Микробиология загрязненных соединениями азота почв

Введение. Эксплуатация ракетной техники является многофункциональным и сложным процессом, связанным с использованием химически опасных веществ и материалов [1].

В настоящее время на фазе предстартовой подготовки ракет разработаны эффективные мероприятия, позволяющие существенно снизить экологическую нагрузку на окружающую среду [2]. Например, процессы нейтрализации паров и жидкой фазы окислителя с помощью поглотителей, дожигание горючего в специальных аппаратах и т. д. Несмотря на это, в процессе ликвидации военных объектов неоднократно могли происходить аварии [3]. Серьезной экологической проблемой является слив из ракет и специальных емкостей несимметричного диметилгидра-зина (НДМГ) и азотной кислоты (АК) при выводе их из эксплуатации. Извлечение всего объема топлива и окислителя – технологически сложный и опасный процесс [4]. В связи с этим возникает необходимость проведения экологических исследований в области воздействия объектов ракетно-космической техники (РКТ) на природную среду, которые могли бы дать объективную информацию о масштабах и интенсивности этого воздействия [5]. Одним из факторов такого воздействия является попадание в почву окислителя – тетраоксида азота [6].

На сегодняшний день существует множество способов определения химического загрязнения почвы [7]. Самым распространенным и универсальным по праву считается метод биотестирования [8]. Большинство животных, растений, микроорганизмов однозначно реагируют на наличие загрязнения в окружающей их среде [9]. Для определения загрязненности почвенного покрова можно использовать бактерии, находящиеся в нем [10].

Микробиологические показатели почвы являются основными индикаторами уровня загрязнения. Приняв за показатель загрязненности грунта количество колоний, можно судить о наличии отсутствия антропогенного загрязнения в почвенном покрове.

Целью исследования является проведение микробиологического анализа почвы и выявление загрязненных участков на исследуемом объекте, определение зон для последующей рекультивации.

Объект и методы исследований. Объектом исследования является почвенный покров и его микробные сообщества на территории хранилища КРТ, расположенного на бывшем месте дислокации воинской части в районе поселка Кедровый Емельяновского района Красноярского края (рис. 1).

Летом 2017 года на исследуемом объекте было выбрано 13 пробных площадок размером 2×2 м [11]. Площадки выбирались с учетом видимых проливов на поверхности почвы вблизи технических сооружений. Для контроля выбрана площадка на удалении трех километров от исследуемого объекта. Точечные пробы отбирали на пробных площадках из слоя 0–20 см методом конверта (рис. 2).

Рис. 1. Хранилище окислителя (фото авторов)

• Fig. 1.    Fuel storage (photo of the authors)

  

  Рис. 2. Схема зоны хранения КРТ (цифрами обозначены точки отбора проб)

  
  

• Fig. 2.    Diagram of storage areas of KRT (the numbers marked by the sampling points)

Объединенные пробы составили путем смешивания 5 точечных проб, отобранных на одной пробной площадке. Наличие химических опасных веществ в почве определяли с помощью ВПХР. Для выявления уровня загрязнения использовали индикаторные трубки «ИТ-Г1», «ИТ-АК». В лабораторных условиях определяли численность микроорганизмов различных эколого-трофических групп [12]. Выделение микроорганизмов проводили стандартными методами рассева на поверхность агаризованной питательной среды [13]. В качестве питательных сред использовали следующие среды: для выделения аммонифицирующих бактерий – ПД-агар (пептон ферментативный, сухой для бактериологических целей – 9,0 гл, гидролизат казеина ферментативный, неглубокой степени расщепления – 8,0 гл, дрожжевой экстракт – 3,0 гл, хлорид натрия – 5,0 гл, натрий гидроортофосфат – 2,0 гл, агар микробиологический – 20 гл, pH = 7,0–7,2); для выделения гетеротрофных бактерий, усваивающих минеральный азот, – модифицированную среду Чапека (глюкоза – 20,0 гл, NH₄NO₃ – 2,0 гл, KH₂PO₄ – 0,5 гл, MgSO 4 *7H 2 O – 0,5 гл, КСl – 0,5 гл, FeSO 4 * 7H 2 O – 0,01 гл, агар микробиологический – 20,0 гл, вода – 1000 мл, pH = 7,0–7,2); для выделения олиготрофных бактерий – среду для выделения олиготрофов (50 мл ПД-агара + 50 мл модифицированной среды Чапека на 1 л среды). Численность микроорганизмов определяли стандартным методом высева из серийных разведений суспензии на поверхность питательного агара [14; 15]. Численность выражали в колониеобразующих единицах (КОЕ) на вес сухой почвы. Математическую обработку результатов проводили стандартными методами с использованием пакета анализа MS Excel и StatSoft STATISTICA 6.0 [16].

Результаты исследования. По результатам исследований на изучаемой территории выделены два участка: участок № 1 слива и хранения КРТ и участок № 2 нейтрализации и очистки стоков.

На участке № 1 расположены сооружения № 1 «Хранилище НДМГ» и сооружение № 2 «Хранилище азотной кислоты», в сооружениях расположены емкости и сливно-наливные устройства. На участке № 2 расположены сооружение № 2 «Станция очистки», сооружение № 3 «Специальная лаборатория», сооружение № 5 «Станция нейтрализации». В ходе ликвидации базы хранения КРТ при сливно-наливных операциях и нейтрализации технических средств хранения, перекачки и транспортирования произошли технологические проливы топлива. На участке № 1 присутствует резкий неприятный запах, имеются видимые маслянистые пятна на поверхности почвы, которые свидетельствуют о химическом загрязнении почвы. В ходе естественной миграции последствия пролива КРТ ярко выражены вблизи сооружений № 1, 4.

По результатам проведённых анализов микробиологические показатели почвы изученной территории варьировали в широких пределах. Численность бактерий изучаемых эколого-трофических групп и размах варьирования этих численностей превышал аналогичные показатели для почв региона по данным А. В. Богородской и О. А. Сорокиной (табл. 1).

Так, в почвенных образцах, взятых с участка № 1, преобладают бактерии, усваивающие минеральный азот, их количесство по сравнению с показателями почв региона превышено в 160 раз по данным О. А. Сорокиной. Также отмечено значительное превышение амоннификаторов и олиготрофов. Обращает на себя внимание существенно меньшая доля олиго-трофов и амоннификаторов по отношению к бактериям, усваивающим минеральный азот.

На участке № 2 преобладают олиготрофные бактерии, и их количество превышает показатели по региону (данные О. А. Сорокиной) более чем в 100 раз. Данный вид микроорганизмов характерен для почв с бедным содержанием азота. Отмечена меньшая доля аммонификаторов и бактерий, усваивающих минеральный азот, по сравнению с олиготрофами. Повышенное содержание аммонификаторов обусловлено процессом разложения микроорганизмами азотсодержащих органических соединений.

Возможно предположить, что вблизи с хранилищем азотной кислоты имелись аварийные проливы, что способствовало притоку в почву большого количества азота и повышению численности микробиоты.

Многочисленными исследованиями доказано, что умеренное загрязнение КРТ приводит к увеличению численности и метаболической активности почвенных бактерий.

Это увеличение обусловлено способностью ряда почвенных микроорганизмов использовать азот в качестве источника энергии. Продуцируемая бактериями, усваивающими минеральный азот, биомасса в свою очередь может служить субстратом для других групп микроорганизмов.

В ходе статистической обработки результатов, полученных в эксперименте, было выявлено отсутствие значимых отличий между бактериями, усваивающими минеральный азот, и олиготрофными бактериями, p > 0,05. При проецировании на оси дискриминации, в свою очередь, был обнаружен общий кластер, состоящий из данных, полученных с участков под номерами 1, 2, 4, что привело к изменению группи- ровки путем объединения микробиологических показателей данных участков в общий кластер. Таким образом, был определен общий кластер с большей статистической значимостью, при этом колонии, высеянные на среду Чапека, не являются статистически значимыми.

Для дальнейших исследований исключили эту среду из расчета. Повторно проведя дискриминантный анализ, получили статистически значимое отклонение от контрольного образца p < 0,02. На рис. 3 показаны проекции данных изучаемых образцов, отнесенных к различным территориальным группам, на оси дискриминации. Несмотря на отсутствие статистически значимых различий между микробными комплексами территории хранения КРТ и прилегающей территории, из проекции видно, что эти комплексы образуют два обособленных кластера.

В данном случае статистически значимые различия прослеживаются у аммонифицирующих бактерий и олиготрофных бактерий, p < 0,05. Отмечается повышенное количество микроорганизмов, усваивающих минеральный азот, в почвенных образцах № 5–6. Снижение численности микроорганизмов отмечены в пробах № 1, 4, 8–10.

Известно, что ракетное топливо является достаточно реакционно-способным веществом, при окислении которого образуется целый ряд веществ, оказывающих негативное влияние на биоту. Существенный разброс микробиологических показателей между разными площадками может быть связан с разным уровнем загрязнения. Максимальная антропогенная нагрузка выявлена на пробных площадках № 5, 6. Результаты измерений, полученные с помощью ВПХР, подтверждают опасные концентрации НДМГ и азотной кислоты в почве (табл. 2).

Таблица 1

Пределы варьирования состава микробных комплексов изучаемого участка в сравнении с почвенными микробными комплексами региона, тыс. КОЕ/г

Показатель	Бактерии, усваивающие минеральный азот	Аммонификаторы	Олиготрофы	Сумма
Участок слива и хранения КРТ № 1
Минимум	1000	1000	3000	5000
Максимум	425000	112000	201000	738000
Участок нейтрализации и очистки стоков № 2
Минимум	1000	3000	32000	36000
Максимум	22000	76000	201000	299000
Почвы сосновых лесов Средней Сибири (по данным А. В. Богородской)
Минимум	456	300	717	1473
Максимум	8074	7227	13651	28952
Почвы красноярской лесостепи (по данным О. А. Сорокиной)
Минимум	1714	700	1376	4304
Максимум	2643	1500	1890	5523

Root 1

Рис. 3. Проекции данных с изучаемых участков на оси дискриминации

• Fig. 3.    Projections of data from the studied areas on the axis of discrimination

Таблица 2

Результаты измерений ВПХР на наличие КРТ в почве по окраске индикаторных трубок ИТ-Г1, ИТ-АК, мг/л

№ точки отбора проб	Концентрация		Уровень опасности
	НДМГ	АК	НДМГ	АК
1	0,001	0,01	Опасно	Малоопасно
2	0,0001	0,02	Малоопасно	Малоопасно
3	0,0001	0,001	Малоопасно	Малоопасно
4	0,001	0,001	Опасно	Малоопасно
5	0,0001	9	Малоопасно	Очень опасно
6	0,0001	10	Малоопасно	Очень опасно
7	0,0001	0,1	Малоопасно	Опасно
8	0,001	0,2	Опасно	Опасно
9	0,0001	0,001	Малоопасно	Малоопасно
10	0,0001	0,001	Малоопасно	Малоопасно
11	0,0001	0,001	Малоопасно	Малоопасно
12	0,0001	0,001	Малоопасно	Малоопасно
13	0,0001	0,005	Малоопасно	Малоопасно
14 контроль	Индикаторная окраска отсутствует, «Не опасно»

Полученные результаты показали очень опасные концентрации азотной кислоты в пробах № 5, 6, взятых вблизи хранилищ НДМГ и АК. Проба № 8 содержит опасные концентрации по обоим оцениваемым параметрам, что, возможно, связано с топографическими особенностями местности.

Экспресс-анализ почвенных образцов однозначно указывает на то, что участок № 1, где непосредственно хранились КРТ, является наиболее загрязненным, с максимальным содержанием НДМГ и АК. Стоит также обратить внимание на высокие концентрации НДМГ в пробах № 1, 4.

Заключение.

• 1.    После ликвидации специального объекта из-за попадания в почву значительного количества КРТ сложилась неблагоприятная экологическая обстановка, что нашло своё отражение в сохранении высокого уровня фитотоксичности грунта вблизи сооружений для хранения НДМГ и АК.

• 2.    Математическая обработка показала статистически значимые отличия микробных комплексов исследуемого объекта от микробных комплексов лесов и лесостепей региона, что свидетельствует об экосистемном

• 3.    Максимальная антропогенная нагрузка на окружающую среду отмечена на участке слива и хранения КРТ, высокие концентрации НДМГ отмечены в пробах № 1, 4, 8; азотной кислоты – в пробах № 5, 6.

• 4.    Наименьшее загрязнение почвы отмечено на участке нейтрализации и очистки стоков, проба № 9, 10–13, по показаниям ВПХР.

• 5.    По совокупности данных микробиологического исследования и экспресс-анализа почв выявлены конкретные участки, требующие мер усиленной рекультивации, и зоны, в принципе, способные к самореге-нерации с незначительными восстановительными мероприятиями, что непосредственным образом отразится на планировании финансовых затрат при рекультивации данной территории.

нарушении почвенных микробиоценозов изучаемой территории.

Рекомендации:

• 1.    Для ликвидации проливов КРТ рекомендуется проведение мероприятий по рекультивации объекта на основании методики рекультивации грунтов, загрязненных компонентами ракетных топлив, патент РФ № RU 2253520 C1.

• 2.    Для проведения рекультивации рекомендуется разделить территорию на две зоны: первая зона активной рекультивации – вблизи сооружений для хранения КРТ № 1, 4; вторая зона частичной рекультивации – вблизи сооружений нейтрализации и очистки стоков № 2, 3, 5.