Методические подходы к выбору условий пробоотбора и оценке содержания хлорофилла в листьях растений кукурузы

Для определения концентрации хлорофилла используют хроматографические и фотометрические методы. Высокой чувствительностью характеризуются дифференциальная спектрофотометрия и производная спектрофотометрия, однако при проведении серийных анализов их применение ограничено [1]. Хроматографическое выделение данного пигмента было впервые проведено М.С. Цветом еще в 1903 году.

При проведении фотометрического определения содержания хлорофилла в листьях растений в качестве стандартного раствора для построения градуировочного графика применяют раствор Гетри, или раствор хлорофилла [2, 3]. Выбор длины волны, при которой проводится фотомет- рирование, позволяет отдельно определить содержание хлорофилла а и хлорофилла б, а также их суммарное содержание.

Для грубоколичественной визуальной оценки содержания хлорофилла в листьях в полевых условиях И.А. Тарчевским и Ю.Е. Андриановой разработан экспресс-метод, в основе которого лежит сопоставление цвета листьев с серией окрашенных растворов Гетри с известной концентрацией, имитирующих естественный диапазон содержания хлорофилла в листьях [2]. Однако данный метод имеет ограниченное применение, так как визуальное сопоставление окраски разных по природе сред затруднительно.

Для извлечения хлорофилла из листьев применяют как полярные, так и неполярные органические растворители. Наиболее часто используются этанол и ацетон как в чистом виде, так и в растворах, а также 80 %-й раствор ацетона модификации Вернона и 85 %-й раствор модификации Реббелена, так как небольшое количество воды необходимо для гидролиза хлорофилл-белкового комплекса, что способствует более полному извлечению хлорофилла при экстракции.

Цель исследований . Выбор оптимальных условий пробоотбора и количественной оценки содержания хлорофилла в листьях разновременно созревающих гибридов кукурузы.

Объекты и методы исследований . Исследования проводились в период вегетации в 2007– 2009 гг. на опытных участках и в лаборатории физико-химических методов анализа Института агроэкологии. Объектами исследований являлись растения гибридов кукурузы – ультраскороспелого Кубанский 101СВ и раннеспелого Кинбел 181СВ, посеянных в I, II, III декадах мая.

Методика и результаты исследований . Общее содержание хлорофилла определялось нами фотометрически методом градуировочного графика, построенного с использованием реактива Гетри. Для экстракции использовали 80 %-й раствор ацетона. В ходе исследований было выявлено, что варьирование концентрации ацетона не оказывает существенного влияния на полученные результаты.

Навеску листьев массой 0,1 г помещали в фарфоровую ступку, добавляли на кончике шпателя сухой карбонат кальция и растирали с 2–3 мл 80 %-го ацетона, затем добавляли 10 мл раствора ацетона и продолжали растирать в течение 5 мин. Полученную вытяжку фильтровали в мерную колбу на 25 мл. Экстракцию проводили повторно с порцией чистого растворителя, добиваясь полного обесцвечивания тканей листа. Объем вытяжки доводили до метки. Фотометрирование вытяжки проводили при 670 нм, раствор сравнения – чистый 80 %-й раствор ацетона, в кюветах длиной 1 см. Анализ проводили при комнатной температуре на рассеянном свету, не допуская попадания прямых солнечных лучей на вытяжку, так как фотоокисление хлорофилла приводит к искажению результатов анализа.

Для построения градуировочного графика определенный объем стандартного реактива Гет-ри, соответствующего содержанию 85 мг/л хлорофилла, помещали в мерную колбу на 25 мл и разбавляли до метки 7 %-м раствором аммиака. Фотометрирование проводили при 670 нм, раствор сравнения – дистиллированная вода, в кюветах длиной 1 см (табл. 1).

Зависимость оптической плотности от концентрации хлорофилла (реактива Гетри), l=1см, λ=670 нм

Таблица 1

V, мл	С, мг/25 мл	А
2,5	0,21	0,08
5,0	0,42	0,12
10,0	0,85	0,24
12,5	1,06	0,31
15,0	1,27	0,36
17,5	1,48	0,42
20,0	1,70	0,48
25,0	2,12	0,62

Параметры градуировочного графика (рис. 1) приведены в табл. 2.

Рис. 1. Градуировочный график для определения хлорофилла

Таблица 2

ρ	А	Sa	B	Sb
0,999	0,007	0,018	0,283	0,014

Параметры линейного градуировочного графика

При изучении динамики хлорофилла в листьях важно четко регламентировать условия про-боотбора. В 2007 году среднюю пробу отбирали из всех листьев растения, не учитывая погодные условия. Характер полученных зависимостей не позволил выявить динамику хлорофилла. Это связано, с одной стороны, с тем, что содержание хлорофилла существенно варьирует от времени суток, облачности и осадков. С другой стороны, для кукурузы характерна стадийная разнокачествен-ность листьев разных ярусов. У нее листья нижних ярусов находятся на более низком уровне стадийного развития растения в целом. Поглощение лучистой энергии этими листьями, как только оно стало постоянным, в дальнейшем не изменяется и сохраняется на несколько более низком уровне по сравнению с вышележащими листьями [4]. В связи с этим усреднение пробы листьев по ярусам не позволяет выявить динамику хлорофилла в течение вегетационного периода. Для выявления вклада листьев различных ярусов нами было изучено содержание хлорофилла в отдельных листьях гибридов кукурузы (табл. 3).

Таблица 3

Содержание хлорофилла в листьях разновременно созревающих гибридов кукурузы, %

Срок посева	Лист	Гиб		рид
		Кубанский 101СВ		Кинбел 181СВ
		I дек. мая	II дек мая	I дек. мая	II дек мая
Первая декада мая	Первый	0,43	0,35	0,39	0,35
	Второй	0,48	0,39	0,45	0,40
	Третий	0,54	0,45	0,47	0,45
	Четвертый	0,54	0,46	0,50	0,47
	Пятый	0,55	0,46	0,49	0,44
	Шестой	0,53	0,41	0,46	0,38
	Седьмой	0,50	-	0,42	-

Для выявления наиболее рационального и ценного с практической точки зрения подхода к оценке концентрации хлорофилла мы определяли содержание данного показателя на сырую массу (1), в листовой поверхности (2) и в сухой массе (3):

Cхл (%) =  -  ;(1)

• 10 mb

Схл(мг/дм2) = Ц0- ;(2)

Sb

100 -

C _(мг / г) =------------- , хл         mb (100 - V)

где A – оптическая плотность фотометрируемого раствора; b – тангенс угла наклона градуировочного графика; m – масса навески, г; S – площадь высечки листа, взятой для анализа, см²; V – влажность, %.

Содержание хлорофилла на единицу листовой поверхности позволяет оценить его как показатель фотосинтетической активности ассимилирующей листовой поверхности посева в целом и его вклад в общей структуре химических соединений, формирующей лист (рис. 2).

—♦-Кубанский 101СВ, 5 мая

—с—Кубанский 101СВ, 15 мая

* Кннбеп 181СВ, 5 мая

--л--Кннбеп 181СВ, 15 мая

Рис. 2. Динамика содержания хлорофилла в листьях гибридов кукурузы в связи со сроками посева, 2008 г.

Процентное содержание хлорофилла в сырой массе растения наиболее интересно, на наш взгляд, при оценке процесса фотосинтеза как важнейшего физиологического процесса живого растения.

Заключение . Таким образом, целесообразность применения того или иного способа выражения концентрации хлорофилла определяется целью конкретных исследований. При изучении динамики содержания пигмента в течение вегетационного периода для получения воспроизводимых результатов анализа необходимо жестко фиксировать условия пробоотбора и пробоподготовки.