Методы выделения полной фракции РНК из эпителиальной ткани

Материал и методы. В качестве исходного материала в работе были использованы образцы опухолевой и прилежащей морфологически не измененной ткани, а также образцы архивного материала пациентов отделения опухолей голо- вы и шеи НИИ онкологии СО РАМН 2004–2005 гг. В работе использовался операционный материал от 17 пациентов и 10 архивных образцов. Операционный материал транспортировался и хранился в пробирках со средой RNAlater (Sigma, Missouri, USA). Сравнение методов проводили на 14 образцах. Для выделения РНК из биоматериала использовали Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) и набор реагентов mirVana™ (Ambion, Carlsbad, CA, USA), согласно стандартным протоколам. Качество и количество РНК оценивали на спектрофотометре NanoDrop 1000.

Результаты. При сравнении двух методов выделения полной фракции РНК показано, что колоночный метод обеспечивает в среднем больший выход продукта и лучшие показатели чистоты РНК (средний выход РНК – 216,0 нг/ мкл против 182,4 нг/мкл, коэффициент А260/280 – 1,97 против 1,75, для mirVana™ и Trizol Reagent, соответственно). При работе с реагентом Trizol выявлено, что выход конечного продукта зависит от размера образца, условий и полноты гомогенизации. Так, при выделении РНК из ткани объемом около 6 мм3 и средней степени гомогенизации образца (ножницами) выход тотальной РНК составил 173,3 нг/мкл с коэффициентом чистоты выделения А260/280 1,73. Однако выход продукта из ткани размером 2–3 мм3 при полной гомогенизации (микродисмембратор) образца составил 128,6 нг/мкл (А260/280 1,75). Показано, что гомогенизация в присутствии буфера с ингибитором нуклеаз повышает выход РНК до среднего значения 273,8 нг/мкл (А260/280 1,83). Выход РНК из нормальной ткани при всех типах гомогенизации был ниже, чем из опухолевой, что согласуется с литературными данными. При использовании колоночного метода mirVana™ выход продукта составил в среднем 216,1 нг/ мкл с коэффициентом чистоты выделения А260/280 1,97. Выход РНК в образцах опухолевой ткани был выше, чем в нормальной ткани (248,3 нг/ мкл против 168,2 нг/мкл соответственно).

Выводы. При выделении тотальной фракции РНК из архивного материала среднее значение выхода продукта составило 187,9 нг/мкл, при чистоте выделения А260/280 1,68.

Согласно результатам проведенной работы предпочтительным для выделения тотальной фракции РНК является колоночный метод mirVana™, в силу большего выхода и чистоты продукта. Однако полученная тотальная РНК требует дополнительной проверки полимеразной цепной реакцией, что позволит судить о качестве продукта и, следовательно, дать оценку методу выделения, который был использован.