Метод получения высокопротеиновых фитокомпозитов с использованием вторичных продуктов льнопереработки

Республика Беларусь входит в число мировых лидеров по объемам производства льноволокна. При этом учитывая последние тенденции ведения аграрной политики страны, активное развитие льняной отрасли является одним из приоритетных направлений в рамках Государственной программы Республики Беларусь на 2016–2020 годы (подпрограмма 1 «Развитие растениеводства, переработки и реализации продукции растениеводства»), реализация которой позволит обеспечить повышение урожайности льна-долгунца до 11 центнеров с гектара и объема выпуска льноволокна до 55 тыс. тонн в год [1].

Наращивание мощности производства льноволокнистых материалов обусловливает необходимость решения актуальных задач повышения полноты использования льняного сырья за счет эффективных методов применения вторичных продуктов его переработки в различных технологических сферах. Одним из мировых трендов развития данного направления является совершенствование технологий обработки льноволокнистых отходов с целью получения современных биокомпозитных материалов для авто- и авиастроения, строительной индустрии, сельского хозяйства, прежде всего, кормопроизводства и т. д. [2‒4]. В последнем случае методологические подходы получения композиционных кормовых продуктов призваны решать вопросы оптимизации протеинового питания, что особенно важно при организации сбалансированных рационов для крупного рогатого скота. В свете указанных приоритетов решаемые задачи настоящих исследований направлены на повышение полноты полезного использования льняного сырья с учетом ключевой проблемы обеспечения жвачных животных полноценным протеиновым питанием.

Предварительный научный задел в изучении закономерностей развития сорбционных свойств льноволокнистых материалов показал [12‒14], что для связывания сорбатов с крупным размером молекулы действие модифицирующих ферментов необходимо направить на развитие мезопоровых пространств для эффективного проявления механизмов физической адсорбции, предупреждая при этом деструкцию пектиновых веществ, обладающих хемосорбционной способностью, и обеспечивая их структурное высвобождение из пространственной сетки углевод-белкового комплекса связующих веществ между фибриллами целлюлозы. В случае модификации ровницы чесаного льняного волокна влияние параметров пористости и доступности адсорбционных центров на уровень белковосвязывающей способности (АБ, мг/г) описывается уравнением [12]

А Б = 0,078 + 1,023 ■ СВП + 0,265 ■ S мезо , R = 0,998 , (1)

где СВП – содержание структурно высвобожденного пектина (мг/г волокна), оценивается по доле пектиновых веществ, которые извлекаются раствором с определенной концентрацией щавелевой кислоты; Sмезо – площадь удельной поверхности мезопор (м2/г), оценивается по данным равновесной сорбции соответствующего молекулярного маркера (краситель метиленовый голубой, ГОСТ 13144-79).

Исследована специфика биомодификации трех видов отходов льнопереработки (костра, пакля и вытряска) композицией с рекомендованным [11] уровнем показателей активности ферментов в растворе (ед./мл):

‒ эндо-1,4-β-глюканаза – 600;

‒ экзо-1,4-β-глюканаза – 1000;

‒ β- глюкозидаза – 50;

‒ эндо-1,4-β-D-ксиланаза – 500;

‒ экзо-1,4-β-D-ксилозидаза – 300.

Маломодульный режим биообработки (жидкостной модуль 5:1) с последующей сушкой предопределяет отсутствие экстракционных потерь продуктов ферментативного гидролиза.

Перед биообработкой для всех видов льняных субстратов проводился отсев дисперсной фракции «пектиновой пыли». Отличительной особенностью режима биомодификации препаратов льняной костры является проведение предварительного извлечения фракции водорастворимых олигомерных пектинов, мигрирующих в условиях лугового расстила из расщепляемых паренхимных тканей стебля в слой древесины. Для этого измельченную пробу заливали в реакторе теплой (40 °С) дистиллированной водой до величины гидромодуля М = 5:1 и перемешивали в течение 6–8 часов. Жидкую фазу пектинового геля отделяли центрифугированием с целью последующего возврата в биомодифицированный субстрат на заключительной стадии обработки.

Представленные на рисунке 1 экспериментальные данные позволяют проследить динамику вскрытия мезопоровых пространств льняных субстратов в процессе биообработки. Пронумерованные столбцы демонстрируют результаты обработки сырья разных производителей.

Рисунок 1 ‒ Изменение площади удельной поверхности мезопоровых пространств ( S мезо ) исследуемых льноматериалов в результате ферментативной модификации

В начальный период времени скорость вскрытия внутреннего объема волокнистых угаров значительно превышает темп нарастания величины S мезо для костры с преимущественным содержанием фракции древесины. Количественным критерием темпов роста показателя на начальном этапе биообработки является величина множителя при линейном члене зависимостей:

‒ вытряска

Sмезо=9,441 + 24,431 -т - 2,705 -т2, R = 0,974;(2)

‒ пакля

Sмезо = 9,696 +16,015 т - 0,245 -т2, R = 0,984;(3)

‒ костра

Sмезо = 10,310 +11,038 т-1,561 -т2, R = 0,988.(4)

Видимой причиной задержки являются стерические трудности для диффузии глобул биокатализатора в макропоровую систему трахеальных каналов ксилемы льна по сравнению с более доступными межволоконными пространствами волокнистых угаров. Для костры не удается создать такую же удельную поверхность мезопор. Вместе с тем, сравнивая множитель при квадратичном члене уравнений (2) и (4), отмечаем, что при обработке образцов вытряски темп нарастания пористости затухает, а на костре после первоначальной задержки скорость приращения величины Sмезо прогрессирующе возрастает. Следовательно, в случае недостаточной сорбционной активности биомодифицированных препаратов костры есть возможность повышения результата за счет увеличения продолжительности обработки.

На рисунке 2 продемонстрировано изменение доступности пектинов в результате биомодификации льняных субстратов. Заметим, что для исходных льноматериалов как в волокнистом, так и в древесном компонентах структурно высвобожденный пектин обнаруживается лишь в следовых количествах. Их накопление при биомодификации волокнистой фракции происходит намного эффективнее, чем в ксилеме льняного стебля. Низкий результат для образцов костры обусловлен двумя факторами: во-первых, в целом невысоким содержанием пектина в ксилеме после экстракции мигрирующих олигоуронидов и, во-вторых, высоким содержанием в его структуре кальций-пектатных форм, обеспечивающих образование межцепных ковалентных связей, которые не позволяют макромолекулам полиуронидов уходить в раствор даже после деструктирующего воздействия на окружающие их гликаны в структуре углевод-белковых комплексов.

Рисунок 2 ‒ Нарастание содержания структурно высвобожденных пектинов (СВП) в структуре исследуемых льноматериалов в процессе ферментативной модификации

Ситуация исправляется при возврате в систему предварительно извлеченной фракции водорастворимых пектиновых веществ. Биомодификация создает условия для диффузии пектинового геля в капиллярно-поровую систему костры, а благодаря адгезионной активности олигоуронидов обеспечивается их иммобилизация на внутренней поверхности поровой системы, что делает костру вполне конкурентоспособным объектом в сравнении с биомодифицированными льноволокнистыми хемосорбционного связующего при фитокомпозитов.

материалами       для связывания протеинового получении кормовых

На рисунке 3 суммированы результаты тестовых экспериментов по определению белковосвязывающей способности льноматериалов, подвергнутых модификации с варьируемой продолжительностью ферментативной обработки. В качестве модельного маркера использовали сывороточный альбумин.

При проведении совместной математической обработки экспериментальных данных, проиллюстрированных на рисунках 1–3, получена корреляционная зависимость:

А Б = 2 ,590 + 0,120 - СВП + 1 ,150 - S мезо , R = 0,983. (5)

Как видно, при включении в число объектов корреляционного анализа льноматериалов с высоким содержанием частиц древесины, которые в исходном состоянии практически не набухают, сохраняется возможность статистической оценки значимости исследуемых факторов в совокупном результате хемосорбционного процесса при условии, что модификация субстрата обеспечивает развитие той части внутреннего объема материала, который контролирует адсорбционное связывание белкового маркера.

Рисунок 3 ‒ Влияние длительности биообработки на белковосвязывающую способность модифицированных льняных угаров и костры

При анализе сорбции с помощью уравнения (1) описывалось сорбционное поведение льняного волокна с изначально развитой мезопоровой системой, и основные усилия были направлены на повышение активности полиуронидов. Описание расширенной группы объектов с использованием модели (5) выявило пути преодоления структурного несовершенства в структуре костры.

Зависимость (5) демонстрирует перспективность технологических шагов для повышения белковосвязывающей способности льняной костры, которые предусматривают необходимость очистки трахеальных каналов от фракции мигрирующих пектинов, препятствующих проникновению ферментов в макропоры ксилемы для модификации ее стенок и развития внутренней сорбирующей поверхности. Это проявляется в возрастании значимости множителя при переменной S мезо по сравнению с уравнением (1). Использование активных форм полиуронидных соединений в составе фракций «пектиновой пыли» и мигрирующих пектинов обусловливает снижение зависимости результата от обеспеченности системы хемосорбционными центрами, что проявляется в снижении величины причленного множителя при показателе CВП. Высокое значение коэффициента корреляции для уравнения (5) характеризует уровень точности статистического ожидания от изменившегося взаимного влияния факторов в достижении желаемого результата.

Вместе с тем следует отметить существенное снижение роли хемосорбционных взаимодействий по сравнению с модификацией ровницы чесаного льняного волокна. Очевидно, это связано с высоким содержанием в структуре пектиновых веществ галактуронатных звеньев в метоксилированной форме, которая не проявляет химической активности в процессах сорбции [15, 16]. Значимость хемосорбции в связывании белковых веществ можно дополнительно повысить, если биохимическую модификацию осуществлять в присутствии фермента пектинэстераза, который обеспечивает эффект биокатализируемого деметоксилирования пектина [17, С. 423].

В таблице сопоставлено изменение состояния пектиновых веществ в структуре льняных угаров и костры (до возврата в субстрат экстрагированных мигрирующих пектинов и пектиновой пыли) с данными сорбционной емкости в отношении белкового маркера. Оценка долевого соотношения галактуронатных звеньев в незамещенной (Н-ГК), метилгалактуронатной (СН3-ГК) и кальций-пектатной (Са-ГК) формах проведена методом ИК-спектроскопии пленок [18].

Представленные данные свидетельствуют, что наибольший эффект деметоксилирования (2‒2,3 раза) достигнут в фитопрепаратах на основе льняной вытряски, где доминирует волокнистый компонент с максимальным содержанием высокометоксилированных          полиуронидов.

Воздействию пектинэстеразы в структуре костры препятствует более высокая степень сшивки полигактуронатных цепей кальций-пектатными мостиками. Вместе с тем именно для костры зафиксирован наибольший прирост показателя АБ (1,4‒1,48 раза). Это отражает важность дополнительной активации пектина в структуре льняной костры для повышения вероятности встречи функциональных центров белка и пектина друг с другом и протекания акта химической адсорбции, которая осложнена стадией внутренней диффузии белкового маркера в поровой структуре биомодифицированного субстрата.

Исследования выполнены в рамках Государственного задания Института химии растворов им. Г. А. Крестова РАН (проект № 012012 60483) с использованием приборной базы ЦКП «Верхневолжский региональный центр физикохимических исследований».

Таблица – Влияние добавки пектинэстеразы на эффективность биомодификации льняных материалов (τ = 2 ч)

Субстрат	Соотношение форм галактуронатных звеньев в макромолекуле пектинов, ед.			Белковосвязывающая способность, Аб, мг/г
	Н-ГК	СН 3 -ГК	Са-ГК
Костра	0,24 / 0,43 0,26 / 0,44 0,21 / 0,45	0,44 / 0,34 0,43 / 0,36 0,45 / 0,34	0,32 / 0,33 0,31 / 0,30 0,34 / 0,33	50,6 / 72,1 46,6 / 68,4 53,9 / 75,6
Вытряска	0,27 / 0,55 0,26 / 0,52 0,27 / 0,54	0,54 / 0,33 0,55 / 0,26 0,55 / 0,27	0,19 / 0,19 0,19 / 0,19 0,18 / 0,18	61,2 / 75,6 60,9 / 75,2 59,3 / 73,4
Пакля	0,22 / 0,45	0,54 / 0,33	0,24 / 0,22	59,9 / 77,9

Примечание: в числителе условной дроби представлены показатели при использовании базовой композиции целлюлаз, в знаменателе – композиции целлюлаз с пектинэстеразой.

ВЫВОДЫ

• 1.    Выявлена специфика биохимического воздействия на отходы льнопереработки в форме костры, пакли и вытряски для развития внутренней удельной поверхности исследуемых льноматериалов и повышения доступности пектиновых веществ в структуре растительного субстрата для адсорбционных взаимодействий с модельными белковыми соединениями в совокупности с возможностью целенаправленного изменения химического состояния полиуронидов.

• 2.    Дифференцирован вклад физической и химической адсорбции в изменение белковосвязывающих свойств композиционных льносодержащих препаратов с целью оптимизации протеинового питания жвачных животных.

• 3.    Обоснован состав полиферментной композиции и продолжительность биохимической модификации отходов льнопереработки в виде костры, пакли или вытряски по патенту RU 2666769.