Microbiological approach to the reconstruction of initial presence of fat in vessels from burials of Alanic culture

Субстраты липидной природы – жиры и масла – всегда занимали особое место в рационе древнего человека. Благодаря высокой калорийности, низким энергетическим затратам на переваривание, приятным органолептическим характеристикам, сравнительно длительному времени хранения и частому (или постоянному) дефициту, жиры ценились весьма высоко и представляли собой продукт статусный, отнюдь не повседневного рациона. С другой стороны, жир не являлся каким-то экзотическим либо эпизодическим (сезонным) продуктом и в том или ином количестве всегда находился в пределах потенциальной доступности в любом социуме, но сберегался «на черный день» или для каких-то особых случаев. Именно эти обстоятельства позволяют ожидать, что жир мог

1 Работа выполнена при финансовой поддержке гранта МК-2325.2019.6. Полевые исследования проводились в 2017–2018 гг. при поддержке РФФИ, проект 17-18-01406.

широко использоваться в погребальном обряде в качестве ритуальной пищи в горшках, которые помещали в могилы, оказывая, таким образом, уважение памяти усопшего.

В связи с этим закономерен интерес исследователей к поиску следов жира в сосудах из погребений. Начиная с 70-х гг. прошлого века широкое распространение получили работы по поиску остатков липидов на поверхности и в порах керамических фрагментов с помощью методов газовой хроматографии и масс-спектрометрии ( Condamin et al. , 1976; Evershed , 1993; Evershed et al. , 2002; Copley et al. , 2005; Barnard et al ., 2007; Oudemans et al ., 2007; Kanthilatha et al ., 2014). Однако в данном случае возможно определить лишь, были когда-либо в этом горшке жиры или нет. Иными словами, жирно-кислотный анализ содержимого керамики позволяет раскрыть первый этап «жизни» горшка – утилитарный, или период его использования в качестве повседневной посуды для приготовления, транспортировки и хранения пищи. Но особый интерес вызывает второй этап его функционирования – ритуальный, когда горшок с жертвенной пищей ставили в могилу. В этом случае определить состав пищи в сосуде в момент погребения можно только благодаря изучению грунта из заполнения сосуда. К настоящему времени известны лишь единичные примеры анализа грунта из горшков в целях выявления наличия животных жиров в составе ритуальной пищи ( Пожидаев и др ., 2016).

В нашей работе мы предлагаем новый метод реконструкции исходного присутствия жиросодержащих продуктов в керамических сосудах из погребений на основе изучения продуктов их микробиологической трансформации, а именно ферментов, а не жирно-кислотного состава липидов. Известно, что при поступлении в почву какого-либо органического субстрата изменяются не только количественные показатели почвенного микробного сообщества, но и ферментативная активность почв. По мере микробного разложения органических материалов в почве накапливаются ферменты, которые могут пребывать в ней без потери их активности тысячи лет ( Хомутова и др. , 2012; Dick et al ., 1994; Cher nysheva et al. , 2018).

Структура и свойства жиров

Жир является биомолекулой, наиболее устойчивой к деградации в окружающей среде, в частности в почве, прежде всего благодаря своим гидрофобным свойствам, что препятствует его вымыванию грунтовыми водами из места первоначального поступления в почву (Evershed, 2008). Жиры (липиды) представляют собой нерастворимые в воде органические молекулы, состоящие главным образом из углерода, водорода и кислорода и в меньшей степени – из фосфора, азота и серы. Их структура представляют собой линейный, разветвленный или циклический углеродный скелет, который, как правило, полностью насыщен атомами водорода (Evershed, 1993). Характерным структурным компонентом большинства липидов являются жирные кислоты, длинноцепочечные органические кислоты, содержащие от 4 до 24 углеродных атомов; они содержат одну карбоксильную группу и длинный неполярный углеводородный «хвост», из-за которого большинство липидов нерастворимы в воде и проявляют свойства масел и жиров. В клетках и тканях жирные кислоты встречаются не в свободном состоянии, а в составе липидов различных классов. В свободном виде жирные кислоты получают только путем химического или ферментативного гидролиза. Практически все встречающиеся в естественных условиях жирные кислоты содержат четное число атомов углерода, чаще всего 16 или 18. Длинная углеводородная цепь, составляющая хвост молекулы, может быть полностью насыщена, то есть содержать только одинарные связи, или ненасыщена, т. е. содержать одну или две двойные связи. Наиболее простые и широко распространенные липиды, содержащие жирные кислоты, – это нейтральные жиры (триаглицеролы), представляющие собой эфиры спирта глицерола и трех молекул жирных кислот. Они являются основным компонентом жировых депо растительных и животных клеток.

Большинство природных жиров, таких как оливковое или сливочное масло и другие пищевые жиры, содержат сложные смеси простых и смешанных три-ацилглицеролов, в состав которых входят жирные кислоты, различающиеся по длине цепи. Нейтральные жиры, содержащие остатки только насыщенных жирных кислот, при комнатной температуре имеют твердую консистенцию, например, говяжий жир содержит три остатка стеариновой кислоты, а сливочное масло представляет собой смесь триацилглицеролов, причем в состав некоторых из них входят жирные кислоты с короткими цепями, что приводит к снижению температуры плавления. Жиры хорошо растворяются в неполярных растворителях, таких как хлороформ, бензол или эфир, и эти растворители обычно используют для выделения жиров. В окружающей среде липиды разрушаются под действием фермента липазы ( Ленинджер , 1985). Липазы катализируют гидролиз триацилглицеролов на свободные жирные кислоты и глицерол, участвуют в различных реакциях этерификации при наличии незначительного количества воды и часто при наличии органических растворителей. Продуцируются многими микроорганизмами, растениями и животными ( Palacios et al. , 2014).

Материалы и методы

В работе проведено исследование трех липаз, гидролизирующих субстраты с различной длиной углеродной цепи: липаза С4 (субстрат 4-нитрофенил бутират), С16 (субстрат 4-нитрофенил пальмитат) и С18 (субстрат 4-нитрофенил стеарат). Исходя из классификации, ферменты, разрушающие субстраты, состоящие из низших жирных кислот (меньше шести атомов углерода), относятся к эстеразам, тогда как к «истинным» липазам (специфический вид эстераз) относятся ферменты, гидролизующие водно-нерастворимые субстраты, такие как триглицериды (жиры), состоящие из длинноцепочечных высших жирных кислот ( Casas-Godoy et al ., 2012).

4-нитрофенил бутират – производное масляной кислоты. Встречается в естественном виде в природе, содержится в коровьем масле, в выделениях животных, является продуктом жизнедеятельности некоторых анаэробных микроорганизмов, в том числе обитающих в кишечнике человека.

4-нитрофенил пальмитат – производное пальмитиновой кислоты. Наиболее распространенная в природе жирная кислота, входит в состав глицеридов большинства животных жиров и растительных масел. Пальмитиновая кислота составляет 27–30 % свиного жира, 24–29 % говяжьего жира, 23–30 % бараньего жира и 20–36 % молочного жира от массы всех жиров данных продуктов.

4-нитрофенил стеарат – производное стеариновой кислоты. Также одна из наиболее распространенных в природе жирных кислот, входит в состав триглицеридов жиров животного происхождения. Содержание стеариновой кислоты в животных жирах максимально в бараньем жире (до 30 %).

Таким образом, на исходное присутствие жиров в сосудах с большой вероятностью будет указывать высокая активность липаз С16 и С18. Активность липазы С4 принято рассматривать в качестве индикатора микробной биомассы в почве ( Kähkönen et al. , 2001).

Ферментативную активность определяли микропланшетным методом с использованием хромогенно меченных субстратов на основе соединения 4-нитрофенол ( Deng et al. , 2013; Margenot et al. , 2018). Краткое описание метода: к 0,5 г грунта приливали 60 мл воды. Встряхивали 30 минут на магнитной качалке при скорости 600 об/мин. Раскапали в планшеты 50 мкл раствора модифицированного универсального буфера (рН = 7,0). В планшет к буферу прилили 100 мкл почвенной суспензии и инкубировали один час в термостате при 37 °С. После инкубации к почвенной суспензии добавили субстрат и инкубировали 15 минут. Субстраты для липазы готовили в диметилсульфоксиде с добавлением тритона Х-100. Оптимальную концентрацию субстратов подбирали экспериментально. Параллельно ставили контрольные пробы: почва с диметилсульфоксидом и субстрат без почвы. Определение проводили с восьмикратным повторением. Оптическую плотность измеряли на планшетном ридере xMark фирмы Bio-Rad при длине волны 410 нм. Ферментативную активность выражали в нмоль 4-нитрофенола/г почвы в минуту.

Проанализирована активность липаз почвенно-грунтовых образцов из сосудов следующих курганных могильников: Октябрьский I, Киевский I (Республика Северная Осетия – Алания) и Братские 1-е курганы, (Чеченская Республика) III – первой половины V в. н. э. (аланская культура).

Образцы грунта для анализа отбирались из нижней части заполнения нижеперечисленных сосудов (рис. 1) (в скобках указаны номера сосудов на рис. 3):

– кружки: могильник Братские 1-е курганы, курганы № 1452 ( 1 ) и № 60 ( 2 ); могильник Киевский I, курган № 1063 ( 3 ); могильник Октябрьский I, курганы № 14 ( 4 ) и № 810 ( 5 );

– миски: могильник Октябрьский I, курганы № 14 ( 6 ), 857 ( 7 ) и 863 ( 8 );

– кувшины: могильник Октябрьский I, курганы № 826 ( 9 ), 837 ( 10 ), 838 ( 11 ), 842 ( 12 ) и 849 ( 13 );

– кувшинчики: могильник Киевский I, погребение № 1063 ( 14 ), курган № 683 ( 15 ); могильник Октябрьский I, курганы № 802 ( 16 ), 838 ( 17 ), 842 ( 18 ), 805 ( 19 ), и 861 ( 20 ).

Кроме того, активность липаз измеряли в следующих образцах современных целинных и погребенных почв, а также культурных слоях поселений, а именно:

– чернозем пахотный;

– горно-луговая почва, слой 0–10 см;

Рис. 1. Пример исследованных сосудов а – миска; б – кружка; в – кувшинчик; г – кувшин

– каштановая почва, слой 0–10 см;

– каштановая почва, слой 170–180 см;

– лугово-каштановая почва, слой 0–10 см;

– лугово-каштановая почва, слой 120–130 см;

– солонец погребенный;

– культурный слой поселения Мешоко (VI тыс. до н. э., Республика Адыгея);

– культурный слой поселения Кушман (XII–XIII вв., Республика Удмуртия).

Исследование ферментативной активности в данных образцах проводили в целях изучения особенностей состояния липаз в почвах и культурных слоях и получения общих представлений о масштабах варьирования этого показателя в почвах.

Для изучения особенностей разложения органических материалов и возможности применения выявленных закономерностей к археологическим объектам был заложен долгосрочный модельный эксперимент, в котором исследована динамика разложения микробными сообществами почвы (чернозем) материалов белковой, липидной и полисахаридной природы. Модельный эксперимент включал девять вариантов: крахмал, шерсть, мясо, сливочное масло, жиры говяжий, свиной и бараний, оливковое масло, а также контрольная почва без добавок. Количество вносимого субстрата в жировые варианты было уравновешено по содержанию пальмитиновой кислоты. Образцы почвы размещали в полиэтиленовые боксы и инкубировали в термостате при 25 °С, при этом постоянно контролировали влажность. Определяли активность липаз С4, С16 и С18.

Результаты и обсуждение

Почвы и культурные слои поселений. В исследованном ряду фоновых почв максимальная активность всех трех липаз наблюдалась в верхнем горизонте каштановой почвы (К10), разрез которой был заложен на целинном участке под густым травянистым покровом (рис. 2), что обусловливает высокую естественную биогенность почвы. Активность липаз здесь была на уровне 100 нмоль 4-НФ/г почвы в мин. В черноземе пахотном, верхнем слое лугово-каштановой почвы и горно-луговой почве ферментативная активность была близка и достоверно не различалась между почвами. В небиогенных почвах максимальные значения липазной активности были следующими: для липазы С4 – 60 нмоль/г почвы в мин. в каштановой почве, слое 170–180 см, для липаз С16 и С18 – 30 нмоль/г почвы в мин. в лугово-каштановой почве, слое 120–130 см. В культурных слоях ферментативная активность была ниже, чем в естественных почвах, однако в культурном слое энеолитического укрепления Мешоко (КС-М), наиболее древнем из исследованных объектов, отмечено увеличение активности липазы С16.

Модельный эксперимент. В эксперименте активность липазы С4 различалась несущественно между вариантами (рис. 4). Однако в отношении липаз С16 и С18 было выявлено заметное увеличение в вариантах с бараньим и говяжьим жиром – в более чем 13–15 раз по сравнению с контрольной почвой. Варианты со сливочном маслом, свиным жиром и оливковым маслом превышали контрольную почву в 4–5 раз. Таким образом, из полученных данных по изучению разложения жировых субстратов следует, что наиболее информативными ферментами для выявления липидов являются липазы С16 и С18, причем с наибольшей вероятностью они могут быть использованы для выявления животных жиров, а именно бараньего и говяжьего жира.

НИРМ а 14311011 Л/ФН-^ 4LT0PMH

ним а навои j/on-f чкомн

Сосуды из погребений. Липазная активность была выявлена во всех изученных сосудах, однако ее уровень существенно варьировал. Кроме того, не во всех случаях выявлялась активность всех трех липаз (рис. 3). По-видимому, незначительная липазная активность всегда будет обнаруживаться на определенном фоновом уровне, и только по существенному ее возрастанию можно делать вывод о присутствии жиросодержащих субстратов в сосуде в прошлом. Из 20 изученных нами сосудов можно выделить только кружку из погребального комплекса Братские 1-е курганы, курган 1452, где сумма активности трех липаз составила 216 нмоль/г почвы в мин., затем кружки могильника Октябрьский I, курганы 14 и 810 (95 и 115 нмоль/г почвы в мин. соответственно), а также кувшинчик из кургана 805. В остальных же сосудах суммарная липазная активность варьировала в пределах от 5 до 50 нмоль/г почвы в мин. Здесь может быть две причины: либо липазная активность не сохранилась до наших дней, либо эти сосуды не были заполнены ритуальной пищей. В целом на уровне тенденции можно говорить о том, что исходно жирную пищу помещали в маленькие сосуды – в первую очередь это кружки и, возможно, кувшинчики.

Таким образом, предлагаемый нами новый метод выявления жира на основе изучения продуктов по их микробиологической трансформации, а именно ферментов в почвенно-грунтовом материале, позволил достоверно выявить сосуды, исходно содержащие жиры. В первую очередь это относится к образцам грунта из кружек. В соответствии с результатами модельного эксперимента более вероятно выявление жиров животного происхождения.

Уровень ферментативной активности в почве прямо зависит от количества поступающего субстрата, в разложении которого они участвуют. После разложения органических остатков в почве формируется ферментный пул, который может сохраняться на протяжении длительного периода времени. Однако при отсутствии поступления свежего жиросодержащего материала уровень активности фермента может постепенно снижаться. В случае с горшками, исследованными в рамках данной работы, время пребывания липаз в нефункциональном состоянии составило более полутора тысяч лет, что неизбежно сказалось на активности ферментов. Поэтому, если в грунте из погребального горшка мы наблюдаем активность фермента липазы на уровне верхних биогенных горизонтов современной почвы, мы можем с высокой степенью достоверности говорить об исходном присутствии жира в данном сосуде. Преимуществом данного метода выявления жира по сравнению с уже традиционными методами газовой хроматографии и масс-спектрометрии является его простота и возможность анализировать большое количество образцов в короткие сроки.