Микробное разнообразие в глинисто-солевых шламах калийного предприятия (г. Березники, Пермский край)

Автор: Корсакова Е.С., Шестакова Е.А., Одинцова Т.А., Бачурин Б.А., Плотникова Е.Г.

Журнал: Вестник Пермского университета. Серия: Биология @vestnik-psu-bio

Статья в выпуске: 1, 2017 года.

Бесплатный доступ

Из глинисто-солевых шламов предприятия БКПРУ-2 ПАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край) выделено 138 штаммов бактерий, которые на основании морфологических и генетических особенностей были объединены в 28 морфогеномогрупп. Представители каждой группы были идентифицированы на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, сравни-тельное исследование которых показало принадлежность штаммов к классам Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria и Actinobacteria. Все обнаруженные бактерии являются галотолерантными, т.к. способны к росту на средах без добавления NaCl и с повышенной концентрацией соли (до 150 г/л). Большинство штаммов росли в щелочных условиях (рН 9.0) и использовали в качестве един-ственного источника углерода ряд моно- и полиароматических соединений, в том числе полицик-лические ароматические углеводороды, фталаты.

Еще

Глинисто-солевые шламы, филогенетическое разнообразие, бактерии-деструкторы, аромати-ческие соединения, фталаты

Короткий адрес: https://sciup.org/147204813

IDR: 147204813

Текст научной статьи Микробное разнообразие в глинисто-солевых шламах калийного предприятия (г. Березники, Пермский край)

Верхнекамское месторождение калийно-маг-ниевых и натриевых солей (ВМКМС) Пермского края является одним из крупнейших среди разрабатываемых в мире. В результате деятельности калийных комбинатов предприятий ПАО «Уралкалий» (г. Соликамск и Березники, Пермский край) образуются значительные объемы глинисто-солевых шламов и избыточных рассолов, которые хранятся в специальных гидротехнических сооружениях - шламохранилищах. Формирование состава шламов определяется, в первую очередь, составом добываемого сырья, а также технологическими факторами последующей рудоподготовки и обогащения, что обусловливает присутствие в них, наряду7 с легкорастворимыми хлоридными минералами, широкого спектра тяжелых металлов и органических соединений [Бачурин, Одинцова, 2009]. Основным источником последних являются используемые технологические химические реагенты и продукты их трансформации, главными вещест ве Корсакова Е. С. Шестакова Е. А., Одинцова Т. А., Бачурин Б. А., Плотникова Е. Г., 2017

вами преобразования которых являются полиэток-сильные соединения (полигликоли, полиоксиалканолы и ИХ эфиры, диоксоланы, диоксаны И Др.)к гетероциклы углеводородные структуры. включая полициклическую ароматику7 и фталаты [Бачурин. 2008: Бачурин, Одинцова, Первова. 2014].

По результатам эколого-геохимических исследований было обнаружено, что аккумулированные в глинисто-солевых шламах органические поллютанты служат мощными источниками 'загрязнения природных экосистем благодаря их высокой геохимической подвижности и могут рассматриваться как потенциальные вторичные источники контаминации гидросферы - высвобождение их из связанного состояния может происходить при выщелачивании отходов атмосферными осадками [Бачурин, Одинцова, 2006; Бачурин, 2012; Бачурин, Сметанников, Хохрякова, 2014]. В связи с этим при такой комплексной нагрузке абиотических факторов на территории шламохра-нилищ возникают условия для формирования уникальных сообществ галофильных и галотолерангных микроорганизмов, в том числе способных разлагать экотоксиканты.

Ранее из шламов района солеразработок ВМКМС были выделены и охарактеризованы бак- терии-дестру кторы полицикли ческих ароматических углеводородов и фталатов родов Rhodococ-cus^ Pseudomonas, Arthrobacter, Bacillus [Плотникова и др.. 200 L 2 011; Ястребова и др., 2009: Пастухова и др., 2010: Корсакова, Пьянкова. Плотникова. 2013; Кандаурова, Ястребова, Плотникова. 2016]. Описаны новые таксоны архей и прокариот, выделенные из продуктов флотационного обогащения калийных минералов и техногенных вод шла мохра нилища П АО « Ура лка лий» [ Реутских, Сара лов. 2012: Саралов и др.. 2012а. 20126; Saratov et al., 2013].

Цель настоящей работы - изучение бактериального сообщества глинисто-солевых шламов калийного предприятия БКПРУ-2 ПАО «Уралкалий» в г. Березники (Пермский край).

Материалы и методы исследования

Образцы шламов. В качестве материала для исследования были выбраны пять образцов, отобранных из шла мохра нилища калийного предприятия БКПРУ-2 ПАО «Уралкалий» (г. Березники) (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика образцов глинисто-солевых шламов

№ образца шлама	Регистрационный №	Точка отбора, глубина отбора	Минерализация, мг/кг	ХБА\ мг/кг	Н1Г\ мг/кг
1	219/1	И [дам из шурфа № 1, о.3 м	2641MJ	902.5	312.5
2	220/2	Шлам из шурфа № 1, 0.5 м	26400	817.5	265.0
3	221/3	Шлам из шурфа № 2, 0,2 м	22650	932.5	340.0
4	222/4	Шлам из шурфа № 3. 0.2 м	35800	1111.0	349.0
5	222/5	11 [лам из шурфа Яо 3, 0.4 м	43000	но/**	но.

Примечание. ХБА - хлороформенный битумоид (компонент органического вещества, извлекаемый из горной породы органическим растворителем - хлороформом, без предварительной обработки соляной кисло гой). НП -нефтепродукты; и,о, - не определяли [Бачурин, Одинцова, 2009],

Для выделения и роста микроорганизмов была использована минеральная среда Раймонда (МСР) (Raymond, 1961) с добавлением NaCl (50 г/л). Агаризованные среды получали при добавлении агара («Sigma». США) в концентрации 15 г/л. Для приготовления богатой среды Раймонда (Б СР) в МСР добавляли 5 г/л триптона («Fluka», США) и 2.5 г/л дрожжевого экстракта («Difco», США) в качестве ростовых субстратов

Микробиологический анализ образцов шламов проводили общепринятыми методами посева почвенной суспензии на агаризованную БСР с последующим подсчетом колоний микроорганизмов (колониеобразующих единиц, КОЕ) и выделением бактерий из единичных колоний для идентификации [Методы ..., 1991]. Биоразнообразие и плотность видов бактерий -деструкторов оценивали с помощью индексов Шеннона-Уивера. Симпсона и Менхиника. используя дифференцированный подсчет колоний, принадле жащих к разным морфо(геномо)типам [Широких и др.. 2013; Орлова, 2013].

Способность бактерий разлагать ароматические углеводороды оценивали путем культивирования на агаризованной МСР (30 г/л NaCl) при 28°С с добавлением моно( полихроматических углеводородов («Fluka», США) в качестве единственного источника углерода и энергии. Нафталин, бифенил, бензол, толуол, фенол и дибутилфталат помещали на крышку перевернутой чашки Петри; орто- фталевую кислоту (у-ФК), бензойную (БК), цйрт-гидроксибензойную кислоты (ПГБК) вносили в среду до конечной концентрации 1 г/л, салициловую кислоту⁷ - до 0.5 г/л. Рост колоний бактерий на агаризованных средах с углеводородами оценивали по сравнению с ростом на агаризованных средах того же состава без субстратов (контрольный вариант). Колонии диаметром менее 1 мм оценивали как «+». 1-2 мм - «++», более 3 мм - «+++».

Рост микроорганизмов при изменении осмолярности среды. Изучение устойчивости микроорганизмов к NaCl (0-200 г/л) проводили на ага-ризованной среде БСР. оценивая размер выросших колоний.

Рост при разных значениях pH определяли при концентрации Na' 0.8-0.85 М в буферных системах, приготовленных на основе БСР. Штаммы культивировались на чашках Петри на агаризо-ванной среде при pH 5.0, 6.0, 7.0. 8.0, 9.0. Рост учитывали на седьмой день культивирования [Герхардт и др.. 1983].

Рост при разных температурах. Штаммы культивировали на агаризованной БСР (30 г/л NaCl) при 10, 20. 28. 37 и 45°С. Рост учитывали на седьмой день культивирования.

ДНК-тонирование полученных бактериальных изолятов проводили методом ВОХ-ПЦР (полимеразная цепная реакция повторяющихся ВОХ-элементов) с использованием праймера BOXA1R (5 -CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’) в соответствии с методикой [Versalovic et al, 1994]. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1.5%-ном агарозном геле на 1 х ТВЕ буфере (89 мМ Трис-НО, 89 мМ борная кислота. 2,5 мМ ЭДТА, pH 8.2) в течение 2 ч. при напряжённости электрического поля 5.7 V/см и анализировали полученные фрагменты.

Филогенетический анализ полученных изо-лятов был основан на определении нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК с применением набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Se quencing Kit на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 3500XL («Applied Biosystems», США) в Пермском государственном национальном исследовательском университете (кафедра ботаники и генетики растений). Полученные нуклеотидные последовательности были проанализированы с использованием программ CLUSTAL W, Sequence Scanner v. 2.0. Mega v. 7.0. Поиск гомологичных последовательностей проводили по базам данных GenBank и EzTaxon (http://www. .

Результаты и их обсуждение

Методом прямого высева на агаризованную БСР с содержанием 50 г/л NaCl из образцов шламов было выделено 138 штаммов бактерий. Отбор осуществлялся на основе различий в морфологии колоний микроорганизмов, растущих на агаризованной среде. В результате были сформированы 34 морфологические группы, представители которых были взяты для проведения дальнейших исследований.

Проведена сравнительная характеристика представителей наиболее сходных морфогрупп с применением метода ВОХ-ПЦР. Анализ полученных ВОХ-ПЦР профилей фрагментов геномной ДНК исследуемых бактерий показал, что 22 штамма, близких по морфологическим признакам, принадлежат к 16 геномогруппам (рис. 1). Согласно полученным результатам, выделенные штаммы бактерий были объединены в 28 морфогеномогрупп, далее обозначенных как репрезентативные операционные таксономические единицы (ОТЕ).

М12345678 9 10 11 М 12 13 14 15 16 17 18 19 20 М 21 22

'—у—' 4—у—'

1 11 111 II 1 IV 1 V VI Vil VIII IX X XI XII XIII XIV XV XIII XVI

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ВОХ-ПЦР штаммов бактерий, изолированных из образцов шламов:

М - маркер O’GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder («Fermentas», Литва), 7 - ВОЮ; 2 - ВОН; 3 - ВО 14: 4 - ВО22; 5 - ВО26: 6 - ВО36; 7 - ВО23; 5 - ВО8; 9 - ВОЮ; 10 - ВО34-1; 7 7 - ВО25; 7 2 - ВО9: 13 - ВО20; 14 - ВО35; 75 - ВО13; 16 - ВО27; 17 - ВО28; 719 - ВОЗО; 20 - ВОЗ 1; 21 - ВО 1; 22 - Rhodococcus sp. КТ723 (штамм-деструктор нафталина из рабочей коллекции Лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ИЭГМ УрО РАН)

Была проведена статистическая оценка альфа-разнообразия представленных микробных сообществ с использованием индесов Шеннона-Уивера (придает большее значение уникальным ОТЕ) и Симпсона (общим ОТЕ), показавшая примерно равные показатели биоразнообразия и выравнен-ности сообществ в исследуемых пробах. Однако, согласно проведенному анализу, образец шлама № 5 характеризуется гораздо большим биоразнообразием уникальных ОТЕ по индексу Шеннона-Уивера (Н'=1.316) и меньшим значением общих ОТЕ (D=0.319) при сравнении с пробами № W. Большое количество морфогеномогрупп, низкая численность изолированных бактерий и высокий уровнь минерализации (43000 мг/кг) данной пробы могут быть непосредственно связаны с присутст вием галотолерантных и галофильных форм микроорганизмов (табл. 1). Расчет плотности видов (видового богатства) в сообществе по индексу Менхиника (DMn) показал, что наибольшее значение данного параметра выявлено в образце шлама № 2, в котором, в свою очередь, была обнаружена высокая численность бактерий (7.84 хЮ1) и малое количество представленных морфотипов (табл. 2). Вероятно, что такие особенности связаны с параметрами данной пробы, а именно с отбором с глубины 0.5 м. на котором воздействие неблагоприятных биотических факторов снижается (в том числе вымывание бактерий из образца шлама атмосферными осадками), что обусловливает высокую численность обнаруженных бактерий

Таблица 2

Анализ разнообразия микробных сообществ образцов шламов

Номер образца	Количество ОТЕ	Общая численность бактерий, КОЕ/1 г шлама	Индекс Менхиника (Dwn)	Индекс 111енно-на-Уивсра (1Г)	Индекс Симпсона (D)
1	13	6.35*10°	0.005	0.839	0.463
2	10	7.84*10"	0.011	1.077	0.469
3	15	7.35*10°	0.006	1.047	0.475
4	13	2.72*10°	0.008	0.996	0.482
5	14	2.27*10°	0 009	1.316	0.319

В результате сравнения последовательностей гена 16S рРНК (у 28 изолятов. представителей каждой морфогеномогруппы) с типовыми видами из базы данных EzTaxon (http://www.ezbiocloud. net) установлено, что 7 культур являются представителями класса Bacilli, 8 штаммов относятся к классу

Crnnmuproteobcctenck 11 штаммов - к классу А cli-nobacteria и 2 штамма - к классу' Alphaproteobac-lena. Уровень сходства 16S рДНК изолятов с типовыми штаммами узаконенных видов находился в пределах 98.1-100% (табл. 3).

Таблица 3

Анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изолированных бактерий

№ штамма	Типовой штамм	№ GenBank	Сходство, %	Количество нуклеотдов
ВО1	Rhodococcus wradslaviensisMCMB 13082^т	Z37138	99.9	800
ВО2	Rhodococcus fascians DSM 20669^т	X79186	100	819
ВОЗ	Bacillus pumilus ATCC 7061^T	ABRX01000007	99.9	1426
ВО4	Bacillusfmrms NCIMB 9366^T	X60616	99.3	908
ВОЗ	Bacillus thiiringiensis AICC 10792¹	ACNF01000156	100	915
ВО6	Bacillus safens is РО-ОЗбЬ¹	AF234854	99.9	935
BOS	Pseudomonas xanthomarina KMM 1447¹	.ABI 76954	987	1401
ВО9	Dietzia mans DSM 43672¹	X79290	99 8	904
BOI 1	Pseudomonas xanthomarina KMM I447¹	AB 176954	990	1434
BOIS	Stenotrophomonas maltophiho ATCC 13637¹	AB008509	100	930
BOIS	Bacillus safensis FO-ОЗбЬ¹	AF234854	100	923
BO19	ArthrobacTer oxydans DSM 20119¹	X83408	100	1233
BO20	DiOzia mans DSM 43672¹	X79290	99.9	887
BO21	Anhrobacter oxydans DSM 20119¹	X83408	99.2	1388
BO22	Pseudomonas xanthomanna KMM 1447¹	AB 176954	99.0	1438
BO23	Pseudomonas xanthomarbta KMM 1447¹	AB 176954	99.2	1404
BO24	Pseudomonas xauthomanna KMM 1447¹	AB 176954	99.2	1421
BO25	Arthrobacter nicotianae DSM 20123^T	X80739	99.1	1387
BO27	Stenotrophomonas maiiophdia ATCC 13637¹	AB008509	99.2	769
BO28	Paracoccus beibnensrs ЛЛ’1284^Т	EU65OI96	98.1	1330
возо	Paracoccus beibnensis JI Л 1284^T	EU650196	98.2	1330
BO32	Pseudomonas mon lei Id CIP 104883^T	AF064458	99.5	927
возз	Bacillus vietnamensis 15-l^T	AB099708	99.0	604

Окончание табл. 3

№ штамма	Типовой штамм	№ GenBank	Сходство, %	Количество нуклеотидов
ВО34-1	Arthrobacter oxydems DSM 20119 ¹	X83408	100	1401
ВО35	Kocuria rosea DSM 20447¹	X87756	99 7	972
ВО37	Micrococcus luteus NCTC 2665¹	CP001628	100	414
ВО38	StrepTomyces somaiiensis NBRC 12916¹	AB 184243	100	1392
ВО141	Bacillus plexus IFO 15715¹	AB021185	100	722

Согласно полученным результатам, преимущественным значением среди выделенных бактериальных штаммов обладали представители классов Aciinobacieria и Gammaproieobacteria, а именно -бактерии родов Dietzia (31.77%) и Stenotrophomo-nas (46Л%), соответственно (рис. 2). Что характерно. наибольшим многообразием таксономических групп характеризовались микроорганизмы класса Actinobacteria. среди которых доминирующее положение занимали изоляты, филогенетически близкородственные к бактериям рода Dietzia. Менее многочисленными были бактерии родов Аг-throbactey Кос uh а, Micrococcus, Rhodococcus и Streptomyces (в порядке уменьшения количества КОЕ/1 г шлама).

7, RhodOCOCCHS sp.

«BociHus sp.

’frSfenotrophomcmfis sp.

■ №№ sp.

Arthrobader sp.

Pseudomonas sp.

■ Porncoccus sp.

• Micrococcus sp.

•Streptomyces sp.

* Kocuria sp.

Рис. 2, Относительное содержание различных филогенетических групп (родов) бактерий классов A ct / по ba с ten а ,А Iphaproteob ас teri а.

Bacilli и Gammaproteobacteha

В результате изучения биодеградационных свойств 28 штаммов (представителей сформированных ОТЕ) было выявлено семь наиболее активных штаммов-деструкторов VArthrobacter spp. BOI 9, BO25_t Bacillus spp. BO4, BO33, Kocuria sp. BO35, Paracoccus sp. BO28 и Rhodococcus sp. BOI), обладающих широкой субстратной специфичностью и способных использовать в качестве единственного источника углерода и энергии такие соединения, как нафталин, бифенил, орто- фталевую. бензойную, и^^-гидроксибензойную. салициловую кислоты, а также фенол, толуол и бензол. Стоит отметить, что большинство штаммов росли на моно- и полиароматических соединениях, но были также обнаружены бактерии (штаммы Rhodococcus sp. BOL Dietzia sp. BO9, Arthro-bacter spp. БО25, BO34-1, Bacillus sp. ВОЗЗ). использующие в качестве субстрата широко используемое в химической промышленности, труднораз-лагаемое и токсичное соединение - дибутилфталат (табл. 4).

Кроме того, было установлено, что все изолированные бактериальные культуры способны к росту на агаризованной среде как без добавления NaCl, так и с повышенной концентра дней соли (30-150 г/л), т.с. являются галотолсрантными организмами [Кашнер, 1981]. Среди них присутст-в>ют штаммы, обладающие способностью к росту при особенно высоких концентрациях хлорида натрия -до 150 г/л, а именно спорообразующис бактерии рода Bacillus (табл. 5).

Таблица 4

Рост бактерий на ароматических углеводородах на агаризованной МСР

Штамм	Субстрат
Штамм	Фен.	Бен,	Тол.	Наф,	Биф,	О-ФК	БК	СК	ПГБК	ДБФ
Rhodococcus sp. BOI	+++	++	+	+++	++	+44	+	++	++4	++
Rhodococcus sp. BO2	-	+++	++	++	++	44	+	++	++4	4
Bacillus sp. BO3	+	+	+	+	4	44	+	+	4	+
Bacillus sp. BO4	+++	++	+4	+++	444	+44	++	+++	++	—
Bacillus sp. BO5	+	+	—	+	4	4	—	—	—	—
Bacillus sp. BO6	44	+	+	4	4	44	4	4		—
Pseudomonas sp. BOS	+	++		4	4	4	4	4	4
Dictzia sp. BO9		+	-И-	4	4	+44	4+4	4		++
Pseudomonas sp. BO11	44	++	+	++	++	+44	4+4	++
Stenotrophomouas sp. BO 13	44	+	—	++	++	44	4	++
Bacillus sp. BOIS	4	+	+	++	++	44	4	4
Arthrobacter sp. BOW	44	+	+	++	4	+44	++	++	++
Dietzia sp, BO20	44	++	+	4	4		4+4	++		4
Arthrobacter sp. BO21	44	++	+	4	44	4	4+4	4+	4+	—

Окончание табл. 4

Штамм	Субстрат
Штамм	Фен.	Бен,	Тол.	Наф.	Биф.	о-ФК	БК	СК	ПГБК	ДБФ
Pseudomonas sp. БО22	++		—	+	++	+4-	+	++	+	—
Рдегк/утунил’ sp. BO23	+	++	—	++	++	—	+++	+	+	—
Pseudomonas sp. BO24	+	++	—	4-4-	4-	—	+4-4-	4+	+	—
Arthrobacter sp. BO25	+++	+++	+++	+++	++4-	+4-	+++	++	+++	+++
Sfenotraphomonas sp. BO27	-н-	++	+	4-	4-	4-	+	+	+	—
Paracoccus sp. B02S	+++	+++	+	-Н-	-Н-	+4-	4-Н-	4-Н-	+	+
Paracoccus sp. BO 30	+	+	+	4-	+	4-		+	+	—
Pseudomonas sp. BO32	-н-	++		-Н-	-Н-	4-	+	+	4-Н-	—
Bad Hus sp. BO33	-н-	+++	+	4-	4-	-Н-	+	+	+	+++
Arthrobacter sp. BO34-1	—	+		4-	-Н-	+4-	+	+	4-Н-	+++
Коси ria sp, BO35	+++	++	++	-Н-	-Н-	+4-	+	+	+	—
Micrococcus sp, BO37	+++	+		-Н-	-Н-	+4-	+	+	+	—
Streptomvces sp, B03S	+++	+		-Н-	-Н-	+4-	4-Н-	++	-н-	—
Bacillus sp. BO141	++	—	—	4-4-	-НН-	4-Н-	++	++	-н-	—

Примечание. Фен. - фенол; Бен. - бензол; Тол. - толуол; Наф. - нафталин; Биф. - бифенил; о-ФК - орто- фталевая кислота; БК - бензойная кислота; СК - салициловая кислота; ПГБК - нстрл-гидрокеибензойная кислота; ДБФ - дибутил фталат.

Таблица 5

Рост бактерий в присутствии различных концентраций NaCl

Штамм	Концентрация NaCl (г/л)_} среда БСР
Штамм	Без NaCl	30	50	60	70	S0	90	100	120	150
Rhodococcus sp. BOI	+++	+++	+++	+++	+++	++	++	+
Rhodococcus sp. BO2	++	+++	+	+	—	-	—	—	-	-
Bacillus sp. BO3	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+
Bacillus sp. BO4	+++	+++	+++	+++	++	++	+	++	+	-
Bacillus sp. BO 5	+++	+++	+++	+++	+	-	—	—	-	-
Bacillus sp. BOO	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	++	+
Pseudomonas sp. BOS	+++	+++	++	+	+	+	+	—	-	-
Dietzia sp. BO9	+	4-Н-	++	++	4-Н-	+	+	—
Pseudomonas sp. BO 11	-НН-	4-Н-	-НН-	-НН-	+4	4-4	+	+
Stenotrophomonas sp. BO13	-НН-	4-Н-	-нн-	+	+	+	+	—
Bacillus sp. BOIS	-НН-	4-Н-	-нн-	-нн-	4-Н-	4-Н-	4-Н-	4-Н-	-НН-	+
Arthrobacter sp. BO 19	-НН-	4-Н-	++	+	+	+	+	—
Dietzia sp BO20	4-	4-Н-	-н-	-н-	+	+	+	—
Arthrobacter sp. BO2 1	-нн-	4-Н-	++	+				—
Pseudomonas sp, BO22	-н-	4-Н-	++	++	+	+	+	—
Pseudomonas sp, BO23	-н-	4-Н-	++	++	+4	4-4	+	+
Pseudomonas sp, BO24	-н-	4-Н-	++	++	+4	4-4	+	+
Arthrobacter sp, BO25	-нн-	4-Н-	-нн-	-нн-	4-Н-	4-Н-	4-Н-	4-Н-	4-+	—
Stenotrophomonas sp. BO27	+++	+++	+	—	—	—	—	—	—	—
Patacoccus sp. BO28	+++	+++	++	++	++	+	+	—	—	—
Paracoccus sp. BO30	+++	+++	+	+	—	-	—	—	-
Pseudomonas sp, BO32	+++	+++	++	+	—	-	—	—	-
Bacillus sp, BO33	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+
Arthrobacter sp. BO34-1	+++	+++	++	+	—	-	—	—	-	-
Kocuria sp. BO35	+++	+++	+++	+++	+++	++	+	+	-	-
Micrococcus sp. BO37	+++	+++	+++	+++	+++	++	+	+	+	-
Streptomvces sp. BO38	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	++	-
Bacillus sp. BO141	+++	+++	+++	+++	+++	++	++	++	++	-

Примечание. «+» - слабый роет, «++» - средний рост; «+++» - хороший рост; «-» - отсутствие роста бактерий,

Также был исследован диапозон роста бактерий при различных значениях pH в среде культивирования и при различной температуре. Установлено, что значительная часть изолятов (Bacillus spp.

ВОЗ? ВО4, ВОЗ, ВО IX, Rhodococcus Sp, ВО2, Arthrobacter sp, BO25, Pseudomonas sp. BO32) способна к эффективному росту при pH среды от 6,0 до 9,0. Штамм Rhodococcus sp. ВО1 характерно- вался ростом в более широком диапазоне значений pH среды (от 5,0 до 9,0).

У ряда исследуемых штаммов (Bacillus spp. ВОЗ. ВО18, ВО141, Pseudomonas spp. BOIL BO14, BO26, Paracoccus sp. ВОЗО и Kocuria sp. BO35) была отмечена способность к росту в диапазоне температур от +10°С до 45°С (с оптимумом роста 28°С). относящая их к термотолерантным микроорганизмам. При температуре ниже 10°С рост культуры не наблюдался или был незначительным.

Интересен тот факт, что среди изолированных бактерий встречаются штаммы, сходные по филогенетическому положению с одним и тем же типовым штаммом бактерий, но отличающиеся по ВОХ-ПЦР профилям фрагментов геномной ДНК. субстратной специфичности, а также способности к росту на средах с различными значениями pH и концентрации NaCL Так, например, выявлено 5 штаммов (ВО8. BOIL ВО22. ВО23. ВО24). которые имеют наибольший процент сходства по нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК с типовым видом Pseudomonas xanthomarina КММ 1447Т. но при этом существенно различаются по утилизации ароматических соединений (табл. 4), а штамм Pseudomonas sp. ВОН может эффективно использовать в качестве единственного источника углерода орто-фталевую кислоту.

Заключение

В результате исследования микробного сообщества образцов глинисто-солевых шламов из шла-мохранилища БКПРУ-2 ПАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край) получены новые данные по филогенетическому разнообразию культивируемых бактерий района Верхнекамского месторождения солей. Выделено 138 штаммов бактерий-деструкторов различных ароматических углеводородов, в том числе фталатов филогенетический анализ показал принадлежность изо лированных штаммов к трем классам: Alphaproteobacteria. Gammaproteobacteria и Actinobacteria: десяти родам: Arthrobacter. Bacillus. Dietzia, Kocuria. M i crococcus, Pa racoccus, Pseudomona s. Rhodococcus, Stenotrophomonas и Streptomyces. При изучении их биодеградационных свойств выявлено семь наиболее активных штаммов-деструкторов, способных использовать в качестве ростового субстрата различные углеводороды: нафталин, бифенил. фенол, толуол и бензол, бензойную . пара -гидроксибензойную, салициловую кислоты, а также ([палаты (орто-фталат, дибутил-фталат), Кроме того, показано, что все изоляты являются галотолерантами (растут в присутствии 100-150 г/л NaCl), а ряд из них - алкалафилами (растут в диапазоне значений pH до 9.0).

Таким образом. установлено, что в районах шламохранилищ сформированы уникальные мик робные сообщества, в состав которых входят солеустойчивые бактерии-деструкторы ароматических соединений, являющихся одними из характерных экотоксикантов отходов калийного производства. Выявленные активные галотолерантные бактерии-деструкторы фталатов, моно(поли)ароматических углеводородов перспективны для дальнейшего изучения и использования при создании новых биотехнологий ремедиации территорий с высокой минерализацией и контаминацией стойкими органическими загрязнителями.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16-44-590968 р_а и Программами УрО РАН «Молекулярная и клеточная биология» (проект №15-4-4-13) и «Фундаментальный базис инновационных технологий оценки, добычи и глубокой комплексной переработки стратегического минерального сырья» (проект №15-11-5-24).

Список литературы Микробное разнообразие в глинисто-солевых шламах калийного предприятия (г. Березники, Пермский край)

Бачурин Б.А. Эколого-геохимическая характеристика отходов калийного производства//Горный журнал. 2008. Т. 10. С. 88-91
Бачурин Б.А. Эколого-геохимические аспекты выщелачивания техногенно-минеральных образований горного производства//Материалы Всероссийской конференции с участием иностранных ученых «Геологическая эволюция взаимодействия воды с горными породами». 2012. С. 199-202
Бачурин Б.А., Одинцова Т.А. Органическая геохимия техногенеза горнопромышленного профиля//Минералогия техногенеза. 2006. Т. 7. С. 265-284
Бачурин Б.А., Одинцова Т.А. Отходы горнообогатительного производства как источники эмиссии органических поллютантов//Горный информационно-аналитический бюллетень. 2009. Вып. 7. С. 374-380
Бачурин Б.А., Одинцова Т.А., Первова Е.С. Эколого-геохимическая характеристика флотореагентов//Материалы II-й Всероссийской научной виртуальной онлайн-конференции «Химическая наука: современные достижения и историческая перспектива». 2014. С. 17-22
Бачурин Б.А., Сметанников А.Ф., Хохрякова Е.С. Эколого-геохимическая оценка продуктов переработки глинисто-солевых шламов калийного производства//Современные проблемы науки и образования. 2014. № 6. С. 1-8
Герхардт Ф. и др. Методы общей бактериологии. М.: Мир. 1983. Т. 1-3
Кандаурова Ю.М., Ястребова О.В., Плотникова Е.Г. Бактерии-деструкторы орто-фталевой кислоты, выделенные из района добычи и переработки калийных солей (г. Березники, Пермский край)//Материалы ХIV Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Биодиагностика состояния природных и природно-техногенных систем». Киров, 2016. С. 329-332.
Кашнер Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях. М.: Мир. 1981. 365 с
Корсакова Е.С., Пьянкова А.А., Плотникова Е.Г. Бактерии-деструкторы стойких органических загрязнителей -эфиров фталевой кислоты, как основа для создания новых экобиотехнологий//Известия Самарского научного центра РАН. 2013. Т. 15, № 3 (5). С. 1633-1636
Методы почвенной микробиологии и биохимии: учеб. пособие/под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1991. 304 с
Орлова Ю.С. Использование индексов биологического разнообразия для анализа альгофлоры бассейна р. Алатырь//Вестник Мордовского университета. 2013. Т. 3/4. С. 53-57
Пастухова Е.С. и др. Бактерии-деструкторы ортофталевой кислоты, выделенные из отходов калийного производства//Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2010. Вып. 3. С. 24-29
Плотникова Е.Г. и др. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработок//Микробиология. 2001. Т. 70, № 1. С. 61-69
Плотникова Е.Г. и др. Галотолерантные бактерии рода Arthrobacter -деструкторы полициклических ароматических углеводородов//Экология. 2011. № 6. С. 459-466
Реутских Е.М. Саралов А.И. Exiguobacterium sp. RS34 -галоалкалотолерантная факультативно анаэробная неспорообразующая бактерия порядка Bacillales из шламохранилища калийного рудника//Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2012. Вып. 3. С. 49-53
Саралов А.И. и др. Arhodomonas recens sp. nov. -умеренно галофильная гаммапротеобактерия из рассолов флотационного обогащения калийных минералов//Микробиология. 2012а. Т. 81, № 5. C. 630-637
Саралов А.И. и др. Halarchaeum solikamskense sp. nov. -термо-толерантный нейтрофильный галоархаеон из пенных продуктов флотационного обогащения калийных минералов//Микробиология. 2012б. Т.81, № 5. C. 638-644
Широких И.Гидр. Численность и структура комплексов почвенных актиномицетов в районе возможного влияния химически опасного объекта//Почвоведение. 2013. Т. 7. С. 860-866
Ястребова О.В. и др. Разнообразие бактерий, выделенных из района разработок месторождения калийных солей Верхнекамья//Bестник Пермского университета. 2009. Вып. 10 (36). Биология. С. 124-129
Raymond R.L. Microbial oxidation of nparaffinichydrocarbons.//Developments in Industrial Microbiology. 1961. Vol. 2, № 1. P. 23-32
Saralov A.I. et al. Haloferax chudinovii sp. nov., a halophilic archaeon from Permian potassium salt deposits//Extremophiles. 2013. Vol. 17(3). P. 499-504
Versalovic J. et al. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction//Methods in Molecular and Cellular Biology. 1994. Vol. 5(1). P. 25-40

Еще

Статья научная