Методы создания моделей рака мочевого пузыря и их применение в доклинических исследованиях (обзор литературы)

Рак мочевого пузыря (РМП) является одной из самых распространенных злокачественных опухолей, характеризуется высокими темпами ежегодного роста заболеваемости и занимает одно из ведущих мест в структуре онкологической смертности в развитых странах [1, 2]. В России РМП занимает 8-е место в структуре онкологической патологии у мужчин и 18-е место – у женщин. При этом на РМП I–II стадии приходится 57,4 % пациентов с первичным диагнозом, на II–III – 26,8 %, на IV – 11,4 % [3]. В структуре преобладают пациенты старше 60 лет, в России они составляют 78,4 %. Средний возраст пациентов в России составляет 65,7 года для мужчин и 69,2 – для женщин. Увеличение частоты встречаемости РМП связано в первую очередь со сложной диагностикой заболевания на начальных стадиях, обусловленной бессимптомным течением, или сходством клиники и симптомов с другими заболеваниями мочеполовых органов. Существует множество этиологических факторов, приводящих к РМП. Большинство случаев РМП связывают с влиянием выделяемых с мочой канцерогенных веществ на уротелий [4].

Значительную роль в улучшении методов лечения РМП играют доклинические исследования in vivo. В настоящее время разработано большое количество животных моделей, отражающих различные типы и стадии заболевания. В обзоре представлен анализ зарубежной и отечественной литературы, посвященный созданию и применению моделей in vivo в области экспериментальной онкологии [5]. Поиск статей был выполнен в базе данных PubMed, GoogleScholar, CyberLeninka с использованием следующих поисковых запросов: xenograft, bladder cancer, orthopic model, heterotopic model.

На сегодняшний день наиболее часто для моделирования опухолевого роста применяют ксенографты опухолей человека на мышах, т. к. они позволяют воспроизвести основные патофизиологические особенности биологии многих злокачественных новообразований. Для получения этих моделей обычно используют иммунодефицитных животных линий SCID, NOD-SCID,NOG,NSG, Balb/cNude, т. к. вследствие их иммунодефицитного статуса не происходит отторжения чужеродного биологического материала [6, 7]. В многочисленных работах по созданию и использованию ксеногенных опухолевых моделей продемонстрированы примеры применения как гетеротопического (подкожного) варианта трансплантации опухолевого материала, так и ортотопического (гистологически соответствующая зона животного) [8, 9].

Большое значение имеет опухолевый потенциал клеточной линии. Необходимо иметь в виду, что не все линии опухолевых клеток, доступных на коммерческой основе, являются туморогенными. Известно, что клетки линии UM-UC3, TCCSUP имеют высокую степень приживаемости при ортотопической имплантации. KU7, KU-19, T24, UM-UC1, UM-UC3, UM-UC13 линии переходно-клеточных карцином могут быть привиты трансуретрально. Отличия клеточных линий обусловлены различным набором генетических свойств. Например, клеточная линия UM-UC-6 получена путем трансуретральной резекции и способна продуцировать опухоли преимущественно у мышей Balb/cNude. Конкретные характеристики клеточных линий представлены на коммерческих сайтах. Для получения опухолей мочевого пузыря часто используются клеточные линии MB49, MBT-2, BTT-T739 [10].

Ортотопические модели

Большинство мышиных ортотопических моделей могут быть получены тремя способами: индуцирование химическими канцерогенами, имплантация человеческих клеток РМП, имплантация мышиных клеток РМП (сингенные модели) [11]. В настоящее время достаточно широко используются ортотопические ксенографты, для которых необходимо использовать иммунодефицитных мышей во избежание иммунных реакций, предпочтительнее использовать мышей SCID, NOD-SCID [12]. Мыши хорошо подходят для создания ортотопическоих ксенотрансплантантов РМП, т.к. структура и функция их мочевыделительной системы схожи с человеком. Для облегчения катетеризации мочевого пузыря в исследованиях следует использовать самок мышей [13]. Для надежности и воспроизводимости модели животного необходима высокая скорость приживления опухолевых клеток. Мыши SCID-beige наиболее восприимчивы к приживлению опухоли ввиду отсутствия Т-, В-клеток, а также нарушения активности NK-клеток.

Несмотря на то, что ортотопические модели обеспечивают нормальное микроокружение опухоли, они сильно ограничены из-за технических трудностей. Процедура создания ортотопического ксенографта занимает относительно много времени, а размер опухоли сильно ограничен из-за небольшой емкости мочевого пузыря мышей [13]. Недостатком данной модели также является невозможность оценки иммунного ответа на интравези-кулярную терапию ввиду отсутствия характерного микроокружения опухоли [14].

Уротелиальные опухолевые клетки могут быть привиты трансуретрально с помощью 22G или 24G уретрального катетера. Повышение количества опухолевых клеток в образце означает увеличение продолжительности контакта опухолевых клеток со слизистой оболочкой мочевого пузыря, что способствует лучшему приживлению опухоли [15, 16]. Поверхность слизистой оболочки мочевого пузыря покрыта слоем гликозаминогликана, который действует как защитный барьер к имплантации опухоли. Следовательно, для того чтобы успешно привить опухоль, этот барьер необходимо убрать: возможно механическое нарушение слизистой оболочки путем предварительного выскабливания уротелия стилетом [17]. Слизистая оболочка мочевого пузыря может быть также удалена путем прижигания [18]. В других литературных источниках сообщается о внутрипузырном введении 0,1 мл 0,2 % трипсина в течение 30 мин и незамедлительной травматизации слизистой оболочки с последующим прививанием опухоли [19]. Во время катетеризации мочевых пузырей зачастую возможно образование воздушного пузыря за счет воздуха, содержащегося в катетере. Чтобы проанализировать, влияет ли это на возникновение опухоли, был опробован альтернативный метод инстилляции, при котором сам катетер заполняется суспензией опухолевых клеток до катетеризации мочевого пузыря. Это предотвращает образование воздушного пузыря. Однако сравнение обоих методов инстилляции не выявило различий в формировании опухоли у мышей линии SCID-beige [20].

Гетеротопические модели

Гетеротопические модели включают в себя имплантацию и рост опухоли в месте, отличном от исходного органа, преимущественно подкожной локализации. При этом гетеротопические ксенографты обладают рядом преимуществ. При подкожной имплантации, когда опухоль прививают в подкожно-жировую клетчатку иммунодефицитных мышей, рост опухолей можно легко оценить визуально, при помощи пальпации или замеров. В литературе описаны и другие локализации гетеротопических ксенографтов РМП. Например, опухолевые клетки РМП могут прививаться под почечную капсулу мышей SCID путем открытого хирургического вмешательства, такая методика позволяет получить более высокую приживаемость ввиду обильного кровоснабжения анатомической области. Из-за наличия жировой ткани стромы опухоли, поддерживающей ее рост, данный способ обеспечивает имитацию оригинального микроокружения [21–23]. Клетки можно имплантировать в бок или заднюю ногу иммунодефицитной мыши, есть данные о прививании клеток через хвостовую вену и левый желудочек сердца, последние чаще используются для оценки процесса метастазирования. Подкожные ксенографты создать, несомненно, проще, чем ортотопические модели. Эту модель часто используют при оценке терапевтических средств. Она может применяться для изучения местного рецидива после иссечения. Гетеротопические ксенографты имеют существенный недостаток – они не воспроизводят реальное микроокружение опухоли и не метастазируют [24, 25].

Модели PDX

Новым инструментом в решении проблем гетерогенности опухолей стали модели, полученные путем имплантации опухолевого материала от пациента иммунодефицитным мышам – PDX (Patient-derived xenograft). PDX способны отражать биологические характеристики опухолей более точно, чем линии опухолевых клеток: линии опухолевых клеток могут не иметь сходств с исходной опухолью и не могут точно имитировать клиническую ситуацию [26]. Кроме того, культура клеток лишена стромальных и эндотелиальных элементов. Таким образом, чтобы справиться с микроокружением, эти опухолевые клетки претерпевают генетические и эпигенетические изменения, в результате которых фенотип отличается от исходной опухоли [27]. Модели PDX были разработаны достаточно давно, однако их характеристика была ограничена фенотипическими анализами, такими как гистологическое исследование с окраской гематоксилин-эозином или иммуноцитохимический метод, без детального молекулярного анализа. Для изучения молекулярных изменений в ксенотрансплантатах необходимо проводить дальнейшие генетические исследования. В литературе встречаются данные о шести моделях ксенотрансплантата РМП с гетерогенными клинико-патологическими осо- бенностями. Четыре из шести моделей имеют мутацию HRAS, CTNNB1, BRAF, TP5, причем ни одна из них не имеет мутации в других генах. Было доказано, что ранний перенос PDX-моделей ксенотрансплантата обеспечивает практически полное сходство со стороны гистологии, мутационного статуса и геномных изменений [27]. Исходя из этого, модели PDX являются актуальными для изучения противоопухолевого ответа. Существуют и недостатки использования PDX-моделей. Необходимо иметь в виду, что несмотря на фенотипические и генотипические сходства с первичными опухолями, не доказано, схожи ли они в «клинических» аспектах, например, обладают ли они лекарственной или радиационной резистентностью [28].

Индуцированные модели

Согласно литературным данным, существует прямая связь между количеством выкуриваемых сигарет и возникновением РМП. Поэтому крайне важно изучить взаимосвязь между химическим канцерогенезом и РМП. Первая модель индуцированного уротелиального рака была получена у крыс, после чего было открыто несколько канцерогенов у различных видов, включая мышей и собак [29–30]. Основными химическими канцерогенами являются 4-гидроксибутил-нитрозамин (BNN) N-(4,5-нитро-2-фурил)формамид) (FANFT) и метил-нитрозомочевина (MNU). Большинство из них содержат ароматические аминные компоненты. BNN вводят либо перорально, добавляя его в питьевую воду, при этом происходит его дальнейшая деградация до N-бутил-нитрозамина, либо внутривенно.BNN-индуцированные модели рака имеют мутации p53, высокий уровень EGFR [33]. Однако создание опухолевых моделей, индуцированных BNN, – процесс длительный и занимает от 5 до 8 мес. MNU – канцероген, который действует непосредственно на уротелий после внутрипузыр-ной инстилляции, что приводит к метилированию ДНК [34]. Основное преимущество этой модели заключается в том, что карцинома развивается уже спустя 12 нед. Однако MNU крайне неустойчив во внешней среде и поэтому должен храниться при низких температурах и отсутствии света [35]. FANFT – химический канцероген, который стимулирует слизистую оболочку мочевого пузыря и в основном способствует развитию переходноклеточного рака [36].

Трансгенные модели

Особым типом сингенных моделей являются трансгенные мыши, геном которых модифицируется с целью изучения важности конкретного гена в развитии и прогрессировании рака. Активация онкогенов, таких как Ha-ras, или изменения в генах-супрессорах RB1, p53 в уротелии считаются пусковыми в развитии уротелиальных опухолей.

В литературе встречается информация о том, что трансгенные мыши с дефицитом pRB, p53 очень чувствительны к возникновению РМП, у них обнаружена инвазивная карцинома, гистологически схожая с РМП человека [37, 38]. Однако генноинженерные модели имеют ряд ограничений. Во-первых, опухоли, развивающиеся в этих моделях, менее гетерогенны, чем опухоли мочевого пузыря человека. Во-вторых, трансгенные модели могут недостоверно отображать процессы, происходящие при РМП у человека [37]. У мышей с делецией зародышевой линии часто невозможно исследовать функцию гена – нокаут приводит к преждевременной или перинатальной смерти. Вследствие этого не получится четко разграничить тканеспецифический и клеточный вклад данного гена в развитие заболевания. Подход, который позволит избежать данного ограничения, включает в себя The Cre-loxPсистему, содержащую бактериофаг Р1 и позволяющую изучать функцию генов в конкретных клеточных и тканевых типах [39]. Уротелий-специфическая система The Cre-loxP доступна и выборочно используется для достижения нокдауна генов в эпителии мочевого пузыря [27].

Возможности применения ксенографтов

Ортотопические ксенографты могут быть использованы для изучения новых терапевтических стратегий борьбы с РМП. Так, например, в исследованиях по изучению ингибирующего влияния экзогенной miR-145 на рост опухолей мочевого пузыря in vivo использовали мышиную модель с ортотопически привитыми опухолевыми клетками. Препарат miR-145 значительно ингибировал рост ортотопических ксенотрансплантантов РМП. Как известно, miR-145 выступает в качестве супрессора опухолевого роста [20]. Для подтверждения подавления роста ксенотрансплантированной опухоли путем внутрипузырного введения были исследованы уровень экспрессии miR-145 методом qRT-ПЦР, а уровни экспрессии возможных мишеней miR-145 генов методом вестерн-блоттинга. Ожидаемо, что уровень экспрессии miR-145 был достоверно повышен в ксенотрансплантированных тканях по сравнению с контрольной группой. Анализ вестерн-блоттингом показал, что уровни белка miR-145 таргетных генов, таких как c-Myc, socs7, FSCN1, E-кадгерин и β-Катенин, были значительно снижены. Интересно, что уровни c-Myc, socs7 были снижены в большей степени по сравнению с результатами экспериментов in vitro . Эти данные позволяют предположить, что внутрипузырное введение miR-145 эффективно проявило свой противоопухолевый эффект в ксенотрансплантированной опухоли. Согласно некоторым исследованиям также следует отметить, что оптимальным сроком начала терапевтичекого воздействия у животных-опухоленосителей может считаться интервал до 7 дней после процедуры инстилляции опухолевых клеток [40].

Согласно литературным данным, РМП метастазирует преимущественно лимфогенно: в обтураторные лимфатические узлы; гематогенные метастазы чаще всего возникают в печени. Несмотря на свою актуальность, на сегодняшний день существует очень мало доклинических моделей, доступных для изучения спонтанного метастазирования РМП. В литературе описывается роль эпителиально-мезенхимального перехода в прогрессировании и метастазировании РМП. Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) – обратимый клеточный процесс, происходящий в эпителиальных тканях, при котором гомотип-ная адгезия и клеточная полярность временно теряются, поскольку клетки приобретают мезенхимальные свойства, становятся инвазивными и мигрирующими [41]. Для изучения этого явления были созданы новые модели ксенотранспанта-тов, полученные из линий клеток рака мочевого пузыря человека с использованием ортотопического метода «рециркуляции». В исследовании использовались мыши Balb/cNude, SCID-beige. Для инстилляции опухолевых клеток были отобраны самки 14 нед, мочевой пузырь которых катетеризировали с помощью 24G катетера. Метод «ортотопической рециркуляции» заключается в том, что опухолевые клетки имплантируются в их нативное микроокружение, способствуя переходу к более «эпителиальному» фенотипу и усилению роста первичной опухоли. Метастазы затем повторно имплантируют в ортотопический участок для обогащения спонтанного метастатического фенотипа. Этот процесс повторяется до тех пор, пока практически у всех мышей не развиваются метастазы после короткого латентного периода. На 20-й день после инстилляции опухолевых клеток МРТ-изображения демонстрируют пристеночные образования, выступающие в полость мочевого