Микробиологическая активность нефтезагрязненных почвенных субстратов при очистке с применением комплексных биосорбентов

Перспективным направлением очистки почв и воды от нефтезагрязнений является применение препаратов на основе специализированных микроорганизмов и их ассоциаций. Одним из способов очистки загрязненных почвенных субстратов является применение иммобилизованных на носителях форм биопрепаратов. Иммобилизованные клетки более устойчивы к неблагоприятному воздействию факторов окружающей среды, а также к конкурентному вытеснению местной микробиотой [1].

Цель исследования – определить биологическую (микробиологическую) активность в различных загрязненных нефтью почвенных субстратах при их обработке комплексными биосорбентами.

В течение 3 летних месяцев в микрополевом эксперименте испытывали комплексные биосорбенты, составленные в разных сочетаниях. Для исследования использовали загрязненные нефтью до концентрации 150 мг/г глинистый, песчаный и торфяной почвенный субстраты, отличающиеся физическими и агрохимическими характеристиками (табл. 1). Индивидуальные биосорбенты были получены иммобилизацией адсорбционным способом на носителе-сорбенте «Сорбо-нафт» 3 штаммов микроорганизмов: Rhodococcus

Щемелинина Татьяна Николаевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории биохимии и биотехнологии egvi B-1117 ККМ (биосорбент бактериальный), Rhodotorula Glutinis Y-1112 ККМ (биосорбент дрожжевой); Trichoderma lignorum F-98 ВКПМ (биосорбент грибной) с титром 1х107 КОЕ/1г сорбента. В композиции индивидуальные биосорбенты брали в соотношении 1:1 и вносили в загрязненный почвенный субстрат в соответствующие варианты исходя из расчета нормы внесения сорбентов по 5т/га. По схеме опыта в почву также внесли минеральное удобрение – азофоску (N16P16K16) из расчета 350 кг/га. В течение опыта в динамике, на 1, 3, 15, 30, 60, 90 сутки оценивали скорость снижения массовой доли нефти, ферментативную и дыхательную активность почвы, численность отдельных трофических групп почвенной микробиоты.

Определение ферментативной активности проводили по методам, описанным Хазиевым [2]. Содержание нефти в почве анализировали методом флуориметрии на анализаторе жидкости «Флюорат-02» [3]. Дыхательную активность исследуемых субстратов определяли по интенсивности выделения СО 2 на газовом хроматографе «Цвет-800» [4]. Учет численности физиологических групп микроорганизмов почвенных субстратов проводили методом Коха: гетеротрофы – на среде МПА; углеводородо-кисляющие (УОМ) – на среде Придхем-Готлиба [5]. Измерение содержания углерода и азота в образцах почвы проводили методом газовой хроматографии на элементном анализаторе ЕА 1110 (CHNS-O) [6].

Результаты и обсуждение. Исходные характеристики опытных субстратов приведены в табл. 1, из которой видно, что они отличались содержанием общего азота и углерода, величиной рН. Песчаный и глинистый субстрат после загрязнения нефтью подкислялись, а в исходно кислом торфяном субстрате величина рН увеличилась. Содержание азота во всех опытных субстратах низкое.

Таблица 1. Агрохимические показатели почвенных субстратов

Почвенный субстрат	Азот общий, %	Углерод общий,%	рН субстрата исходный	рН при внесении 150 мг/г нефти
глинистый субстрат	0,069±0,021	1,28±0,19	6,03	5,81
песчаный субстрат	0,0252±0,008	0,21±0,05	5,20	4,89
торфяной субстрат	0,9±0,14	15,8±1,6	2,83	3,47

Параметры биологической активности почв, такие как численность отдельных групп почвенной микробиоты, ферментативная и дыхательная активность почвы являются важными показателями интенсивности процессов очищения загрязненных субстратов. Микробиологическая активность – один из экологически значимых параметров почвы [7]. Характер реакции комплекса почвенной микробиоты на нефтяное загрязнение будет зависеть от концентрации загрязнения. Так, в небольших дозах нефть может пополнять запасы питательных веществ, доступных почвенным микроорганизмам (м/о). В почвах любой территории присутствуют углеводороды как природного, так и антропогенного происхождения, поэтому в ней всегда содержится некоторое фоновое количество УОМ. В нашем опыте уровень загрязнения почвенных субстратов исходно был высоким, и нефть оказывала ингибирующее на м/о, значительно снижая их численность. Степень угнетения гетеротрофной группы микроорганизмов в почвенных субстратах в начале опыта (первый месяц) была в хорошо отслеживаемой зависимости от концентрации нефти (рис. 1). В загрязненных нефтью глинистом и песчаном субстратах произошло значительное снижение численности гетеротрофов. В вариантах с внесением биосорбентов с иммобилизованными на сорбентах м/о наблюдали незначительное увеличение численности этой физиологической группы. Показатели численности УОМ были на несколько порядков ниже исходных значений биосорбентов в песчаной и глинистой почвах, возможно, это связано с необходимостью адаптации иммобилизованных микроорганизмов в загрязненных средах с изначально неблагоприятными условиями питания и существования. В торфяном субстрате в загрязненных вариантах (особенно в варианте с сорбентом без м/о) наблюдали снижение численности гетеротрофов относительно контрольного варианта. Через месяц показатели численности м/о в почвенных субстратах начали изменяться в сторону увеличения, что может быть связано как с адаптацией микробиоты к загрязнению, так и с уменьшением концентрации легких токсичных фракций.

В результате попадания нефти в почву увеличивается содержание органического вещества. Начавшиеся процессы естественной деградации делают эти вещества доступными для м/о, которые могут их использовать в качестве дополнительных источников питания, что наряду с постепенно снижающимся токсическим действием нефтяных углеводородов (НУГВ) способствует нарастанию численности гетеротрофных м/о и обусловливает дальнейшее доминирование данной группы микроорганизмов в почве. После внесения с биосорбентами УОМ в опытной почве показатели численности гетеротрофной группы м/о и УОМ были значительно выше во второй (после адаптационной) фазе опыта, чем в вариантах без биообработки (контрольных, нефтезагрязненных, и в вариантах с сорбентом без м/о). В массе жизнеспособных нефтеокисляющих микроорганизмов, определенной чашечным методом Коха, доминировала бактериальная культура Rhodococcus egvi в микробных ассоциациях вариантов с внесенными комплексными бактериальнодрожжевым и бактериально-грибным биосорбентами в нефтезагрязненных почвенных пробах (рис. 1).

Одним из важных показателей биодеструкции углеводородов в почве является ферментативная, и, в частности, дегидрогеназная активность (АД) микробиоты, которая коррелирует с метаболическими параметрами, такими как число микробиальных клеток, почвенное дыхание, концентрация АТФ, оборот углерода и азота, и содержание органического вещества [7, 8].

Дегидрогеназная активность в значительной степени отражает уровень деструкции нефтяных углеводородов в почвенных субстратах опыта. Во всех почвенных субстратах наибольшие показатели АД наблюдались в вариантах с внесением комплексных биосорбентов. На глинистом и песчаном субстратах показатели дегидрогеназной активности были выше относительно контрольного варианта (рис. 2). Внесение комплексных биосорбентов в песчаный и глинистый почвенные субстраты значительно увеличило процессы дегидрирования, особенно к концу эксперимента в песчаном субстрате. В вариантах нефтезагрязненном и с внесением сорбента без м/о незначительное повышение АД наблюдалось лишь к концу опыта.

В торфяном субстрате самые низкие показатели АД были в варианте с внесением сорбента без м/о. Наибольшими показателями АД в торфяном субстрате выделялись на протяжении всего опыта варианты с внесением биосорбентов и вариант нефтезагрязненной почвы без обработки. К концу опыта дегидрогеназная активность увеличилась во всех субстратах относительно контрольного варианта. Особенности почвенных субстратов обусловили динамику ферментативной активности при биодеструкции нефти. Данные АД согласуются с динамикой изменения численности гетеротрофных м/о и УОМ в проведенном опыте (рис.1, 2; табл. 2).

Повышение липазной активности связано с накоплением малоактивных и неразлагающихся биологических веществ, образующихся в процессе биодеградации нефти [9], а также с тем, что в деградации липидов участвуют ферментные системы очень схожие с системами биодеградации нефтепродуктов [10]. Если в начале опыта высокое содержание углеводородов в почве ингибировало липолитическую активность почти во всех вариантах, то уже на 3 сутки мы наблюдали ее повышение. В вариантах с внесением биосорбентов высокие показатели липазной активности наблюю-дались в глинистом и песчаном почвенных субстратах (рис. 3).

Рис. 1. Численность жизнеспособных микроорганизмов в глинистом, песчаном и торфяном почвенных субстратах, Lg численности Условные обозначения: 0 - контроль, незагрязненный почвенный субстрат; 1 – нефтезагрязненный почвенный субстрат; 2 – почвенный субстрат с сорбентом без микроорганизмов; 3 – почвенный субстрат с бактериальнодрожжевым биосорбентом; 4 – почвенный субстрат с бактериально-грибным биосорбентом

В торфяном субстрате усиление процессов липолиза наблюдалось лишь в начале эксперимента в варианте с внесением бактериальногрибного сорбента. К концу исследований происходила стабилизация липолитических процессов в песчаном и торфяном субстратах. В глинистом субстрате липазная активность в вариантах с внесе-нием биосорбентов была еще достаточно высо-кой по сравнению с контрольным вариантом.

Дыхательная активность почвы, отражающая метаболические процессы в почве и связанная с биохимической активностью, а также с количеством жизнеспособных микроорганизмов в почве, была определена нами по скорости выделения СО2. Дыхание (эмиссия CО2) является интегральным показателем функционирования почвенного микробоценоза. По интенсивности эмиссии углекислого газа из почвы можно судить о скорости процессов разложения органического вещества.

4,00

3,00

2,00

1,00 е

0,00

исх 3 сут 15 сут 30 сут 60 сут 90 сут

Незагрязненный субст рат , контроль Нефт езагрязненный субст рат

Сорбент без м/о

Бактериально-дрожжевой биосорбент Бакт ериально-грибной биосорбент

Рис. 2. Дегидрогеназная активность в глинистом, песчаном и торфяном почвенных субстратах, мг ТФФ/ 1г а.с.п. 24 час.

Результаты исследований свидетельствовали о разной реакции почвенной микробиоты на условия снабжения кислородом. Показатели дыхательной активности в контрольных вариантах глинистого и песчаного субстратов были существенно ниже всех вариантов опыта, и на протяжении всего эксперимента изменялись незначительно (рис. 4.). Внесенные в почвенные субстраты сорбент и биосорбенты с минеральными удобрениями улучшили структуру глинистого и песчаного субстратов, положительно влияли на развитие и дыхательную активность почвенных микроорганизмов, о чем свидетельствовали и высокие показатели скорости выделения СО2 в этих субстратах. На торфяном субстрате в вариантах с сорбентом без м/о и биосорбентами в начале опыта были высокие показатели интенсивности дыхательной активности, но к концу опыта наблюдалось снижение дыхательной активности во всех загрязненных вариантах. Эти данные коррелируют с показателями ферментативной активности в глинистом, песчаном и торфяном почвенных субстратах (табл. 2).

исх.     15 суток 30 сут ок 90 сут ок

—♦— Незагрязненный субст рат, конт роль

—■— Нефт езагрязненный субст рат

▲ Сорбент без м/о

Бактериально-дрожжев ой биосорбент Бакт ериально-грибной биосорбент

—♦— Незагрязненный субст рат, контроль

—■— Нефт езагрязненный субст рат

▲ Сорбент без м/о

Бакт ериально-дрожжев ой биосорбент

Бакт ериально-грибной биосорбент

Рис. 3. Липазная активность в глинистом, песчаном и торфяном почвенных субстратах, мл 0,1н КОН/ 1 г а.с.п.час

700,0

600,0

500,0

400,0

300,0

200,0

100,0

0,0

исх.

15 суток 30 суток 90 суток

Рис. 4. Дыхательная активность в глинистом, песчаном и торфяном почвенных субстратах, нмоль СО 2 / 1г в.с.п.час.

Обнаружены различные корреляции численности микробиоты с метаболическими параметрами, такими как дегидрогеназная, липазная и дыхательная активности в почвенных субстратах (табл. 2). Отсутствовали корреляции дыхательной активности (эмиссии СО 2 ) с липазной активностью, а также дегидрогеназной с липазной активностями во всех почвенных субстратах. В торфяном субстрате корреляция отсутствовала практически по всем показателям.

Об эффективности биоразложения нефтепродуктов нефтезагрязненных почв говорят результаты анализа нефти в почве к концу опыта. Снижение содержания нефти произошло во всех вариантах, но с разной интенсивностью. На глинистом субстрате самые высокие показатели очистки наблюдалась в вариантах с внесением бактериально-дрожжевого сорбента.

Таблица 2. Коэффициенты корреляции в почвенных субстратах

Почвенные субстраты	Коррелирующие показатели
	гетеротроф ы/АД	гетеротроф ы/АЛ	гетеротроф ы/СО2	эмиссияС О2/АД	УОМ/ АД	УОМ/ АЛ	УОМ/эмисс ия СО2
глинистый	r=0,5	r=0,5	r=0,3	r=0,7	r=0,7	r=0,4	r=0,6
песчаный	r=0,4	r=0,2	r=0,3	r=0,7	r=0,6	r=0,1	r=0,8
торфяной	r=0,1	r=0,2	r=0,1	r=0,1	r=0,2	r=0,2	r=0,6

Незначительное самоочищение произошло в вариантах нефтезагрязненном и с сорбентом без м/о за счет собственной микробиоты глинистого субстрата. В торфяном субстрате в нефтезагрязненном варианте показатели снижения содержания нефти незначительно отличались от вариантов с внесением биосорбентов, что говорит о высоком природном потенциале самоочищения органических (торфяной) почв. Наихудшие результаты по деструкции нефти были получены для песчаного субстрата (рис. 5).

| о Глинистый субстрат ■ Песчаный субстрат ■ Торфяной субстрат |

Рис. 5. Снижение содержания нефтепродуктов в почвенных субстратах по окончании опыта, % убыли нефти

Выводы: результаты микрополевого опыта показывают, что эффективность очистки почвенных субстратов напрямую зависит от микробиологической активности исходных субстратов, которая возрастает в ряду песчаный – глинистый – торфяной субстраты. Изменение показателей биологической активности (ферментативной и дыхательной) коррелирует с численностью гетеротрофов и УОМ в большей степени в минеральных почвенных субстратах. Комплексный бактериально-дрожжевой биосорбент отличается более высокими показателями биологической активности и степенью очистки во всех почвенных субстратах от бактериально-грибного биосорбента. Усиление микробной активности загрязненной нефтью почвы при применении комплексных биосорбентов зависит от нефтедеструктивной эффективности иммобилизованных на сорбентах микроорганизмов. Применение сорбента без микроорганизмов и биосорбентов более эффективно на минеральных (глинистый, песчаный) субстратах, но не перспективно для очистки органических (торфяных) почвенных субстратов.