Метод оценки антигликирующей активности in vitro новых веществ

Неферментативная реакция между свободными аминогруппами белков и карбонильными группами восстановленных сахаров и других карбонильных соединений известна как реакция Майяра, названная так в честь Louis-Camille Maillard, который в 1912 г. первым обнаружил и описал коричнево-окрашенные конечные продукты реакции глюкозы с аминогруппой глицина [6]. Данная реакция протекает в несколько этапов. На ранней стадии глюкоза (или другие восстановленные сахара) реагирует со свободной аминогруппой биологических аминов с образованием нестабильного соединения, основания Шиффа, которое подвергается перегруппировке до более стабильного вещества известного как продукт Амадори. В поздней стадии гликирования необратимые соединения, называемые конечными продуктами усиленного гликозилирования (КПГ), формируются за счет реакций окисления, дегидратации и циклизации [12].

Процесс гликирования, усиливающийся при гипергликемии, лежит в основе патогенеза микро-и макрососудистых осложнений сахарного диабета (СД) [1]. КПГ влияют на коллаген типа IV, миелин, тубулин, активатор плазминогена-1, фибриноген. Рецептор-зависимые эффекты КПГ опосредованы их взаимодействием со специфическими рецепторами, что приводит к активации ядерного фактора NF-κB, который перемещается в ядро и приводит к повышению транскрипции молекул межклеточной адгезии-1, E-селектина, эндотелина-1, сосудистого эндотелиального фактора роста, провоспалительных цитокинов [4].

Первым и наиболее изученным веществом, ингибирующим гликирование белков, является аминогуанидин, который предотвращает формирование КПГ [9]. Однако клинические испытания данного препарата были остановлены в связи с его недостаточной эффективностью и наличием побочных эффектов (гастроинтестинальные симптомы, волчаночно-подобный, гриппоподобный синдромы, васкулит [3], анемия [2]). Антигликирующая активность выявлена у пиридок-самина, гидразиновых производных тиазолидина [9] и карбоксимидамида [13], имеющие структурное сходство с аминогуанидином, производные феноксиизомасляной кислоты [11]. Все вышеперечисленное обусловливает актуальность поиска веществ, предотвращающих образование КПГ, с целью создания лекарственных препаратов для патогенетической профилактики осложнений СД.

В настоящее время существует большое количество разнообразных методов моделирования реакции Майяра in vitro . Например, методические подходы, связанные с определением конечных продуктов гликирования, образовавшихся в результате реакции между модельным белком (бычий сывороточный альбумин, человеческий сывороточный альбумин) и сахарами (глюкоза, фруктоза, рибоза) или дикарбонильными веществами (глиоксаль, метилглиоксаль) [10, 7], часто используют для поиска новых ингибиторов неферментативного гликозилирования. Наиболее часто для регистрации КПГ в реакционной смеси используют метод определения специфической флуоресценции гликированных белков при длине волны возбуждения/испускания 370/440 нм [8].

* Работа была выполнена за счет средств гранта Российского научного фонда (проект №14-25-00139).

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Воспроизвести реакцию Майяра in vitro для оценки антигликирующей активности новых соединений.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Реакцию гликирования воспроизводили по методу [5]. Конечный объем реакционной смеси составлял 1,5 мл. Реакционная смесь содержала растворы бычьего сывороточного альбумина (1 мг/мл) и глюкозы (500 мМ) в фосфатном буфере (pH 7,4).

Для оценки адекватности воспроизведения метода использовали аминогуанидин, раствор которого добавляли в экспериментальные образцы в различных концентрациях в объеме 50 мкл. В контрольные пробы добавляли фосфатный буфер в аналогичном объеме. Для предупреждения бактериального роста в буферный раствор вносили азид натрия в конечной концентрации 0,02 %. Все экспериментальные образцы инкубировали в течение 24 часов при 60 °С.

По истечении срока инкубации проводили определение специфической флуоресценции гликированного бычьего сывороточного альбумина на спектрофлуориметре MPF-400 (Hitachi,

Япония) при длине волны возбуждения 370 нм и испускания 440 нм.

Обработку полученных данных проводили с использованием табличного редактора Microsoft Excel 2007 и непараметрических методов статистики в программе GraphPad Prism (версия 5.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Формирование КПГ подтверждается наличием характерного пика флуоресценции контрольных образцов при длинах волн возбужде-ния/испускания 370/440 нм. В ходе проведенных исследований была подтверждена антигликирующая активность аминогуанидина, которая носила дозозависимый характер (см. рис.). Было показано, что аминогуанидин снижал гликирование БСА в концентрации 1 мМ; 0,5 мМ и 0,1 мМ на 70, 54 и 7 % соответственно. На основании полученных данных, был рассчитан показатель IC 50 , который составил 459 мкМ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, воспроизведенная модель является адекватной и может служить для оценки антигликирующей активности соединений и поиска новых ингибиторов реакции Майяра.

Рис. Антигликирующая активность аминогуанидина:

* – данные достоверны по отношению к контролю (р < 0,01), U-критерий Манна–Уитни