Межвидовая гибридизация в селекции (Lavandula x intermedia Emeric ex Loisel.) на качество эфирного масла

Основная задача в селекции лавандина (наряду с увеличением ва-

Работа выполнялась при поддержке гранта РНФ (¹ 14-5000079).

лового сбора эфирного масла с 1 га) — снижение количества нежелательных компонентов в сырье (10-12). Однако теоретического обоснования по подбору родительских пар отсутствует, что затрудняет целенаправленное получение гибридов с заданными свойствами у этой культуры. По нашему мнению, перспективным подходом может быть создание гибридных генотипов посредством межвидовой гибридизации с привлечением индуцированных полиплоидных форм (13-17). При этом требуется предварительное изучение закономерностей наследования признаков в подобных комбинациях скрещивания.

В настоящем сообщении нами впервые предложены теоретические подходы к подбору родительских пар для скрещивания лавандинов при селекции на улучшение состава эфирного масла. Представлены результаты получения индуцированных амфидиплоидных форм L . ½ intermedia , гибридного потомства на их основе и проанализирован характер наследования целевых признаков.

Целью исследования был выбор родительских форм, разработка схемы скрещиваний лавандина при селекции на качество и сравнение проявления целевых признаков у полученных гибридных генотипов и их родителей.

Методика. Исходными родительскими формами лаванды узколистной служили следующие сорта: Белянка — линалоольного типа с общим содержанием линалоола и линалилацетата около 80 % и преобладанием линалоола (до 67 %), Прима — линалилацетатно-линалоольного типа с общим содержанием этих компонентов около 80 % и преобладанием линалилацетата (до 50 %), Рекорд — с примерно равным содержанием линалоола и линалилацетата, составляющими суммарно 70 % эфирного масла. Для этих сортов лаванды характерно сравнительно низкое содержание камфары (не более 1,9 %), борнеола (не более 3,5 %) и цинеола (не более 0,3 %). Амфидиплоид ¹ 48 был получен колхицинированием стерильного лавандина F₁ и относится к линалоольному типу с высоким содержанием линалоола (до 62,5 %), средним — линалилацетата (до 12,9 %), камфары (10,6 %), цинеола (3,4 %) и борнеола (5,8 %).

В исследованиях использовали следующие комбинации скрещивания: Амфидиплоид ¹ 48 ½ Белянка, Амфидиплоид ¹ 48 ½ Рекорд, Ам-фидиплоид ¹ 48 ½ Прима (Амфидиплоид ¹ 48 послужил материнской формой). Гибриды и исходные формы выращивали в одинаковых условиях на коллекционных участках Никитского ботанического сада (Крым). В статье приведены средние данные за 2015-2017 годы.

Цитологический анализ гибридов проводили по методике З.П. Па-ушевой (18), используя микроскоп Jenamed («Carl Zeiss Jena GmbH » , Германия, увеличении ½900).

Массовую долю эфирного масла определяли по Гинзбергу (Государственная фармакопея СССР. М., 1987) методом гидродистилляции из свежесобранного сырья. Время отгонки эфирного масла — 1 ч, повторность опытов 3-кратная. Компонентный состав эфирного масла исследовали на газовом хроматографе 6890N («Agilent Technology, Inc.», США) с масс-спектрометрическим детектором 5973N. Колонка HP-1 длиной 30 м, внутренний диаметр — 0,25 мм. Температура термостата программировалась от 50 до 250 °С со скоростью изменения 4 °С/мин. Температура инжектора — 250 °С, газ-носитель гелий, скорость потока 1 см3/мин. Температура переходной линии от газового хроматографа к детектору 230 °С, температура источника ионов — 200 °С. Электронную ионизацию проводили при 70 eV при m/z от 29 до 450 (19). Компоненты эфирного масла идентифицировали по результатам сравнения с данными библиотеки масс-спектров NIST 05 и WI-LEY2007 (всего около 500000 масс-спектров).

Для статистической обработки полученных данных использовали программное приложение STATISTICA v.6.0 («StatSoft Inc.», США). Рассчитывали средние ( M ) и стандартные ошибки средних (±SEM). Достоверность различий между вариантами оценивали по среднему арифметическому и коэффициенту вариации при Р < 0,05.

Результаты. Исходные родительские формы имели разные хемотипы. От скрещивания Амфидиплоида ¹ 48 с диплоидом лаванды узколис- тной получили гибридные генотипы, которые имеют соматическое число

Амфидиплоид

2 n = 96, AALL (метафаза I) 24 ll L. angustifolia + 24 ll L. latifolia

Диплоид 2 n = 48, AA ^½ 24 ll L. angustifolia

Гаметы AL ( n = 48)          Гаметы A ( n = 24)

2 n = 72, AAL

Рис. 1. Комбинация скрещивания амфидиплоида (лаван-дина) с диплоидами лаванды Lavandula sp., использованная при гибридизации для селекции лавандина.

хромосом 2 n = 72, включают два генома L. angustifolia (АА) и один геном L. latifolia (L), представляют собой аллотри-плоиды с геномным составом AA-L. Их образование можно представить следующим образом (рис. 1).

Цитологическое изу- чение гибридов F1 показало, что все они стерильны и имеют число хромо- сом 2n = 72, то есть в их образовании участвовали сбалансированные 24- хромосомные гаметы лаванды узколистной и 48-хромосомные Амфидипло-ида ¹ 48. Проведенное исследование подтвердило гибридную природу полученных от скрещивания растений и показало, что это аллотриплоиды. Таким образом, изученные гибриды (всего 96 генотипов) не различались по числу хромосом, что исключает влияние указанного фактора на содер- жание и состав эфирного масла.

Рис. 2. Распределение межвидовых гибридов F 1 лаванды ( Lavandula an-gustifolia + L. latifolia ) ½ L. angustifolia по содержанию линалилацетата (1) и линалоола (2) в разных комбинациях скрещиваний.

У гибридов во всех вариантах скрещиваний наблюдали значительное увеличение варьирования по содержанию эфирного масла (13, 20). Основная часть гибридов наследовала этот признак по промежуточному типу с приближением средних значений по выборке к высокомасличным формам независимо от типа скрещивания. Уклонение гибридов к высоко- масличной форме наблюдали при использовании сорта Рекорд в качестве отцовского компонента. Таким образом, содержание эфирного масла наследуется в направлении форм с большим проявлением этого признака при определенном влиянии отцовской формы (20).

При анализе закономерностей изменчивости и наследования состава эфирного масла (рис. 2-4) мы рассматривали только его основные компоненты — линалоол и линалилацетат (см. рис. 2), а также соединения, снижающие его качество, — цинеол, камфара и борнеол (см. рис. 3).

При скрещивании Амфидиплоида ¹ 48 и сортов лаванды узколистной Рекорд и Прима, использованных в качестве опылителей, накопление линалоола у гибридов оказалось примерно одинаковым. По содержанию линалилацетата для всех гибридов был характерен промежуточный тип наследования, причем средние показатели смещались в сторону мате- ринской формы.

Рис. 3. Распределение межвидовых гибридов F 1 лаванды ( Lavandula an-gustifolia + L. latifolia ) ½ L. angusti-folia по содержанию терпенов — 1,8-цинеола (1), камфары (2) и борнеола (3) в разных комбинациях скрещиваний.

Наследование нежелательных компонентов характеризовалось более выраженным промежуточным типом. Лишь небольшая доля растений имела содержание борнеола, цинеола и камфары ниже, чем родительские формы, но величина депрессии была весьма незначительной — 3 %. Эти растения выявили в комбинации скрещивания с использованием лаванды узколистной сорта Белянка в качестве отцовской формы (табл. 1).

В целом наследование рассматриваемых компонентов в использованных вариантах скрещивания носило преимущественно промежуточный характер с отклонением в сторону материнской линии и проявлением по ней гетерозисного эффекта в отношении содержания линалоола.

1. Варьирование содержания основных компонентов эфирного масла у межвидовых гибридов F i лаванды $ ( Lavandula angustifolia + L. latifolia ) x 5 L. an-gustifolia , полученных с участием сорта Белянка, в сравнении с родительскими формами ( M ±SEM, n = 32, Никитский ботанический сад, 2015-2017 годы)

Компонент	Содержание, %	5 Сорт Белянка	2 Амфидиплоид № 48	F 1
Линалоол	Среднее	63,7±1,7	60,3±2,1	54,6±1,8
	Пределы варьирования	60,1-64,3	57,5-62,5	51,5-68,8
	Сv , %	4,5±0,5	6,8±0,9	15,1±1,4
Линалилацетат	Среднее	13,9±0,7	9,4±0,9	10,4±0,8
	Пределы варьирования	9,8-15,4	7,5-12,9	9,7-16,2
	Сv , %	11,5±0,8	6,7±0,5	22,8±2,9
Цинеол	Среднее	2,7±0,2	3,4±0,3	3,6±0,5
	Пределы варьирования	2,1-2,9	3,1-5,2	1,8-9,6
	Сv , %	2,2±0,1	6,5±0,4	57,2±4,9

Борнеол	Среднее Пределы варьирования Сv , %	1,8±0,3 1,6-2,1 6,5±0,4	5,8±0,3 4,7-7,2 9,2±0,3	3,6±0,4 0,5-6,8 49,1±5,6
Камфара	Среднее	2,1±0,1	10,6±0,9	5,3±0,3
	Пределы варьирования	1,6-2,3	9,8-12,0	1,9-7,2
	Сv , %	7,5±0,2	8,7±0,8	26,8±2,1

П р и м е ч а н и е. Сv — коэффициент вариации при Р < 0,05.

Скрещивание использованных хемотипов не дало гибридов с высоким качеством эфирного масла. Лишь в гибридном потомстве Амфиди-плоид ¹ 48 ½ сорт Прима часть растений по содержанию линалилацетата немного превосходила взятый в качестве стандарта основной промышленный сорт лаванды Рекорд (табл. 2). При использовании в качестве отцовских форм сортов Рекорд, Прима и Белянка у гибридных растений наблюдалось широкое варьирование по содержанию линалоола (36,7-68,8 %).

• 2.    Варьирование содержания основных компонентов эфирного масла у межвидовых гибридов F i лаванды . ( Lavandula angustifolia + L. latifolia ) x 5 L. an-gustifolia , полученных с участием сорта Рекорд (стандарт), в сравнении с родительскими формами ( M ±SEM, n = 32, Никитский ботанический сад, 20152017 годы)

  Компонент	Содержание, %	1 5 Сорт Рекорд | .	Амфидиплоид ¹ 48	F 1
  Линалоол	Среднее	40,5±0,4	60,3±2,1	46,3±1,1
  	Пределы варьирования	39,0-42,0	57,5-62,5	39,8-58,2
  	Сv , %	8,2±0,7	6,8±0,9	10,4±0,8
  Линалилацетат	Среднее	32,2±0,2	9,4±0,9	19,7±0,7
  	Пределы варьирования	30,0-34,0	7,5-12,9	15,3-28,6
  	Сv , %	5,5±0,3	6,7±0,5	15,8±1,1
  Цинеол	Среднее	0,2±0,1	3,4±0,3	3,1±0,4
  	Пределы варьирования	0,1-0,4	3,1-5,2	0,9-8,1
  	Сv , %	2,5±0,1	6,5±0,4	60,8±5,8
  Борнеол	Среднее	3,5±0,2	5,8±0,3	3,9±0,3
  	Пределы варьирования	2,0-4,0	4,7-7,2	1,7-6,8
  	Сv , %	2,4±0,2	9,2±0,3	34,0±3,5
  Камфара	Среднее	1,4±0,1	10,6±0,9	6,4±0,4
  	Пределы варьирования	0,4-1,9	9,8-12,0	4,1-10,1
  Сv , %                         4,1±0,2 П р и м е ч а н и е. Сv — коэффициент вариации при Р < 0,05.			8,7±0,8	20,7±2,1

• 3.    Варьирование содержания основных компонентов эфирного масла у межвидовых гибридов F i лаванды . ( Lavandula angustifolia + L. latifolia ) x 5 L. an-gustifolia , полученных с участием сорта Прима, в сравнении с родительскими формами ( M ±SEM, n = 32, Никитский ботанический сад, 2015-2017 годы)

  Компонент    Содержание, %	5 Сорт Прима . Амфидиплоид № 48	F 1
  Линалоол     Среднее	32,8±0,4               60,3±2,1	46,8±1,6
  Пределы варьирования	31,0-33,0                57,5-62,5	36,7-57,9
  Сv , %	3,8±0,2                6,8±0,9	14,8±1,3

Одинаковый характер наследования с промежуточными значениями показателя выявили у гибридов и по накоплению 1,8-цинеола и камфары. По всем вариантам скрещивания доля растений с меньшим содержанием камфары, чем у стандарта, составила 60 %. По количеству борнеола депрессию отмечали у 9 % гибридного потомства. Таким образом, во всех сочетаниях хемотипов наблюдается влияние особенностей материнской формы на характер наследования состава эфирного масла.

Гибридизация линалоольно-линалилацетатного и линалоольно-кам-фарного хемотипов (табл. 3) позволила получить часть гибридов, у которых содержание линалоола выше, линалилацетата — примерно равное, а борнеола — ниже по сравнению с показателями у промышленного сорта лаванды Рекорд. При этом количество 1,8-цинеола у полученных гибридов (пределы варьирования 0,9-9,7 %) было значительно выше, чем у стандарта — сорта Рекорд (0,01-0,04 %).

Линалилацетат	Среднее	46,6±0,3	9,4±0,9	23,4±1,2
	Пределы варьирования	44,1-50,4	7,5-12,9	15,5-32,8
	Сv , %	9,8±0,5	6,7±0,5	22,3±1,9
Цинеол	Среднее	0,3±0,1	3,4±0,3	2,7±0,5
	Пределы варьирования	0,2-0,4	3,1-5,2	0,9-9,7
	Сv , %	2,8±0,2	6,5±0,4	81,8±8,9
Борнеол	Среднее	0,8±0,2	5,8±0,3	2,9±0,4
	Пределы варьирования	0,2-1,3	4,7-7,2	1,6-5,4
	Сv , %	3,4±0,4	9,2±0,3	55,6±7,1
Камфара	Среднее	0,4±0,9	10,6±0,9	5,2±0,4
	Пределы варьирования	0,1-0,9	9,8-12,0	0,2-6,8
	Сv , %	5,1±0,4	8,7±0,8	30,4±3,6

Прим еч ани е. Сv — коэффициент вариации при Р < 0,05.

Рис. 4. Эфирные масла межвидовых гибридов F 1 лаванды ( Lavandula an-gustifolia ½ L. latifolia ) ½ L. angusti-folia в комбинациях скрещивания Ам-фидиплоид ¹ 48 ½ сорт Прима (А) , Амфидиплоид ¹ 48 ½ сорт Рекорд (Б) и Амфидиплоид ¹ 48 ½ сорт Белянка (В) (Никитский ботанический сад, 2015-2017 годы).

Время удерживания, мин

Пики: 1,8-цинеол (7,51), линалоол (9,77-9,81), камфара (10,52-10,54), борнеол (11,58), линалилацетат (14,65-14,71). Газовый хромато-масс-спектрометр 6890N, «Agilent Technology, Inc.», США.

Гибриды от скрещивания с сортом Белянка, имеющим примерно одинаковое содержание линалоола и линалилацетата с материнскими растениями (Амфидиплоид ¹ 48) ли-налоольного хемотипа, тоже проявляли наследование по этим показателям с уклонением в сторону материнской формы (Амфи-диплоид ¹ 48).

В отношении нежелательных компонентов от- мечали депрессию у большинства гибридных генотипов во всех использованных комбинациях. Например, имело место сниженное количество борнеола (от 9 до 48 %). Тем не менее, по содержанию камфары и 1,8-цинеола ни один из гибридов фактически не улучшил показатели стандарта. В то же время в варианте Амфидиплоид ¹ 48 ½ сорт Белянка у довольно значительной части потомства F1 (56 %), наоборот, проявился гетерозисный эффект по этим признакам, особенно по содержанию 1,8-цинеола.

Основная часть гибридов характеризовалась депрессией по содержанию линалоола во всех вариантах скрещивания, но некоторые обнаруживали по этому показателю гетерозисный эффект, достигающий 127,9131,0 %. При использовании сорта Белянка выход растений с гетерозисным эффектом был максимальными и составил 18 % (см. рис. 2). Небольшой гетерозисный эффект проявлялся и по содержанию линалилацетата, но лишь в комбинации Амфидиплоид ¹ 48 ½ сорт Прима и только у 3 % полученных гибридов.

Отметим, что комбинация Амфидиплоид ¹ 48 ½ сорт Прима дает значительный выход гибридных растений, приближающихся по качеству эфирного масла к стандарту — сорту Рекорд, а 100 % гибридов от скрещивания Амфидиплоид ¹ 48 ½ сорт Белянка были лучше сорта Рекорд по содержанию линалоола.

Анализируя полученные результаты, можно сделать следующие предположения о возможностях селекции лавандинов с определенным содержанием и составом эфирного масла. Исходные формы лаванды узколистной и Амфидиплоида ¹ 48 имеют ряд генетических особенностей. Хемотипы лаванды узколистной характеризуются наличием доминантных аллелей, контролирующих синтез линалоола (Л) и линалилацетата (А), рецессивные аллели, контролирующие биосинтез цинеола (ц), борнеола (б) и камфары (к). У Амфидиплоида ¹ 48 доминантные аллели контролируют биосинтез линалоола (Л), борнеола (Б) и камфары (К). Биосинтез линалилацетата не характерен для этого клона и контролируется рецессивной аллелью (а).

В предыдущих исследованиях нами было показано, что Амфиди-плоид ¹ 48 как донор признака высокого выхода эфирного масла необходимо использовать в качестве отцовской формы, так как признак содержания эфирного масла наследуется по отцовской линии (13, 20). В то же время высокое содержание линалоола и линалилацетата может достигаться лишь в тех случаях, когда в качестве материнской формы берутся хемотипы лаванды узколистной. Это обстоятельство особенно важно в отношении селекции на содержание линалилацетата, биосинтез которого не характерен для Амфидиплоида ¹ 48. Таким образом, при селекции лаван-динов возможно одновременное сочетание положительных результатов как по содержанию, так и по составу эфирного масла. В зарубежной литературе не приводятся данные по оценке комбинаций скрещивания, а дается только химический анализ эфирного масла уже полученных лавандинов (21-25). Сравнение результатов исследования компонентного состава эфирного масла лавандинов, полученных нами и иностарнными исследователями, показало, что по качеству масла наши гибриды превосходят зарубежные (10, 11, 26-28).

На исход селекции в значительной степени влияет правильный выбор хемотипов пар. При селекции на содержание эфирного масла следует обратить внимание на то, что гетерозисный эффект обнаруживается при определенной степени проявления этого признака у исходных форм. Ориентировочно появление гетерозисных по содержанию эфирного масла гибридов наиболее вероятно при его содержании не менее 5 % от сухой массы сырья для лаванды узколистной и 10 % — для Амфидиплоида ¹ 48.

Амфидиплоид ¹ 48, как и сорт Белянка, имеет доминантные аллели, контролирующие биосинтез линалоола. Как следствие, гетерозис по этому компоненту наблюдался во всех комбинациях скрещивания. Максимум содержания линалоола пропорционален его количеству в обеих исходных формах — у сорта Белянка и у Амфидиплоида ¹ 48. Гетерозис по содержанию линалилацетата — более редкое явление и он имеет место, очевидно, только при сочетании высокого содержания и линалилацетата, и линалоола у материнской формы. Необходимо отметить, что наследование высокого содержания линалилацетата и линалоола не совмещается, так как высокие значения по линалоолу достигаются при использовании Амфиди- плоида ¹ 48 в качестве материнской формы, а по линалилацетату — в качестве отцовской. Это обстоятельство может быть использовано в направленной селекции на содержание одного из этих компонентов.

Ранее мы сообщали, что улучшение гибридов по содержанию нежелательных компонентов эфирного масла — 1,8-цинеола, борнеола и камфары более вероятно при использовании Амфидиплоида ¹ 48 как отцовской формы (13, 20). Однако только в случае борнеола имеется возможность получить гибридные растения с депрессией его содержания до величины, которая ниже, чем у исходных форм. Депрессия по содержанию 1,8-цинеола и камфары не выходит за пределы промежуточного типа наследования. Таким образом, можно предположить, что содержание 1,8-цинеола и камфары у отбираемых для селекции хемотипов лаванды узколистной соответствует предельно низкому количеству этих соединений у представителей вида. Гибридные растения способны лишь приближаться к этим значениям. Наиболее целесообразным при селекции лавандинов на высокое качество эфирного масла представляется подбор хемотипов амфидиплоида с низким содержанием 1,8-цинеола и камфары при высоком накоплении линалилацетата.

Итак, мы показали, что лучшие результаты по содержанию эфирного масла и его составу получены в комбинациях скрещиваний Амфиди-плоида ¹ 48 с близкородственными с биологической точки зрения хемотипами лаванды узколистной, несущими доминантные аллели линалилацетата и линалоола (сорт Прима) или доминантный аллель линалоола (сорт Белянка). Эти сочетания дают гибриды с максимальным содержанием линалоола и линалилацетата. Кроме того, здесь же наибольший выход гибридов, гетерозисных по желательным признакам. Изучение комбинационной способности родительских пар показало, что для получения гибридов с высоким качеством эфирного масла необходимо проводить направленные межвидовые скрещивания Амфидиплоида ¹ 48 с Lavandula angustifolia сортов Рекорд и Прима, что позволяет синтезировать аллотри-плоиды с двумя геномами L. angustifolia и одним геномом L. latifolia , у которых массовая доля эфирного масла составляет до 3,6 % от сырой массы сырья (или 10,25 % в расчете на абсолютно сухое вещество). Лучшей комбинацией скрещивания оказалась пара Амфидиплоид ¹ 48 ½ сорт Прима. Она позволяет создавать аллотриплоиды с высоким качеством эфирного масла, содержащего до 32,8 % линалилацетата при минимальном количестве 1,8-цинеола (3,7 %) и камфары (5,6 %). Кроме того, в комбинации Амфидиплоид ¹ 48 ½ сорт Белянка были получены гибриды с высоким содержанием линалоола (до 68,8 %) для эфиромасличной промышленности. В результате отбора нами выделены сортообразцы с содержанием линалоола до 68,8 % (гибрид Амфидиплоид ¹ 48 ½ сорт Белянка) и линалилацетата — до 32,8 % (гибрид Амфидиплоид ¹ 48 ½ сорт Прима) .