Микроанализ нейромедиаторов при введении чужеродного костного мозга

Введение. В настоящее время в лечении ряда заболеваний, таких как лейкозы, лимфома, множественная миелома, а также ряда других состояний: апластическая анемия, иммунологический синдром применяют пересадку костного мозга [1, 5]. Одновременно с максимальным уничтожением опухолевой ткани при трансплантации костного мозга подавляется иммунитет больного. Применение люминесцентно-гистохимических методов позволило ряду исследователей выявить и изучить биоаминосодержащие структуры костного мозга, которые участвуют в регуляции процессов кроветворения и иммуногенеза. Основными биоаминосодержащими клетками костного мозга являются гранулярные люминесцирующие клетки (ГЛК) и тучные клетки (ТК) [4,7]. ГЛК крупнее тучных клеток, имеют гранулы разного цвета и размера, с разной интенсивностью люминесценции. ГЛК в костном мозге расположены около гемопоэтических островков размножения, мегакариоцитов, синусоидных капилляров. Выявлено, что в гранулах этих клеток содержатся катехоламины (КА), серотонин (СТ) и гистамин. ГЛК совместно с тучными клетками являются клетками-регуляторами и участвуют в автономной регуляции иммунологических и кроветворных органов.

Цель исследования - изучить влияние алло-

Таблица.

Миелограмма у интактных мышей и после аллопересадки костного мозга через 40 минут

Название клеток	Число клеток в норме	Аллопересадка
Бласты	3,4±0,83	7,6±0,83
Эритроидный ряд	28,7±0,1	60±0,1
Метамиелоциты эозинофильные	5,2±0,1	4,1±0,1
Метамиелоциты нейтрофильные	3,5±0,1	3,4±0,1
Палочкоядерные нейтрофилы	8,5±0,2	6,2±0,1
Мегакариоциты	0,7 ±0,1	0,9±0,1

Примечание: Расчет производили на 200 клеток. ± - амплитуда колебаний нейроаминов

трансплантации костного мозга на распределение нейроаминов в биоаминосодержащих структурах костного мозга.

Материал и методы исследования. Работа была выполнена на 40 мышах, которые были разделены на три группы:

1-я группа – интактные (n=10), 2-я - контрольная группа мышей (n=10), которым вводили физиологический раствор в дозе 1 мл.

3-я группа - производили аллотрансплантацию костного мозга. Животным вводили суспензию костного мозга, полученную из бедренной кости от мыши другой линии, 0,2 мл костного мозга помещали в 2 мл физиологического раствора и тщательно размешивали. 1 мл суспензии костного мозга вводили в хвостовую вену мыши. Другая часть объема полученной суспензии шла на подсчет числа клеток в полученной гетерогенной популяции клеток костного мозга с помощью проточного спектрофотометра «Ф-2000» с применением флуоресцеина изотиоцианата (FITC). Число клеток в 1 мл суспензии было равно 2,1* 108.

Все процедуры по уходу осуществлялись по нормам и правилам обращения с лабораторными животными [2], в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медикобиологических исследований с использованием животных» (1985), правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ от 19.06.2003 №267).

В работе использовались люминесцентногистохимические методы Фалька-Хилларпа (1969) и Кросса, Эвена, Роста (1971) - для избирательного выявления нейроаминов. Количественно уровень КА, СТ и гистамина в структурах оценивались с помощью цитоспектрофлуориметрии. Окраска по А. Унна применялась для определения сульфа-тированности гепарина и состояния тучных клеток. Полученные цифровые данные обрабатывались статистически по специально разработанной программе «Statistica», версия 6 (Copyright@Stat Soft, 19842001, ИПЧИ 31415926535897). Определяли статистическую значимость различий.

Результаты исследования и их обсуждение. В результате исследования через 15 минут после аллотрансплантации костного мозга выявлено, что в гранулярных люминесцирующих и тучных клетках снижено в два раза содержание катехоламинов и серотонина. Выявлялись мегакариоциты, у которых содержание всех исследованных веществ было несколько повышено.

При окраске препаратов по Унна гемопоэтические клетки окрашивались одинаково ортох-ромно. Число тучных клеток снижалось до 1 – 2 клеток на несколько полей зрения. Они окрашивались В-метахроматично или ортохромно, что говорит о сниженной сульфатации этих клеток.

Через 40 минут при исследовании костного мозга отмечалось дальнейшее снижение содержания КА и СТ в клетках-регуляторах. Выявлялись округлые клетки со светящимися мелкими зернами и несветящимся бобовидным ядром (макрофаги). У мегакариоцитов не люминесцировали ядра, однако светилась цитоплазма. Нервные волокна не выявлялись.

ГЛК люминесцировали темно-оранжевым цветом и выявлялись в небольшом числе, полноценных клеток с хорошо заметными разнокалиберными гранулами до 0,2 мкм, было 1 – 2 на весь препарат, однако обнаруживались клетки, у которых люминесцировали 2 – 3 гранулы. Таких клеток было до 2 - 3 на одно поле зрения.

Аналогичная картина наблюдалась и с тучными клетками, выявлялись темно-оранжевые тени с расположенными рядом гранулами, размерами до 0,002 мкм. Произошел тотальный распад этих клеток. Такие клетки не содержали свободного гистамина.

При окраске препаратов по Унна определялись неправильной формы клетки с ортохромным (синим) ядром и неокрашенными гранулами разного размера. Тучные клетки имели гамма-метахроматичную окраску, клетки тотально распадались.

В миелограмме люминесцировали клетки эритроидного ряда, лимфоциты и ядра плазмоци-

Рис. 1. Мазок костного мозга у контрольных мышей. Метод Кросса.

МЛ-6. Ув. 400

Рис. 2. Мазок костного мозга мыши после аллогенной пересадки костного мозга: а- мегакариоцит, б- липоцит, в- клетки эритроидного ряда. Метод Кросса. МЛ-6. Ув. 400.

Рис. 3. Мазок костного мозга мыши после аллогенной пересадки костного мозга. А – тучная клетка. Метод Кросса. МЛ-6. Ув. 400

тов. Число клеток эритроидного ряда было резко повышенным, а число метамиелоцитов снижалось по сравнению с интактными животными (табл.1). Выявлялись мегакариоциты, у которых содержание всех исследованных веществ было несколько повышено.

Нами выявлено, что в костном мозге через 15 мин после аллогенной пересадки костного мозга происходило постепенное снижение числа тучных и ГЛК, содержание нейроаминов в них также снижалось. Уменьшалась сульфатированность гепарина во всех клетках костного мозга. Через 40 мин развивался тотальный распад тучных клеток и снижение числа люминесцирующих гранул в ГЛК с уменьшенным содержанием нейроаминов в них. Резко снижалось число зрелых форм лейкоцитов.

Наши исследования показывают, что аллогенная пересадка, вызывает подавление синтеза нейроаминов и распад клеток-регуляторов, вследствие чего основные функции костного мозга: митотическое деление молодых форм и их дифференцировка нарушались.

Вывод: Аллопересадка костного мозга вызывает глубинные изменения в синтезе нейроаминов, что ведет к перераспределению нейромедиаторов в как в самих биоаминосодержащих структурах костного мозга так и в межклеточном веществе, что приводит к нарушению его основных функций.