Метилирование генов Р53-респонзивных онкосупрессорных микроРНК при гемобластозах

Роль микроРНК в развитии опухолей в последние десятилетия активно изучается, поскольку они участвуют практически во всех клеточных процессах, модулирующих злокачественную трансформацию клеток, а именно: контроле клеточного цикла, ответе на повреждение ДНК, дифференцировке, пролиферации, апоптозе, старении, обмене веществ, эпителиально-мезенхимальном переходе и метастазировании [1]. Получены данные, что микроРНК действуют не только как внутриклеточные мессенджеры, но также могут секретироваться и циркулировать в крови как часть апоптотических тел, микровезикул и экзосом [2].

МикроРНК могут быть отнесены к классу онкосупрессоров или проонкогенов, хотя подобное разделение подходит не для всех молекул [3]. Уровень экспрессии первых в процессе неопластической трансформации клетки может снижаться, уровень вторых – повышаться. Хорошо изучены онкосупрессорные микроРНК кластера miR-34. Примером микроРНК с онкогенным потенциалом являются молекулы кластера miR-17-92. Входящие в него молекулы запускают пролиферацию, ангиогенез, эндотелиально-мезенхимальный переход и метастазирование при широком спектре опухолей [4]. Исследования по профилированию экспрессии генов и биоинформационный анализ показывают, что дерегуляция микроРНК является распространенным событием при новообразованиях. Опухоль имеет свой, отличный от нормальных клеток спектр экспрессии данных молекул.

Известно, что точная регуляция содержания микроРНК в гемопоэтических клетках необходима для нормального кроветворения. Так, существуют белки, участвующие в гемопоэзе, экспрессия которых должна очень четко регулироваться в клетке с помощью микроРНК, а ее нарушение приводит к различным патологическим состояниям, в т. ч. развитию злокачественных новообразований.

МикроРНК имеют важнейшую регуляторную функцию и в работе иммунной системы, начиная от поддержания пула стволовых клеток и заканчивая созреванием и функционированием Т- и В-лимфоцитов. Они не только влияют на направление развития клетки, но также могут играть более тонкую роль в придании клетке устойчивости или чувствительности к важнейшим биологическим процессам – апоптозу, пролиферации, дифференцировке и т.д.

Участие микроРНК в лимфомогенезе подтверждено в моделях на трансгенных мышах. Аберрантная экспрессия микроРНК не только приводит к развитию лимфопролиферативных заболеваний, но и способствует увеличению темпов их опухолевой прогрессии. Впервые значение дерегуляции микроРНК в биологии гемобластозов получило оценку, когда было показано, что в локусе 13q14, который часто подвергается делеции при хроническом лимфолейкозе, расположены гены онкосу-прессорных микроРНК miR-15a и miR-16-1 [5].

Аберрантная экспрессия микроРНК наблюдается и при лимфомах, например при диффузной В-клеточной крупноклеточной лимфоме (ДВККЛ). Показана возможность разделения ДВККЛ на классификационные подгруппы герминального и негерминального происхождения на основе спектра экспрессии микроРНК, отмечены различия в экспрессии микроРНК в клетках лимфомы и нормальной лимфоидной ткани [6].

Ряд микроРНК имеют однонаправленные изменения экспрессии при различных подтипах лимфом, таковым, например, является повышение экспрессии онкогенных miR-155, miR-17-92b и miR-21, а также снижение экспрессии онкосупрес-сорных miR-15а/16, miR-34а, miR-150 и miR-29 [3, 7].

Метилирование генов микроРНК

Изменения уровня микроРНК в клетках могут быть вызваны различными механизмами. Гиперэкспрессия их может быть результатом амплификации кодирующего микроРНК региона генома, промоции транскрипции или потери эпигенетического сайленсига гена микроРНК. Снижение уровня экспрессии, напротив, может быть связано с делецией участка хромосомы, на котором расположен ген микроРНК, наличием мутаций в предшественниках и ключевых последовательностях зрелых молекул, а также гиперметилированием промотора генов микроРНК.

Нарушение гомеостаза метилирования ДНК – центральное звено в эволюции опухолей. Основной чертой генома злокачественной клетки является его глобальное деметилирование, приводящее к генетической нестабильности. С другой стороны, при опухолях происходит аномальное гипермети- лирование ДНК в промоторных регионах генов-онкосупрессоров [8]. Причем такое аберрантное метилирование является ранним событием в эволюции опухолей и способствует дальнейшему прогрессированию заболевания [9].

Многие гены микроРНК находятся в интронах белок-кодирующих генов, и, следовательно, экспрессия микроРНК зависит от уровня транскрипции гена-«хозяина». Однако часть из вну-тригенных, а также межгенно расположенных микроРНК имеют свои собственные промоторы. Поскольку большинство кодирующих микроРНК генов обнаружено в CpG-богатых регионах, было высказано предположение, что метилирование ДНК может иметь важное значение в нарушении их транскрипции [4]. Позднее было показано, что промоторы генов микроРНК подвергаются метилированию в пять-десять раз чаще, чем генов, кодирующих белки, а их аберрантное гиперметилирование – один из наиболее значимых механизмов снижения экспрессии микроРНК при опухолях [9].

В настоящее время выявлено около 200 генов микроРНК, которые регулируются путем метилирования ДНК при множестве типов неоплазий. Было показано, что 45,5 % этих генов аберрантно метилированы, по меньшей мере, при двух типах онкологических заболеваний. Так, например, гиперметилирование генов MIR-34B, MIR-34C и MIR-34A было показано при 24, 21 и 17 видах рака соответственно. Снижение экспрессии он-косупрессорных микроРНК, например miR-203, miR-124-1 и miR-129-2, при злокачественных новообразованиях, в т. ч. системы крови, также происходит путем аберрантного метилирования. Ряд микроРНК считаются специфично метилированными при отдельных типах рака, однако предполагается, что этот феномен отчасти связан с малой изученностью вопроса и может измениться при исследовании метилирования этих генов при расширенном спектре опухолей [10].

Можно предположить, что аберрантное метилирование генов микроРНК при опухолях – потенциально полезный молекулярный биомаркер как в диагностике, так и в предикции, прогнозе опухоли и разработке стратегии таргетной терапии злокачественных новообразований.

МикроРНК как посредники эффектов р53

В физиологических условиях точная и согласованная регуляция р53-индуцируемых микроРНК опосредует его противоопухолевые эффекты. Так, реализация р53-опосредованного ответа на генотоксический клеточный стресс во многом осуществляется за счет изменения спектра экспрессируемых микроРНК, а именно активации онкосу-прессорных и подавления онкогенных молекул, что возможно как напрямую через транскрипционнозависимые механизмы, так и косвенно (рис. 1).

Рис. 1. Регуляция экспрессии микроРНК белком р53 на уровне транскрипции и созревания микроРНК (источник с изменениями [61]).

Fig. 1. Regulation of microRNA expression by p53 protein at the level of transcription and microRNA maturation.

Важно отметить, что вариабельность сигнатуры экспрессии р53-регулируемых микроРНК и их генов-мишеней зависит от типа клеток, природы стресса и причины повреждения ДНК. При этом регулируемые р53 микроРНК вовлечены в комплекс обратных и прямых связей с р53, что способствует совместному контролю, усилению и настройке сигналов в ответ на стресс.

Так, в генах ряда онкосупрессорных микроРНК, например, let-7, miR-16-2, miR-29b, miR-34a, miR-34b/c, miR-107, miR-145 и других, были выявлены р53-респонзивные элементы, связываясь с которыми, р53 индуцирует их транскрипцию. Экспрессия других микроРНК, таких как miR-107, miR-122, miR-182, miR-200, miR-205, miR-605 и miR-1204, также потенциально может регулироваться за счет прямого связывания р53 с промоторами генов, однако необходимы экспериментальные подтверждения такого взаимодействия [5].

Помимо прямой регуляции транскрипции возможно участие р53 в регуляции экспрессии микроРНК на посттранскипционном уровне путем влияния на процессинг данных молекул. Показано, что р53 усиливает посттранскрипционный процессинг онкосупрессорных микроРНК miR-16-1, miR-143 и miR-145 в ответ на повреждение ДНК как на уровне связывания с белковым комплексом Drosha, так и на уровне связывания с белковым комплексом Dicer [11, 12].

Большинство мутаций в гене ТР53 , ответственном за синтез р53, при злокачественных новообразованиях человека находятся в ДНК-связывающем домене, который имеет ряд функций [13]. Определение данных мутаций имеет большое значение для определения прогноза и тактики ведения больных НХЗЛ [14]. Давно известно, что ДНК-связывающий домен белка р53 не только контактирует с ДНК и позволяет активировать гены-мишени (включая гены микроРНК) для индуцирования апоптоза или остановки клеточного цикла, но и стимулирует запуск программируемой клеточной смерти через взаимодействие с белками семейства BCL2 в митохондриях. В экспериментах на мышах были получены убедительные доказательства того, что некоторые мутантные варианты р53 не просто утрачивают нормальные онкосупрессорные функции белка, но и приобретают стимулирующие опухолевый рост свойства, например, путем изменения спектра р53-регулируемых генов [15].

Позднее появились данные о том, что транскрипционно-неактивные мутантные варианты р53 препятствуют функциональной сборке комплекса Drosha, имеющего основную роль в инициации процессинга микроРНК в ядре. В частности, мутации в «горячих» точках р.R175H и р.R273H коррелируют с более низкой активностью Drosha, в то время как Р53, с мутацией р.C135Y, которая редко встречается при опухолях, не име- ет такого влияния на Drosha [16]. Эти данные свидетельствуют о том, что транскрипционнонезависимая модуляция биогенеза микроРНК является еще одним из аспектов противоопухолевой активности р53.

В последнее десятилетие возрос интерес к изучению метилирования генов микроРНК при гемобластозах. Активно изучается значение данных молекул в нормальной дифференцировке и функционировании кроветворных клеток и их дерегуляции в развитии опухолей. Несмотря на то, что общие знания о роли микроРНК в развитии злокачественных новообразований системы крови накапливаются быстрыми темпами [6, 17], данные по частоте и спектру метилирования генов микроРНК, участию метилирования онкосупрес-сорных микроРНК в прогрессии опухоли, его прогностической, предиктивной и диагностической ценности при гемобластозах немногочисленны.

Далее будут описаны имеющиеся данные о роли р53-респонзивных онкосупрессорных микроРНК и частоте метилирования кодируемых ими генов при злокачественных новообразованиях системы крови.

Метилирование генов р53-респонзивных микроРНК при опухолях системы крови Гены кластера miR-143/145

Гены MIR-143 и MIR-145 находятся на расстоянии 1.3 kb (килобаз) друг от друга в хромосомном регионе 5q33. Предполагается, что miR-143 и miR-145 образуются с общего предшественника и их функции кооперированы [18]. Геном-«хозяином» данного кластера микроРНК является ген некодирующей РНК CARMN . Известно, что нокдаун CARMN снижает экспрессию miR-143 и miR-145. С другой стороны, для кластера идентифицированы независимые транскрипционные факторы и отдельная промоторная регуляция экспрессии miR-145 [19].

Показано, что уровень miR-145 повышается в ответ на стресс через PI3K/Akt и p53-опосредованные пути. Транскрипция ее индуцируется при связывании р53 с соответствующим регуляторным элементом в промоторе гена [18]. В отличие от такого прямого воздействия участие белка р53 в регуляции экспрессии miR-143 происходит на посттранскрипционном уровне. Созревание pri-miR-143 в pre-miR-143 в ядре клетке запускается за счет связи p53 с компонентами комплекса Drosha [20].

Учитывая количество и спектр целевых генов, кластер miR-143/145 является важным для онкогенеза (табл. 1). Мишенями miR-145 являются онкоген BCL2, промоторы клеточного цикла ци-клинкиназы CDK4 и CDK6, циклин D1, регулятор деградации р53 убиквитинлигаза MDM2, а также транскрипционные факторы OCT4, SOX2 и KLF4, ответственные за самообновление недифференцированных эмбриональных стволовых клеток [18,

• 21] . Соответственно, выключение этих генов на посттрансляционном уровне за счет микроРНК приводит к активации апоптоза, снижению способности к пролиферации и подавлению плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток.

Наиболее примечательное открытие в отношении miR-145 касается определения роли miR-145 в посттранскрипционной регуляции C-MYC . Так, miR-145 непосредственно нацелена на онкоген C-MYC [18]. Более поздние исследования показали, что мишенью данной микроРНК является также ген ERK5 . Кодируемый им белок участвует в передаче сигнала по MAPK-путям в ответ на стимулы факторов роста, полученные клеткой через рецепторные тирозинкиназы или рецепторы, сопряженные с G-белками, что в конечном итоге приводит к активации C-MYC [22]. Другими мишенями miR-145 являются ДНК метилтрансфераза DNMT3b и онкоген RAS . Предполагается, что между miR-145 и DNMT3b, К-RAS и С-MYC, а также miR-143 и DNMT3а, К-RAS существует перекрестная регуляция через двойные отрицательные контуры обратных связей [18, 22].

Биоинформационный анализ и исследования на культурах опухолевых клеток показывают, что потенциальными мишенями для miR-143 и miR-145 могут быть и ряд других м-РНК, в т. ч. транскрипционных факторов, обладающих онкогенными функциями [23], но необходимо экспериментальное подтверждение полученных таким образом данных для разных патологических состояний и типов тканей. Однако уже сейчас понятно, что низкая экспрессия miR-143 и miR-145 может привести к несбалансированному сигнальному каскаду, включающему MAPK, и устойчивой клеточной пролиферации, а также напрямую и косвенно приводит к усилению клеточного роста и выживания, подавлению апоптоза и увеличению способности к адгезии, инвазии и миграции клеток [24, 25].

В отличие от здоровых тканей экспрессия данных молекул снижена при опухолях. На материале, полученном от здоровых доноров, показано, что miR-143 высоко экспрессируется в гемопоэтических клетках костного мозга различной стадии дифференцировки. MiR-145, напротив, в здоровых гемопоэтических клетках костного мозга практически не обнаруживается [26]. Известно также, что miR-145 менее выраженно экспрессируется в В-клетках памяти в сравнении с наивными В-клетками [27]. Предполагается, что уровень miR-143 и miR-145 может служить биологическим маркером для отличия опухолевых и нормальных В-лимфоцитов. При В-клеточных лимфоидных новообразованиях экспрессия miR-145 и miR-143 резко снижена [28]. Даунрегуляция miR-145 была показана при ДВККЛ, в т. ч. при первичной ДВККЛ центральной нервной системы [29, 30].

В экспериментах на линиях клеток лимфомы Беркитта (ЛБ) также продемонстрировано снижение уровня miR-143 и miR-145 [28]. Восстановление экспрессии данных микроРНК при ЛБ, множественной миеломе (ММ) и Т-клеточном остром лимфобластном лейкозе (Т-ОЛЛ) приводило к снижению роста опухолевых клеток [31]. Кроме того, как в клеточных моделях in vitro, так и в мышиной модели ксенотрансплантата для множественной миеломы человека нормализация экспрессии miR-145 потенциировала противоопухолевую активность бортезомиба [32], а при раках обусловливала радиочувствительность опухоли [33].

На большом числе солидных новообразований (глиома, рак простаты, толстой кишки, яичников, легких, молочных желез, нейроэндокринные опухоли гипофиза) показано, что низкая экспрессия микроРНК кластера miR-143/145 зачастую связана с аберрантным метилированием [33, 34], а обработка культур опухолевых клеток деметилирующими агентами приводила к восстановлению их транскрипции [24, 34].

В отличие от злокачественных новообразований эпителиальной природы данных о статусе метилирования генов микро-РНК кластера miR-143/145 при гемобластозах и, в частности, при лимфомах практически нет. Единственное встреченное нами в литературных источниках сообщение об эпигенетическом выключении их экспрессии касается линии NK/T-клеточной лимфомы miR-143 [22].

Гены семейства miR-34

Семейство miR-34 включает в себя три онко-супрессорных микроРНК: miR-34a, miR-34b и miR-34c, для которых характерна высокая степень (более 80 %) гомологичности последовательности. Однако точная гомология соблюдается в районе их 5'-концов – районе расположения ключевой последовательности, необходимой для связывания с м-РНК мишенями. Геном-«хозяином» MIR-34A является EF570048 , а MIR-34B/C – ген BC021736 . При этом показано, что регуляция транскрипции MIR-34b/c может осуществляться и с промотора не только хозяйского гена, но и промотора противоположно ориентированного гена BTG4 . Промотор и сайт начала транскрипции MIR-34A был картирован более чем на 30 kb выше последовательности, кодирующей зрелую микроРНК [35].

Ген MIR-34A находится на 1-й хромосоме в регионе 1p36.22, тогда как ген MIR-34B/C – на хромосоме 11 в регионе 11q23.1. Последний отвечает за последовательность бицистронного транскрипта, с которого в последующем образуются две зрелые микроРНК. MIR-34A и MIR-34B/C были первыми генами микроРНК, для которых была показана прямая индукция транскрипции белком р53. Кроме того, miR34A может создавать положительную петлю обратной связи с р53 путем подавления деацетилазы SIRT1, что приводит к ацетилированию и активации р53. Даунрегуляция их экспрессии осуществляется белком C-MYC [36].

С помощью биоинформационного анализа и в экспериментальных исследованиях показано, что микроРНК семейства miR-34 имеют большое число общих мишеней, а именно, м-РНК регуляторов клеточного цикла в контрольной точке перехода G1/S фаз, репарации повреждений ДНК и программированной клеточной смерти, эпителиально-мезенхимального перехода, миграции, противоопухолевого имунного ответа и неоангиогенеза [37]. Соответственно, уменьшение экспрессии miR-34a и miR-34b/c способствует злокачественному росту и может наблюдаться в различных опухолях (табл. 1).

Метилирование промоторных областей генов семейства miR-34 является причиной снижения их экспрессии при широком круге злокачественных новообразований, например, при раке толстого кишечника, поджелудочной железы, молочных желез, яичников, почек и саркомах мягких тканей и других [38]. Промоторы генов MIR-34A и MIR-34B/C содержат CpG-островки, гиперметилирование которых приводит к нарушению транскрипции кодируемых ими микроРНК. Другой причиной снижения их экспрессии при злокачественных новообразованиях могут быть хромосомные делеции [39].

Изучение роли метилирования генов кластера miR-34 при опухолях системы крови выявило следующее. В образцах опухолевой ткани пациентов с впервые выявленной ДВККЛ и в клеточных линиях ДВККЛ метилирование MIR-34A и MIR-34B/C было обнаружено в 28 и 78 % случаев соответственно с высокой степенью корреляции между генами (р=0,001). При этом в нормальных Т- и В-клетках и ткани реактивных лимфоузлов метилирования генов микроРНК семейства miR-34 не выявлено [36].

При множественной миеломе нарушение экспрессии микроРНК кластера miR-34 также зачастую связано с аберрантным метилированием

Таблица 1/table 1

Краткие сведения об описанных р53-респонзивных онкосупрессорных микроРНКBrief information about the described p53-responsive oncosuppressive microRNas

		Снижение				Метилирование
МикроРНК/ MicroRNA	Ген/ Gene	Расположение/ Location	Локализация/ Localization	Биологический процесс/ Biological process	экспрессии микроРНК/ Reduction of	гена микроРНК/ Methylation of the microRNA
					microRNA
						gene
					expression

ПЛЦНС, Т-ОЛЛ, ДВККЛ, ЛМЗС, Нет анных/ miR-145                                           Контроль клеточного цикла, В-НХЛ, ЛБ/       е N т o да d н a н ta ых апоптоз, дифференцировка PLCNS, T-ALL, нутригенное,                      клеток, клеточная      DLBCL, LMZS, ген-«хозяин» адгезия, эпителиально-     B-NHL, BL MIR-      CARMN/ 5q33      мезенхимальный переход/ ОЛЛ, В-НХЛ, 143/145     Intragenic,                        Cell cycle control, apoptosis,         , ЛБ      , host gene                                                                  , CARMN                     cell differentiation, cell adhe- NK/T-клеточная NK/T-клеточная sion, epithelial-mesenchymal    лимфома/       лимфома/ miR-143                                                       transition           ALL, B-NHL, NK/T-cell lym- HL,          phoma NK/T-cell lymphoma

Контроль клеточного                      ДВККЛ, Внутригенное, цикла, репарация ДНК,    ХЛЛ, ДВККЛ, NK/T-клеточная ген-«хозяин» MIR-                                    апоптоз, эпителиально-       ЛБ, ЛХ/      лимфома, ЛХ/ miR-34а               EF570048/       1p36.22 34A                                мезенхимальный переход, CLL, DLBCL, DLBCL, NK/T- Intragenic, host противоопухолевый         BL, HL      cell lymphoma, gene EF570048 иммунный ответ,                           HL неоангиогенез/ нутригенное,                     Cell cycle control, DNA ген-«хозяин»                                            ХЛЛ, ММ, MIR-                                       repair, apoptosis, epithelial-                     ХЛЛ, ДВККЛ/ miR-34b/c 34B/C     BC021736/       11q23.1        mesenchymal transition,      ДВККЛ/CLL,     CLL, DLBCL Intragenic, host                                             MM, DLBCL antitumor immune response, gene BC021736 neoangiogenesis

Дифференцировка клеток, пролиферация и клеточный рост, апоптоз, репарация                    Т-НХЛ, ОМЛ, ДНК, радиационная                    ХЛЛ, В-НХЛ, miR-203   MIR-203 Межгенное/       14q32.33         чувствительность,     ММ, ХМЛ, ЛХ/ ММ, ХМЛ, ЛХ/ Intergenic                       неоангиогенез/       MM, CML, HL T-NHL, MM, Cell differentiation, prolifera-                         CLL, HL tion and cell growth, apop tosis, DNA repair, radiation sensitivity, neoangiogenesis

Примечание: ПЛЦНС – первичная лимфома центральной нервной системы; ОЛЛ – острый лимфобластный лейкоз; ОМЛ – острый миелобластный лейкоз; ДВККЛ – диффузная В-клеточная крупноклеточная лимфома; ЛМЗС – лимфома маргинальной зоны селезенки; В-НХЛ – В-клеточные неходжкинские лимфомы; T-НХЛ – T-клеточные неходжкинские лимфомы; ЛБ – лимфома Беркитта; ХЛЛ – хронический лимфоидный лейкоз; ХМЛ – хронический миелоидный лейкоз; ММ – множественная миелома; ЛХ – лимфома Ходжкина.

Note: PLCNS – primary lymphoma of the central nervous system, ALL – acute lymphoblastic leukemia, AML – acute myeloblastic leukemia, DL-BCL – diffuse large B-cell lymphoma, LMZS – lymphoma of the marginal zone of the spleen, B-NHL – B-cell non-Hodgkin lymphoma, T-NHL – T-cell non-Hodgkin lymphoma, BL – Burkitt lymphoma, CLL – chronic lymphocytic leukemia, CML – chronic myelogenous leukemia, MM – multiple myeloma, HL – Hodgkin’s lymphoma.

• [45 ]. При этом было показано, что MIR-34A не метилирован в нормальных клетках крови, в отличие от клеточных линий ММ, лимфомы Ходжкина (ЛХ) и неходжкинских лимфом (НХЛ), что может свидетельствовать о специфичности гиперметилирования гена для лимфоидных клеток опухолевого происхождения и подтверждать онкосупрессорную

роль данной микроРНК [35, 46]. Согласно данным другого исследования, метилирование MIR-34B/C было выявлено в 34 % случаев ОЛЛ [47].

Таким образом, складывается впечатление, что гены кластера miR-34 часто гиперметилированы при лимфопролиферативных заболеваниях опухолеспецифическим образом.

Ген MIR-203

MIR-203 расположен в межгенном участке хромосомного локуса 14q32.33, который часто подвергается делеции при опухолях. Кодируемая им микроРНК miR-203 впервые была идентифицирована в коже, где она способствует дифференцировке клеток эпидермиса и ограничивает их пролиферативный потенциал [48]. В недавнем исследовании было показано, что преходящее воздействие этой микроРНК улучшает дифференци-ровочную способность мышиных и человеческих плюрипотентных стволовых клеток [49].

Было отмечено, что повышение экспрессии miR-203 происходит при активации р53. В основе этого явления лежит ускорение созревания miR-203 путем усиления ее Drosha-опосредованного процессинга под действием белка р53 [20]. Сообщалось также, что miR-203 нацелена на эволюционно консервативную последовательность в 3’-нетранслируемой области м-РНК BCL-W , который имеет антиапоптотическую активность. Так, усиленная экспрессия BCL-W делает лимфоидные и миелоидные клетки рефрактерными к цитотоксическим воздействиям. Однако индукция miR-203 приводит к подавлению экспрессии BCL-W и антиапоптотическому эффекту только в p53 (+) клетках [51].

Биоинформационный анализ показывает, что miR-203 может повышать радиационную чувствительность и миграционную способность клеток за счет посттранскрипционного контроля генов PI3K/AKT, SRC, Ras/MAPK и JAK/STAT3 сигнальных путей, а именно, за счет нацеливания на следующие мишени: ATM , RAD51 , SRC , PLD2 , FGF2 , PI3K-AKT , JAK-STAT3 , VEGF , HIF-1α и MMP2 . Также предсказанными мишенями miR-203 является ДНК-метилтрансфераза DNMT3b и мРНК гена CREB1 , который участвует в пролиферации и выживании лейкозных клеток.

MIR-203 имеет CpG островок протяженностью 804 п.н. [52]. Метилирование его как причина снижения экспрессии miR-203 показано при солидных опухолях [50, 53]. При лимфопролиферативных заболеваниях впервые метилирование гена MIR-203 показано при Т-клеточных лимфомах [54]. Частота данного события при ОЛЛ составляла 27 % [47].

Позднее была изучена экспрессия и метилирование MIR-203 в смешанной выборке онкогема- тологических больных (n=150). Метилирование обнаруживалось в образцах ОМЛ с частотой 10 %, хронического лимфоидного лейкоза (ХЛЛ) – 42 % и НХЛ – 38,8 % (в 60 % – при лимфомах из NK-клеток, в 40,9 % – при лимфомах В-клеточного, в 23,5 % – при Т-клеточного происхождения). В нормальных клетках крови и костного мозга метилирование MIR-203 выявлено не было, что согласуется с идеей об опухолеспецифичном паттерне метилирования гена данной микроРНК [55].

В опухолевых клетках больных хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ) и в линии бластных клеток Ph-позитивного ХМЛ K-562 метилирование промотора гена отсутствовало, что плохо согласовалось с данными предыдущих исследований о преимущественном гиперметилировании MIR-203 при Ph-позитивных лейкозах (с экспрессией BCR-ABL ) и редком его обнаружении при Ph-негативных острых лейкозах или хронических миелопролиферативных заболеваниях [54]. Также было показано, что ингибитор BCR-ABL иматиниб вызывает деметилирование промоторной области MIR-203 , что приводит к низкой экспрессии целевого гена BCR-ABL1 и остановке пролиферации лейкозных клеток [56].

Сопоставление частот фиксации аберрантного метилирования MIR-203 при моноклональных гаммапатиях неясного генеза, впервые диагностированной множественной миеломе и в рецидиве заболевания позволяет предположить, что гиперметилирование данного гена является ранним событием в генезе заболевания, а не приобретается на этапах прогрессирования опухоли [57].

На клеточных линиях клеток лимфомы Ходжкина, неходжкинских лимфом и множественной миеломы была показана обратимость аберрантного метилирования промотора MIR-203 под действием обработки 5-Аза-2'-дезоксицитидином, что приводило к восстановлению экспрессии miR-203. Нормализация уровня микроРНК в клетках ингибировала клеточную пролиферацию или индуцировала гибель опухолевых клеток, что подтверждало данные об ее онкосупрессорной роли при лимфоидных новообразованиях [46, 54–56].

Общие мишени р53-респонзивных онкосупрессорных микроРНК

Развитие кроветворения – это многоступенчатый четко регулируемый процесс, в ходе которого гемопоэтические клетки подвергаются пролиферации и линейной дифференцировке. Он требует включение сети транскрипционных факторов, которые на различных этапах активируются или ингибируются высокоорганизованным образом. За последние десятилетия ряд исследований показал, что микроРНК могут влиять на экспрессию регуляторных белков в клетке [1].

р53-респонзивные микроРНК связаны с контролем многочисленных внутриклеточных сиг-

Таблица 2/ table 2

Общие значимые для развития гемобластозов мишени р53-респонзивных онкосупрессорных микроРНК common significant for the development of hemoblastosis targets of p53-responsive oncosuppressive microRNas

Мишень/Target C-MYC CDK4/6 MDM2/4

BCL2/MCL1 CYCLIN-D1 DNMT3A/B

K-RAS

FOXP1

NOTCH1/2

VEGFA

STAT3

SOX2/4/9

miR-143          miR-145

miR-34а

miR-34в/с          miR-203

Примечание: серым цветом отмечены молекулярные мишени микроРНК.

Note: The molecular targets of microRNAs are marked in gray.

нальных путей, определяющих самообновление клеток, пролиферацию, репарацию повреждений ДНК, программированную клеточную смерть, эпителиально-мезенхимальный переход и миграцию, противоопухолевый иммунный ответ и неоангиогенез. По данным литературы, частыми общими мишенями для микроРНК miR-34a, miR-34b/с, miR-145, miR-143 и miR-203 являются м-РНК ряда проонокогенов (табл. 2). Для того чтобы продемонстрировать глубину имеющихся между ними взаимосвязей, необходимо отдельно остановиться на некоторых из мишеней данных молекул.

Циклин-D1 – это белок, который у человека кодируется геном CCND1 . Совместно с Циклином-D2 данный белок образует комплекс с регуляторными субъединицами циклинкиназ CDK4 и CDK6. В свою очередь, комплекс циклинов с циклинки-назами активирует белок ретинобластомы Rb, что способствует переходу клеточного цикла из G1 в S-фазу. Избыточная экспрессия циклинов и циклинкиназ, ускоряющая прогрессию клеточного цикла и деление клеток, часто наблюдается в различных опухолях и может способствовать онкогенезу [58].

Транскрипционный фактор C-MYC прямо или косвенно активирует экспрессию генов клеточного цикла – CCND2 и циклинкиназ, и, таким образом, также обеспечивает переход клеточного цикла в контрольной точке G1/S фаз. Другим важным про-онкогенным свойством С-MYC является то, что с его участием в клетке останавливается апоптоз, вызванный белком p53.

BCL2 и MCL1 относятся к белкам семейства BCL2, соотношение которых в клетке регулирует проницаемость митохондриальной мембраны. Они играют важную роль в выживании клеток и негативной регуляции программированной клеточной смерти, что реализуется как за счет прямого ингибирования ими проапоптотических белков, так и за счет предотвращения активации каспазозависимого пути апоптоза, гиперэкспрессия данных молекул в лимфоцитах в сочетании с повышением уровня C-MYC доказанно приводит к развитию агрессивных лимфопролиферативных опухолей [59].

Другая общая мишень активируемых р53 микроРНК – MDM2, который является важным негативным регулятором белка р53. Белок MDM2 функционирует как убиквитинлигаза, способствующая деградации р53, и как ингибитор транскрипционной активации гена ТР53 [60].

Гены DNMT3А и DNMT3B кодируют ДНК-метилтрансферазы, которые участвуют в метилировании генома de novo, в т. ч. аберрантном метилировании оноксупрессорных генов и генов р53-респонзивных микроРНК. Недавние наблюдения показывают, что DNMT3B – это основной фермент, метилирующий области активных генов, а нарушение его работы является общим признаком таких заболеваний человека, связанных с хромосомной и геномной нестабильностью, как опухоли [61]. Соматические мутации DNMT3A часто встречаются при ОМЛ и других гематологических злокачественных новообразованиях.

Таким образом, представленный обзор литературы показывает, что частыми общими мишенями для активируемых р53 микроРНК являются м-РНК ряда проонкогенных молекул, а именно транскрипционных факторов, а также позитивных регуляторов клеточного цикла в контрольной точке перехода G1/S фаз, антиапоптотических белков, метилтрансфераз.

Многие из описанных микроРНК встроены в двойные отрицательные регуляторные петли или регуляторные петли с положительной обратной связью. В связи с чем следует отметить наличие положительных обратных связей между р53 и активируемыми им микроРНК, а также отрицательные обратные связи между р53-респонзивными микроРНК и C-MYC и ДНК-метилтрансферазами. Соответственно, даже небольшое изменение уровня экспрессии микроРНК может иметь больший фенотипический эффект за счет усиления регуляторного контура.

Заключение

Поскольку аберрантное метилирование ДНК при опухолях может приводить к транскрипционной репрессии онкосупрессорных молекул и зачастую носит ткане- и/или опухолеспецифичный характер, нами проведен анализ имеющихся в литературе данных о частоте и значении метилирования генов ряда р53-респонзивных онкосупрессорных микроРНК при опухолевых заболеваниях системы крови. Обзор уточняет современные представления о регуляторной сети белка р53 и активируемых им микроРНК, а также подчеркивает функциональную ассоциацию р53-респонзивных молекул.

Важно, что каждая м-РНК содержит несколько эволюционно консервативных сайтов связывания с различными микроРНК, а каждая микроРНК может нацеливаться на несколько генов в одном и том же пути и, таким образом, достигать еще более значимой модуляции своей активности. При этом miR-34a, miR-34b/с, miR-145, miR-143 и miR-203 имеют множество общих мишеней. Таким образом, аберрантное метилирование генов, кодирующих данные микроРНК, потенциально может дерегулировать несколько функционально связанных мишеней, вовлеченных в отдельный