцидумолов, люцидодиолов [Xia et hL, 2014], Их действие нн прохождение сверочных точек клеточного цикла опосредуется ингибированием циклинов Cdc2, В и DL протеинкиназы С, а также стимулированием экспрессии ингибитора циклинзависимых киназ гена р21 [Автономова, Краснопольская, 2013]. Арест клеточного цикла может вызывать также гликозид генистеин. продуцируемый, в частности,尸/削修卅〃〃理白 velalipes [Kang et al.? 2003]. В клетках гепатоцеллюлярной карциномы генистеин регулирует активность Cdc2-киназы и ингибитора клеточного цикла белка р21, что приводит к аресту клеточного цикла в фазе G2/M [Chang et al., 2004]; подобное действие оказывает полисахарид-пептнд, проецируемый Tratnetes verst со for [Chow et al.. 2003]. В раковых клетках с неповрежденным опухолевым супресс。一 ром р53 эффект ареста клеточного цикла в фазах G1/S и G2/M проявляют эргостерол- и ланостансо-пержащие экстракты Font i topsis pinicoia, действие которых опосредугется содержанием внутрмклетои-него глутатнона, регулирующего активность р 53 [Wang et al t 2014].

Міпоіхн-активируемые протеинкиназы (МАРК) являются своеобразными интеграторами сигналов, поступающих от различных рецепторных И нерецепторных тирозинкиназ, ЦИТОКИНОВЫХ рецепторов и рецепторов трансформ ирующего фактора роста и ключевыми участниками ответа на стрессорные сигналы_һ зависящего от клеточного и внутриклеточного контекста* В МАРК-каскад неминуемо оказываются вовлеченными онкогенные белки (Ras. Raf). и клетка становится значительно менее чу ветвите льной к проапоптотическим сигналам [Hilger el aL 2002]. Активация или ингибирование молекул* вовлеченных в МАРК-сигнальную сеть, может вести как к усилению пр 。- лиферации. так и к пролонгации фазы G2 клеточного цикла. Наибольшие надсады на нарушение пролиферативных сигнальных пут^й связаны с протеином р38 [Wagner* Nebreda. 2009] _t Воздействие тритхрпеноидной фракции мицелия Ganudenna lucidum позитивно коррелировало с остановкой роста (фаза G2) клеток человеческой гепатомы линии Huli-7 и экспрессией р38 (Lin el aL 2003]. Показано также, что модулирующее гиперактивацию митогенных сигнальных путей действие р38 может усиливаться биоактивными комплексами, поставляемыми Inunotus luileus [Cho el aL, 2002]_t Панэ-пофенантрин (продуцент - Рткз lecumlei) препятствует эпигенетическому выключению митогенноактивированной клеткой опухолевого супрессора р27 и связанному с ним уклонению клетки от апоптоза [Sekizawa el al.. 2002].

Блокирование неоангиогенеза. Говоря о прогрессии опухоли и роли грибных метаболитов в борьбе с ней, нельзя обойти вниманием и вопрос опухолевого ангиогенеза. Хорошо известна максима «пресечь ангиогенез - победить опухоль». Грибные биоактивные комплексы были также изучены на предмет антиангиогенной активности. Наибольшую активность проявляли Ganoderma『笈一 с I clu hi, Taiwanofhngus camphorates. Agaric us mur-r〃厶；и в особенности Amyhporia xantha и Rigido poms ubnanus. Полагается, что фукозные и маннозные фрагменты продуцируемых этими грибами полисахаридных комплексов связываются с регуляторными участками фактора VEGF и блокируют действие этого фактора, запускающего генетическою программу ангиогенеза [Chen et al” 2005]. Следует помнить, однако, что обратной стороной блокирования ангиогенеза является активизация поп^'ляции клеток локомоторного фенотипа, массово отрывающиеся от «голодающей опухоли»-

Ингибирование провоспалительных факторов и бмокаторов апоптоза. Основоположник клеточной патологии Рудольф Вирхов определял рак как хронически незаживающую рану. Изложенные выше данные о вовлеченности в воспаление «провоспалительного крыла» иммунной системы и секреция комплексной раковой тканью мзтриксных мета л лопротеинз з позволяют наполнить такое определение новым содержиниеді.

Как упоминалось выше, основным провоспали-тельным фактором, конституционально связанным с опухолевой прогрессией, является хемокин NF-кВ. блокирующий JNK- и р53-опосредованные пути апоптоіа. Блигодиря исследованиям группы Эр-келя из грибов Lent In us crini tus и некоторых видов роди Panus {Panus conchaius, Р. 『曰匸口订打^丁) был выделен терпеноид гганэпоксидон, препятствующий деградации ингибирующей частицы № ・ кВ □ IkBcu б результате чего этот тра нскрипционный фактор остается связанным и не реагирующим на внешние стимулы [Erkel et al., 1996], Позднее из штамма аскомицетз Ху lari а 45*93 был выделен циклоэпоксидон [Gelirt el al., 1998]. а из Ранах conchatus - нзопанэпоксидон [Shotwell el al., 2000] -вещества аналогичного действия. Помимо пн нт* поксидона и сходных веществ, деградации ингибирующей частицы ІкВа препятствует липополисахарид, выделенный из Taiwano/ungus camphoratus [Liu et hL 2007]. Группой Маттилы было показано, что б плодовых телах Lenlinuh gd必$ содержится фенетил-эфир кофейной кислоты (САРЕ), ингибирующий NF-кВ уже на этапе связывания с ДНК [Manila et al., 2001]. Позднее САРЕ был обнаружен в экстрактах Inonolus Hmeus [Nakamura et al., 2003]

Вторым важным направлением сдерживания онкогенной воспалительной реакции является ингибирование матриксных металлопротеина з. Цинксодержащие эндопептидазы, выделяемые рядом раковых клеток и гранулоцитов, способствуют размягчению фибриллярного и нефибриллярного соединительнотканного матрикса, что значительно облегчает опухолевую инвазию и метастазирование. Вьщеленные из базидиомицетов Piptoporus betMinns и Daedalea dickinsil полипореновая кислота С и (Е )-2 -(4 -гидрокси-3 -метил-2 -б ) тенил)-гидрохинон проявили ингибирующие эффекты в отношении коллагеназы MMP-L стромелизина ММР-3 и желатиназы ММР-9 [Kawagishi et al., 1997, 2002].

Воздействие на витальные молекулярные мишени. Цитотоксичность, проявляемая рядом грибных метаболитов и направленная на вывод из строя базовых жизнеобеспечивающих систем клетки, имеет те же ограничения, что и химиотерапия: большинство ш этих мишеней неспецифичны для рака. Тем не менее, в некоторых случаях в силу гиперэкспрессии опухолевой тканью ряда жизненно-важных ферментов, их ингибирование грибными метаболитами оказывается оправданным. С другой стороны, разрабатываются методы адресной доставки витальных ядов с минимизацией системной токсичности.

Жирнокислотная фракция гексанового экстракта мицелия Grifola frondosa (эргостерол, эргоста-4,6,8(14),22 -теграен-3 -он, 1 -олеоил-1 -линоеоил-3 -пальмитоглицерол) проявляет сильную ингиби-ртощуто активность в отношении циклооксигеназ Coxl и Сох2 [Zhang et al., 2002]. Подобным действием обладают бис-катехолы герронемины ADF, выделенные из мицелия грибов рода Gerronema [Silberborth et 』 L 2002] и ланосгановые тритерпе-ноііды Fomitopsis pUiiccS [Yoshikawa et 』 L 2005], Ланостановые тритерпеноиды, выделенные из склероциев Wolfiporla cocos ингибируют ДНК-топоизомерззы [Mizushina et al., 2004]. Тритерпе-ноидный компонент, выделенный из Perenniporia fraxinea и обозначенный как фомителловая кислота, а также тритерпеноиды 1. 2 и 3 Ganoderma /ucidum проявляли ингибирующую активность в отношении ряда ДНК-полимераз [Mizusliina et al, ， 1999, 2000].

Мишенью циклического пептида а-аманитина (продуцент - Amanita phalloules^ использоваиного в качестве витального яда группой Мельденхау-эра-Фаульсгиха, является РНК-полимераза II. Попадая в клетку、аманитин связывает этот фермент, блокируя его работу; что, в свою очередь, приводит к прекращению синтеза беков и к разрушению клетки. Чтобы избежать системного токсического эффекта, вызываемого этим сильнейшим ядом, его доставка к раковым клеткам осуществлялась в связанном антителами виде. В качестве объекта связывания был выбран опухолевый маркер ЕрСАМ (epithelial cell adhesion molecule)-белок, экспрессируемый многими раковыми линиями. Ама нитин-конъюгированное а нтитело может нести от 4 до 8 молекул токсина, доставляя их адресно к клеткам, экспрессирующим на поверхности ЕрСАМ. Несмотря на возможные погрешности (ЕрСАМ экспрессируется не только раковыми клетками с одной стороны и не экспрессируется «спящими» раковыми клетками -с другой), результаты описанного воздействия впечатляют: 2 инъекции высоких доз аманитин-конъюгированного антитела привели к регрессии опухолей у 90% испытанных животных испытанных животных [Moldenliauer et at. 2012].

Проблемы и перспективы

Вышеизложенные факты позволяют относиться к онкотерапии с привлечениеді метаболитов, продуцируемых грибами - базидиомицетами с исключительным вниманием: биоактивные комплексы_һ поставляемые этими организмами* характеризуются. как правило, множественным и в то же время мягким таргетным воздействием, что. в совокупности с относительной доступностью сырья, открывает определенные клинические перспективы. Однако, несмотря на прогресс в познании меха* низмоб онкостатического действия грибных метаболитов и сложившуюся, по крайней мере, б странах Востока, діноговековую традицию их придюне-ния, впечатляющего прорыва в онкотерапии. связанного с их применением, не происходит.

Причина такого положения связана с тем, что в более чем в половине случаев злокачественные новообразования диагностируются на стадии про-гресснн, когда клетки уже приобретают глухоту к большинству ингибирующих пролиферацию и проапоптотических сигналов, а арест клеточного цикла приводит к реализации злокачественного потенциала по паракринному механизму - клетки приступают к активной пролиферативной сигнализации IRobinson et at, 20t)l ； Blagosklonny, 2003]. Низкая степень связности клеток в раковой ткани и повышенная экспрессия генов семейства Мус чреваты амебоидной трансформацией клеток при любом сильном воздействии на раковую ткань. В такой ситуации все биоактивные комплексы, в том числе грибного происхождения, направленные на ингибирование процессов, происходящих в ілока-чественно-трансформироваиной ткани, не могут покрыть весь спектр вариабельности адаптивного ответа неоплазм. Ингибирование процессов без удара по витальным мишеням раковой клетки чревато ситуацией^ предельно лаконично описанной швейцарским онкологом Пиерпаоли: «Фактически, существуют противостоящие терлпии автоматические механизмы, предполагающие неизбежную промоцию, следуюп^ю за искусственным ингибированием. Чем более сильным было ингибирование. тем более сильной будет промоция» [РіеграоІЁ 2005]. Именно по этой причине на стадии прогрессии и б особенности распространенного опухолевого процесса одних грибных метаболитов - вне сочетания с витальными ядами (хим иотера ПИ я) либо лучевым воздействием - для борьбы с опухолевы-ми клонами недостаточно.

Сочетание грибных метаболитов (прежде всего, тритерпеноидов) с хим иотера певтически\г воздействием на опухоли, доказавшее свою клиническою эффективность^ требует дальнейшего осмысления в свете представлений о клональной гетерогенности оп>?холи с одной стороны и неоднозначной роли именной системы в оп>гхолевой прогрессии - с другой.

Говоря о гетерогенности опухоли и наличии более устойчивых к терапии клонов в связи с онко-статическими эффектами грибных метаболитов в сочетании с химиотерапией, вполне возможно, речь может идти не только о к}м>^?лятивном цитотоксическом эффекте тритерпеноидов в сочетании с более сильными агентами, как бы зажимающими клоногенные клетки в своеобразною «клешню».-такого рода эффект не может быть превалирующим, поскольку он неизбежно осложняется нет-бирательной системной токсичностью. Вероятно, во многом реализуется другой сценарий, описанный группой Благосклонного [Blagosklonny, Darzyiikiewicz, 2 002 ： Blagosklonny el al.. 2002]; 6a лее слабые стимулы (вызываемые е данном случае грибными метаболитами) приводят к аресту клеточного цикла нормальных делящихся и дифференцированных раковых клеток, в то время как 「 н-перактиБные клоногенные раковые клетки продолжают делиться и попадают в уязвимом делящемся состоянии под воздействие более жестких «стимулов»к которые несут химиотерапевтические агенты, результатом чего является в большинстве случаев их апоптоз или цитолиз. Соответственно, новым направлением клинических исследований может стать выявление соотношения цитотоксичности грибных метаболитов и их способности к аресту клеточного цикла как раковых клеток различной степени дифференцировки* так и нормальных пролиферирующих клеток.

Говоря о неоднозначной роли иммунной системы б развитии опухолевого процесса и подавлении противоопухолевого крыла иммунитета провоспа-лительным. следует говорить и о необходимости профилирования грибных биоактивных комплек- соб с выделением как им му ностиму л иру ющей, так и противовоспалительной (NF-кВ -ингибирующей) составляющих. И если основной объект грибной онкотерапии - Ganodenna lucidum - сочетает высокие иммуностимулирующие и противовоспалительные эффекты, то два других «фаворита 1970-х» - 2>н/ 汕廿 fq edodes и Schizuphylhun си/пплте, сырье которых богато разветвеленными р-глюканами. но бедно терпеноидами, даже по сегодняшним далеко не полным данным, явно уступают место таким перспективным объектам как Taiwanofiingus carnphofatus. обладающим также NF-кВ и VEGF-ингибирующей активностью [Liu et aL 2007 ； Sunk et aL 2008] или Piptoporus betuHmts. спектр активностей которого* как оказалось, достаточно широк и включает ингибирование прОБОспалительных факторов (ланостановые производные) и металлопротеиназ (гидрохиноны)

[Kawagishi et al., 2 002; Кдпю et al., 200 3; Wagnun et aL, 2004; Lemieszek el aL, 200 9; Cyranka et 或卄 2011].

К вопросу о профилировании биоактивных комплексов грибного происхождения примыкает вопрос о требованиях к экстрактам и их применению на различных этапах терапии. В исследованиях, проводимых in vitro, наибольшую проапопто-тическ^ю и цитостатическою активность проявляют спиртовые экстракты [Шнырева, Ван Гринсвен, 2014]. в то время как нһ«иуноі^идупирующая активность грибных глюканов лучше сохраняется при более мягком водном способе экстрагирования [Moradali el aL 2007] ₊ Кардинально различаются и т€рапевти ческие ситуации, выдвигающие на первый план либо активизацию противоопухолевого крыла иммунитета, когда основную фармакологическую нагрузку несут грибные полисахариды и пред по чтительным сырьем являются виды* характеризующиеся мощным глюкановым «чехлом» клеточной стенки (Lenlinnlu 它£加£扣虽 Grifola frondosu^ Flummulina velutipe^ Тғет^Ікт mesentenca\ либо снижение митогенной активности и ингибирование провоспалительных факторов. когда основную нагрузку несут уже низкомолекулярные метаболиты (тритхрпеноиды. ланоста-новые производные, эргостерол)* Первая ситуация более характерна для локалиюванного. вторая -для распространенного опухолевого процесса [Змитрович. 2014].

Наконец, специальные исследования требуются для оценки онкопревентивного потенциала базидн-альных грибов - продуцентов полифенольных комплексов, который, по предварительным оцен-кам* чрезвычайно высок [Баландайкин. 2013: Ба-ландайкин, Змитрович. 2015; Balandaykin_h Zmigvich* 2015]₊ Полифенольные композиты представляют значительную емкость для поглощения свободных радикалов, ионов тяжелых металлов и ультрафиолета; полифенол-полисахаридные комплексы обладают значительной иммуномодулирующей активностью, механизм которой выяснен не до конца [Шнырева, Ван Гринсвен, 2014]. В иші направлении наиболее перспективными объектами являются Inonolus obliques f. sierilis^ 1. Iimens, различные биды рода Phellinus_t

Как видим, роль базидиальных грибов в тар-гетной терапии злокачественных новообразований заметна, перспективы просматриваются по не-скольким направлениям, и прогресс в онкотерапии б значительной мере может быть связан с адекватным встраиванием различных фармакологических эффектов метаболитоБ базидиальных грибов б уже отработанные техники иммунотерапии и лекарственной терапии на основе знаний о молекулярных мишенях неоплазм.

Автор благодарен М. Э. Баландайкин>\ М. А. Бондарцевой. Н. В. Беловой, С. И Вассеру, Н+ П. Денисовой, А+ Е+ Коваленко. Л. Г. Переведениевой за обсуждение в разное время ряда поднятых в статье проблем и обмен литературой.

Работа выполнена в рамках гос>гдарственного задания БИН РАН «Микобиота Южного Вьетнама»-01201255603.