Методика определения разброса температур по лункам анализаторов нуклеиновых кислот

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты в пробе. Метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) позволяет провести качественный и количественный анализ пробы. Дополнительная информация может быть получена после проведения ПЦР за счет применения метода плавления ДНК, который основан на зависимости температуры плавления ДНК от состава и длины фрагмента [1, 2]. Описанные методы выполняются на анализаторах нуклеиновых кислот [3]. Основными тепловыми параметрами анализаторов являются: погрешность установки среднего значения температуры в лунках с пробирками и разброс температур по лункам. Для измерения этих параметров существуют различные контактные и бесконтактные методы.

Наиболее часто используемыми тепло-преобразователями при измерениях контактным методом являются термометры сопротивления и термоэлектрические преобразователи (термопары) [4].

Технические характеристики средств контактного измерения регламентируются стандартами ГОСТ 6651-78 для термометров сопротивления и ГОСТ 3044-77 для термопар.

Контактный метод обладает существенными недостатками. Метод обладает инертностью, вызванной массивностью датчика. В случае если масса датчика сравнима с массой измеряемого объекта, измерения в принципе становятся неинформативными. Также не всегда можно обеспечить контакт датчика с измеряемой средой, особенно в закрытых реакторах. Для решения задачи измерения температурного поля объекта необходимо большое количество датчиков.

Упомянутых недостатков лишены бесконтактные методы измерения. Существуют методы, основанные на измерении теплового излучения исследуемого объекта с помощью пирометров, тепловизоров и инфракрасных матричных камер [5, 6]. Эти методы неприменимы в условиях отсутствия визуального доступа, а также для определения температуры прозрачных тел.

Известны такие методы, как магниторезонансная (ЯМР) термометрия, СВЧ-радиотермометрия и акустотермометрия [7]. Эти методы имеют значения погрешностей ±0.2, ±0.2 и ±0.3 °C соответственно, но реализуются на дорогостоящих и громоздких приборах и применяются в основном для решения задач, в которых важно определить внутреннюю температуру объекта, а также пространственное распределение температур в объекте.

Также известны бесконтактные методы измерения температуры, основанные на применении флуоресцентных зондов, например флуоресцентных красителей родамина В (RhB)

или родамина 110 (Rh110) [8]. Эти методы позволяют определять температуру по зависимости уровня флуоресценции от температуры красителя и соответственно измеряемой среды. Погрешность измерений у этих методов составляет порядка ±1.25 °C. Существует метод на основе индодикарбоцианинового флуоресцентного красителя Су5, в котором погрешность измерения температуры на точку составила ±0.33 °C [9, 10]. Известны методы измерения температуры по флуоресцентному красителю сульфородамин-101 (SR101) в 2 диапазонах длин волны [11]. Такой метод позволяет добиться погрешности ±0.78–0.93 °C. При использовании метода измерения температуры по 2 флуоресцентным красителям RhB и SR101 достигается погрешность измерения ±0.48–0.59 °C [11].

Недостатком бесконтактных методов, основанных на применении этих флуоресцентных зондов, является отсутствие абсолютной шкалы температур, относительно низкая температурная зависимость (не более 2.3 % К–1), а также нежелательная зависимость от условий проведения эксперимента для каждой пробирки. Поэтому такие методы применимы предпочтительно для оценки скорости переходных тепловых процессов, а не для определения разброса температур по лункам анализатора нуклеиновых кислот.

Ранее была разработана методика для определения разброса температур по лункам на основе линейной аппроксимации сигналов флуоресценции с применением флуоресцентных зондов, входящих в состав реакционной смеси РС "АМТЕтест" (FAM-ROX) производства ЗАО "Синтол" (г. Москва) [12, Раздел 10: Методика поверки ]. Для флуоресцентного красителя ROX использовался шаблон с регистрацией сигналов флуоресценции при температурах 30, 79.5, 80.5, 81.5 и 85 °С, выдержка на каждой температуре до 160 с. Усредненные сигналы на температурах 30 и 85 °С использовались при нормировании сигналов флуоресценции соответственно по фону и по максимуму. Усредненные сигналы при температурах 79.5, 80.5 и 81.5 °С использовались для определения величины изменения сигналов флуоресценции при изменении температуры на 1 °С и последующего определения разброса температур по лункам. Преимуществом этой методики можно считать высокую температурную зависимость (порядка 15 % К^–1) и сравнительно небоьшое время регистрации сигналов (порядка 15 мин).

Недостатком этой методики можно считать отсутствие шкалы абсолютной температуры лунок.

В статье приведена усовершенствованная методика определения разброса температур по лункам на основе аппроксимации сигмоидальной функцией сигналов плавления ДНК. Преимуществом предлагаемой методики является определение абсолютной температуры в каждой лунке анализатора нуклеиновых кислот при сохранении высокой температурной зависимости.

РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗБРОСА ТЕМПЕРАТУР ПО ЛУНКАМ НА ОСНОВЕ АППРОКСИМАЦИИ

СИГМОИДАЛЬНОЙ ФУНКЦИЕЙ СИГНАЛОВ ПЛАВЛЕНИЯ ДНК

В настоящее время в ИАП РАН разработан экспериментальный образец анализатора АНК-96 (96 образцов). Для анализатора АНК-96 требуется обеспечить погрешность установки среднего значения температуры в лунках с пробирками и разброс температур по лункам соответственно ±0.5 и ±0.2 °С. Аналогичные параметры имеет лучшие иностранные анализаторы, например 7500 Fast Real-Time PCR System, StepOne Plus фирмы "Life Technologies" [13] и др.

Предлагается использовать температуру плавления ДНК T m при использовании одинаковых образцов в качестве критерия оценки разброса температур по лункам.

Ранее в статье [14] была предложена методика определения величины температуры плавления ДНК T m , основанная на усовершенствованной модели сигналов кривой плавления ДНК и способа аппроксимации ее с помощью сигмоидальной функции, выраженной в виде формулы:

+ f 2 · T ²,                                               (1)

где F с — относительная величина интенсивности флуоресценции при температуре образца T (°C); F m — относительная интенсивность (размах) участка плавления; T m.calc — дробное значение температуры плавления (°C); k — коэффициент, который определяется наклоном кривой; слагаемые f 0 + f 1 · T + f 2 · T ² учитывают смещение, а также линейную и квадратичную зависимости нулевой линии от температуры.

Одним из вариантов устранения этого недостатка является определение температуры

Температура пробирок, °C

Рис. 1. Кривая плавления реакционной смеси.

1 — ступенчатая кривая (измеренные данные); 2 — аппроксимирующая СФ с оптимизированными параметрами (гладкая кривая)

Табл. 1. Оптимизация параметров СФ	Табл. 2. Оптимизированные параметры СФ
T , °C       F       F с       D =     D 2     S = СУММА N                             = F с – F 1     75       517     521.93     4.93     24.36      4466.15 2     76      546     541.01    –4.98    24.87        —	Значения Параметры СФ     СФ T m          80.92 F m         818.92 k          –1.72
11     85      1234    1244.48    10.48    110.01       —	f 0           1315.11

плавления T m по значению максимума производной F с по температуре. При этом значение T m будет однозначно совпадать с точкой перегиба графика функции F с . Данный вариант требует дополнительных вычислений и является более трудоемким.

В предлагаемой методике исключены коэффициенты f 1 и f 2 из формулы (2). При этом упрощенная функция F u будет с достаточной степенью точности описывать исходные данные при условии уменьшения диапазона значений температур, что положительно скажется на времени проведения анализа. При этом полученное значение T m будет соответствовать точке перегиба СФ.

Усовершенствованная модель кривой плавления на базе упрощенной нелинейной сигмоидальной функции примет вид:

F u = F m / (1 + exp (( T m – T ) / k )) + f 0 . (2)

Исходные (сырые) данные кривой плавления ДНК от 8 пробирок были получены путем регистрации сигналов флуоресценции красителя ROX реакционной смеси РС "АМТЕтест" (FAM-ROX) при ступенчатом изменении температуры в диапазоне 75–85 °С с шагом 1 °С и с выдержкой на каждой ступени 30 с. Время регистрации сигналов — порядка 10 мин.

График исходных данных кривой плавления реакционной смеси одной из пробирок в качестве образца приведен на рис. 1 (кривая 1).

Оптимизированные параметры СФ определяются с помощью электронной таблицы Excel. В первом столбце табл. 1 приведены номера

Рис. 2. Графики Tm для 8 пробирок в одном ряду теплового блока отсчетов N во времени, во втором столбце — значения температуры Т (от 75 до 85 °C). В третьем и четвертом столбцах приведены относительные значения интенсивности флуоресценции F пробы и значения интенсивности флуоресценции Fс модели СФ. В следующих столбцах табл. 1 приведены разность D = Fс – F, квадрат разности D2 и сумма квадратов разности S.

Нахождение параметров СФ выполняется в программе Excel средством анализа Поиск решения из меню Данные , при этом достигается минимальное значение величины S путем изменения параметров СФ. График сигмоидальной функции первой пробирки в качестве образца приведен на рис. 1 (кривая 2). Параметры СФ для этой пробирки приведены в табл. 2, при этом температура плавления T m1 = 80.92 °C.

Основными результатами применения СФ являются определенные величины температуры плавления T m . Графики, отражающие величины T m для 8 пробирок в одном ряду теплового блока, приведены на рис. 2.

Температура плавления ДНК всех пробирок и их среднее значение соответствуют абсолютной шкале температуры в °С. Разброс температур — не более ±0.2 °С. Среднее значение температур плавления ДНК 16 пробирок равно T mс = 80.82 °С.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что полученные температуры плавления ДНК в пробирках могут быть использованы при настройке, калибровке и проверке тепловых параметров анализаторов нуклеиновых кислот при их серийном выпуске.

Разброс температур соседних лунок во многом зависит от случайных погрешностей при измерении сигналов флуоресценции. Поэтому в качестве критерия для оценки разброса температур по лункам предлагается принять более достоверные результаты усреднения в пределах 6 групп по 16 пробирок (4 × 4).

Максимальное отклонение температуры по 6 группам от среднего значения составляет 0.15 °С и не превосходит предельно допустимых значений ±0.2 °С.

Особенностью анализатора АНК-96 является использование в тепловом блоке 6 элементов Пельтье, при этом каждый элемент имеет отдельный канал управления. Предварительная настройка была выполнена путем использования цифрового датчика температуры. Полученные результаты были использованы на завершающем этапе настройки анализатора АНК-96 и других анализаторов нуклеиновых кислот.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предложена усовершенствованная методика определения разброса температур на основе метода плавления ДНК . При этом использован способ аппроксимации кривой плавления ДНК с помощью сигмоидальной функции. Показано, что температуры плавления ДНК во всех пробирках и их среднее значение соответствуют абсолютной шкале температуры в °С Полученные результаты (разброс температур не более ±0.2 °С, среднее значение температур плавления ДНК во всех пробирках, равное T mс = 80.82 °С) можно принять в качестве контрольных параметров при настройке, калибровке и проверке тепловых параметров анализаторов нуклеиновых кислот.

Разброс температур соседних лунок во многом зависит от случайных погрешностей при измерении сигналов флуоресценции, поэтому в качестве критерия для оценки разброса температур по лункам предлагается принять более достоверные результаты усреднения в пределах 6 групп по 16 пробирок каждая (4 × 4). Максимальное отклонение температуры по 6 группам от среднего значения составляет 0.15 °С и не превосходит предельно допустимых значений ±0.2 °С.

Полученные результаты использовались для настройки анализаторов нуклеиновых кислот.