МЕТОДИКА ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ГЕНОМНОЙ СБОРКИ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ЧАСТОТНОСТИ K-МЕРОВ В СЕКВЕНАТОРЕ ПАРАЛЛЕЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ

K -мер — это просто последовательность из k символов в строке (или нуклеотидов в последовательности ДНК в задаче секвенирования). Разложение последовательности на ее k -меры позволяет анализировать этот набор фрагментов фиксированного размера, а не последовательность целиком, и это может быть более эффективным подходом. Простой пример: чтобы проверить, происходит ли последовательность S из организма A или из организма B, предполагая, что геномы A и B известны и достаточно разные, мы можем проверить, содержит ли S больше k -меров, присутствующих в A или в B.

Практически любой геном содержит повторяющиеся области, однако, начиная с определенного значения k , k -меры определенным образом однозначно идентифицируют его; если мы посчитаем количество появлений k -мер для достаточно большого k (ограниченного сверху длиной чтения), оказывается, что большинство из них находятся в геноме в единственном экземпляре. Например, если порядок длины генома сравним с человеческим, вероятность встретить случайную подстроку длины 14 хотя бы один раз составляет 0.975893 [1]. Для k = 20 эта же вероятность составляет 0.000909.

Подсчет встречаемости различных k-меров часто возникает в задачах сборки генома. Распределение частот встречаемости используется для процедуры корректирования ридов, что подразумевает разделение содержащихся k-меров на "доверенные" и "ошибочные" [1]. Подобная информация генома используется некоторыми программами сборки генома для определения того, является ли рассматриваемый участок повтором или нет.

В настоящее время в связи с развитием приборостроения для проведения генетического анализа существует острая необходимость в разработке методик оценки качества геномной сборки. Такие методики позволят оценить достоверность проведения генетического анализа в существующих и вновь разрабатываемых приборах. В данной работе на основе анализа различных программных средств выбраны программы, которые позволяют оценить качество геномной сборки в секвенаторах параллельного секвенирования. С помощью выбранных программ обработаны данные, полученные на отечественном секвенаторе параллельного секвенирования Нанофор СПС.

АНАЛИЗ ПРОГРАММНЫХ СРЕДСТВ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА СБОРКИ ГЕНОМА

Поскольку количество k -мер растет экспоненциально для значений k , подсчет k -мер для больших значений k является вычислительно сложной задачей. Хотя достаточно простые реализации работают для малых значений k , их необходимо адаптировать для приложений с высокой пропускной способностью или когда k велико. Для решения этой проблемы были разработаны различные инструменты:

• •    Jellyfish использует многопоточную хеш-таблицу без блокировок для подсчета k -мер и имеет реализации на Python, Ruby и Perl [2];

• •    KMC — это инструмент для подсчета k -мер, который использует многодисковую архитектуру для оптимизации скорости [3];

• •    Gerbil использует подход хеш-таблицы, но с дополнительной поддержкой ускорения графического процессора [4];

• •    K-mer Analysis Toolkit (KAT) использует модифицированную версию Jellyfish для анализа количества k -мер [5].

В качестве основного инструмента работы с k -мерами был выбран KAT (K-mer Analysis Tookit), представляющий эффективный набор средств для быстрого подсчета, сравнения и анализа спектров k -мер произвольной длины из данных генетических последовательностей.

Основным методом анализа при работе с k -мерами является проверка качества сборки генома путем сравнения характеристик k -меров совокупности анализируемых р и дов с референтным образцом или с собранным геномом (при сборке de novo ). Инструмент KAT hist — это графическое представление набора данных, показывающее, сколько коротких последовательностей фиксированной длины ( k -мер) появляется определенное количество раз. Частота встречаемости нанесена на ось х , а число k -меров на оси у . Пример 31-mer spectrum of S.cerevisae S288C WGS приведен на рис. 1.

Инструмент KAT comp генерирует матрицу с k-мерным набором последовательностей частот k-меров на одной оси, а частотой встречаемости k-меров другого набора на другой оси. При сравнении набора ридов со сборкой KAT сначала вычисляет свойства и состав k-меров сборки. При представлении в виде стоковых гистограмм спектр к-меров для ридов разбивается по числу копий к-меров для сборки. Кроме того, KAT предоставляет инструмент sect для отслеживания покрытия k-мерами, исходя из рассчитанных спектров k-меров для совокупности ридов и референса. Это может помочь идентифицировать такие артефакты сборки, как события сворачивания и разворачивания, или обнаруживать повторяющиеся области в последовательности ДНК.

KAT также включает инструмент hist для вычисления спектра из одного набора последовательностей и инструмент gcp для анализа гуанин-цитозин содержания (GC-контента) в зависимости от частоты k -меров. Инструмент filter можно использовать для выделения последовательностей из полного набора в соответствии либо с покрытием k -мерами или GC-содержанием для заданного набора. Эти инструменты могут использоваться для различных задач, включая обнаружение и извлечение загрязняющих веществ (contaminant detection) как в необработанных р и дах, так и в сборках (assemblies), анализ смещения по GC-составу и согласованность между парноконцевыми (paired end) р и дами с чувствительностью по концентрациям примесей от 0.1 ppm.

1 000 000

900 000 ■

800 000 ■

700 000 -. * •

600 000 ■                           •'

Е• g 500 000

400 000 •

300 000 ■,

200 000-• юоооо ■        ,•

01-------------1-------------1-------------1-------------1f-

0        5       10      15      2025

30      35      40      45      50      55      60

Freq

Рис. 1. Графическое представление набора данных KAT hist

KAT прост в использовании, обеспечивает высокую скорость анализа. Время получения результатов анализа составляет не более минуты.

МЕТОДИКИ РАБОТЫ С K -МЕРАМИ

В работе [1] предложен метод оценки качества геномной сборки, заключающийся в установлении соответствия между уникальными k -мерами в собранном геноме и к -мерами в р и дах. Процедура выглядит следующим образом.

• 1.    Построение гистограммы встречаемости k -меров для р и дов.

• 2.    Выбор окрестности пика уникальных k -меров на гистограмме встречаемости.

• 3.    Построение гистограммы встречаемости k -меров для каждой сборки.

• 4.    Расчет меры Q как доли различных k -меров, взятых из окрестности пика на гистограмме встречаемости k -меров в чтениях.

• 5.    Выбор сборки с максимальным значением Q в качестве наилучшей.

В работе [6] предложен метод исправления ошибок, оптимизированный для работы с чтениями, содержащими как ошибки замены, так и ошибки вставки и удаления. Поскольку ошибки происходят с небольшой частотой, вероятность того, что один и тот же k -мер будет прочитан несколько раз с одинаковым набором ошибок, очень мала. Из этого вытекает, что те k -меры, которые встречаются в наборе чтений мало раз, являются ошибочными, остальные же являются реальными подстроками генома (рис. 2).

Рис. 2. Распределение частот к -меров в р и дах [6]

Рис. 3. Типичный k -mer comparison plot секвенирования Phix 174 на Illumina Miseq

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРОГРАММЫ KAT ДЛЯ ОБРАБОТКИ ДАННЫХ

СЕКВЕНАТОРА НАНОФОР СПС

Для обработки данных секвенатора Нанофор СПС была использована опция программы КАТ "K-mer comparison plot". По сути мы представляем, сколько элементов каждой частоты в спектре ридов оказались не включены в референтный ге- ном (в нашем случае Phix174), включены один раз, включены дважды и т.д.

На рис. 3, 4 представлены k-mer comparison plot, полученные соответственно для приборов Illumina и Нанофор СПС. Показательно, что для сходных характеристик проточных ячеек запуск Нанофор СПС обеспечивает больший уровень покрытия р и дами референсной последовательности (центр тяжести k -меров с уникальным покрытием).

Рис. 4. Типичный k -mer comparison plot секвенирования Phix 174 на Нанофор СПС

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проекты сборки генома обходятся дорого как по времени, так и по вложенным средствам. В этом случае выявление проблем с экспериментальными данными, обаруженных уже после сборки, может стать настоящей неудачей. С помощью K-mer Analysis Toolkit (KAT) исследователи могут получить доступ к качественным критериям и подтвердить свои результаты на более ранних этапах.

K -меры представляют собой небольшие фрагменты исходного генома с фиксированным числом оснований ДНК. Компьютер может эффективно работать с большим количеством k -меров, а затем идентифицировать связи между этими фрагментами, чтобы создать представление об исходном геноме. Основанные на k -мерах методы обычно используются для эффективного создания геномных сборок. KAT построен для изучения и сравнения наборов данных секвенирования с использованием основных свойств каждого отдельного k -мера, таких как частота встречаемости и нуклеотидный состав.

В первую очередь KAT может анализировать данные секвенирования для определения уровней случайных ошибок, систематических ошибок и контаминации. Информация, полученная в ходе этого анализа, может помочь исследователям решить, следует ли продолжать выполнение последующих задач, таких как сборка генома. Затем KAT может перепроверить проведенную сборку генома, определив полноту и точность сборки без каких-либо внешних справочных данных.