Микробное разнообразие в глинисто-солевых шламах калийного предприятия (г. Березники, Пермский край)

Корсакова Е.С.; Шестакова Е.А.; Одинцова Т.А.; Бачурин Б.А.; Плотникова Е.Г.; Korsakova E.S.; Shestakova E.A.; Odintsova T.A.; Bachurin B.A.; Plotnikova E.G.

Научные статьи \ Математика. Естественные науки \ Биологические науки в целом \ Микробиология \ Прикладная микробиология

Микробное разнообразие в глинисто-солевых шламах калийного предприятия (г. Березники, Пермский край)

Автор: Корсакова Е.С., Шестакова Е.А., Одинцова Т.А., Бачурин Б.А., Плотникова Е.Г.

Журнал: Вестник Пермского университета. Серия: Биология @vestnik-psu-bio

Рубрика: Микробиология

Статья в выпуске: 1, 2017 года.

Бесплатный доступ

Из глинисто-солевых шламов предприятия БКПРУ-2 ПАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край) выделено 138 штаммов бактерий, которые на основании морфологических и генетических особенностей были объединены в 28 морфогеномогрупп. Представители каждой группы были идентифицированы на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, сравни-тельное исследование которых показало принадлежность штаммов к классам Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria и Actinobacteria. Все обнаруженные бактерии являются галотолерантными, т.к. способны к росту на средах без добавления NaCl и с повышенной концентрацией соли (до 150 г/л). Большинство штаммов росли в щелочных условиях (рН 9.0) и использовали в качестве един-ственного источника углерода ряд моно- и полиароматических соединений, в том числе полицик-лические ароматические углеводороды, фталаты.

Еще

Глинисто-солевые шламы, филогенетическое разнообразие, бактерии-деструкторы, аромати-ческие соединения, фталаты

Короткий адрес: https://sciup.org/147204813

IDR: 147204813 | УДК: 579.695:579.262:579.222.2

Microbial diversity in clay-salt sludge of the potash enterprise (Berezniki, Perm krai)

From clay-salt sludge of the enterprise Berezniki-2 of OJSC "Uralkali" (Berezniki, Perm Territory) 138 bacterial strains were isolated and basing on morphological and genetic features have been combined in 28 morpho(genomo)groups. Representatives of each group have been identified while analyzing the nu-cleotide sequences of 16S rRNA gene, and comparative analysis showed that those strains belonged to the classes Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria and Actinobacteria. All the bacteria studied are halotolerant, because they are capable of growing on media without NaCl supplementation and with in-creased salt concentration (up to 150 g/l). Most strains grew in alkaline conditions (pH 9.0) and utilized several mono- and polyaromatic compounds as a sole source of carbon, including polycyclic aromatic hy-drocarbons, phthalates.

Еще

Текст научной статьи Микробное разнообразие в глинисто-солевых шламах калийного предприятия (г. Березники, Пермский край)

Верхнекамское месторождение калийно-маг-ниевых и натриевых солей (ВМКМС) Пермского края является одним из крупнейших среди разрабатываемых в мире. В результате деятельности калийных комбинатов предприятий ПАО «Уралкалий» (г. Соликамск и Березники, Пермский край) образуются значительные объемы глинисто-солевых шламов и избыточных рассолов, которые хранятся в специальных гидротехнических сооружениях - шламохранилищах. Формирование состава шламов определяется, в первую очередь, составом добываемого сырья, а также технологическими факторами последующей рудоподготовки и обогащения, что обусловливает присутствие в них, наряду7 с легкорастворимыми хлоридными минералами, широкого спектра тяжелых металлов и органических соединений [Бачурин, Одинцова, 2009]. Основным источником последних являются используемые технологические химические реагенты и продукты их трансформации, главными вещест ве Корсакова Е. С. Шестакова Е. А., Одинцова Т. А., Бачурин Б. А., Плотникова Е. Г., 2017

вами преобразования которых являются полиэток-сильные соединения (полигликоли, полиоксиалканолы и ИХ эфиры, диоксоланы, диоксаны И Др.)к гетероциклы углеводородные структуры. включая полициклическую ароматику7 и фталаты [Бачурин. 2008: Бачурин, Одинцова, Первова. 2014].

По результатам эколого-геохимических исследований было обнаружено, что аккумулированные в глинисто-солевых шламах органические поллютанты служат мощными источниками 'загрязнения природных экосистем благодаря их высокой геохимической подвижности и могут рассматриваться как потенциальные вторичные источники контаминации гидросферы - высвобождение их из связанного состояния может происходить при выщелачивании отходов атмосферными осадками [Бачурин, Одинцова, 2006; Бачурин, 2012; Бачурин, Сметанников, Хохрякова, 2014]. В связи с этим при такой комплексной нагрузке абиотических факторов на территории шламохра-нилищ возникают условия для формирования уникальных сообществ галофильных и галотолерангных микроорганизмов, в том числе способных разлагать экотоксиканты.

Ранее из шламов района солеразработок ВМКМС были выделены и охарактеризованы бак- терии-дестру кторы полицикли ческих ароматических углеводородов и фталатов родов Rhodococ-cus^ Pseudomonas, Arthrobacter, Bacillus [Плотникова и др.. 200 L 2 011; Ястребова и др., 2009: Пастухова и др., 2010: Корсакова, Пьянкова. Плотникова. 2013; Кандаурова, Ястребова, Плотникова. 2016]. Описаны новые таксоны архей и прокариот, выделенные из продуктов флотационного обогащения калийных минералов и техногенных вод шла мохра нилища П АО « Ура лка лий» [ Реутских, Сара лов. 2012: Саралов и др.. 2012а. 20126; Saratov et al., 2013].

Цель настоящей работы - изучение бактериального сообщества глинисто-солевых шламов калийного предприятия БКПРУ-2 ПАО «Уралкалий» в г. Березники (Пермский край).

Материалы и методы исследования

Образцы шламов. В качестве материала для исследования были выбраны пять образцов, отобранных из шла мохра нилища калийного предприятия БКПРУ-2 ПАО «Уралкалий» (г. Березники) (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика образцов глинисто-солевых шламов

№ образца шлама	Регистрационный №	Точка отбора, глубина отбора	Минерализация, мг/кг	ХБА\ мг/кг	Н1Г\ мг/кг
1	219/1	И [дам из шурфа № 1, о.3 м	2641MJ	902.5	312.5
2	220/2	Шлам из шурфа № 1, 0.5 м	26400	817.5	265.0
3	221/3	Шлам из шурфа № 2, 0,2 м	22650	932.5	340.0
4	222/4	Шлам из шурфа № 3. 0.2 м	35800	1111.0	349.0
5	222/5	11 [лам из шурфа Яо 3, 0.4 м	43000	но/**	но.

Примечание. ХБА - хлороформенный битумоид (компонент органического вещества, извлекаемый из горной породы органическим растворителем - хлороформом, без предварительной обработки соляной кисло гой). НП -нефтепродукты; и,о, - не определяли [Бачурин, Одинцова, 2009],

Для выделения и роста микроорганизмов была использована минеральная среда Раймонда (МСР) (Raymond, 1961) с добавлением NaCl (50 г/л). Агаризованные среды получали при добавлении агара («Sigma». США) в концентрации 15 г/л. Для приготовления богатой среды Раймонда (Б СР) в МСР добавляли 5 г/л триптона («Fluka», США) и 2.5 г/л дрожжевого экстракта («Difco», США) в качестве ростовых субстратов

Микробиологический анализ образцов шламов проводили общепринятыми методами посева почвенной суспензии на агаризованную БСР с последующим подсчетом колоний микроорганизмов (колониеобразующих единиц, КОЕ) и выделением бактерий из единичных колоний для идентификации [Методы ..., 1991]. Биоразнообразие и плотность видов бактерий -деструкторов оценивали с помощью индексов Шеннона-Уивера. Симпсона и Менхиника. используя дифференцированный подсчет колоний, принадле жащих к разным морфо(геномо)типам [Широких и др.. 2013; Орлова, 2013].

Способность бактерий разлагать ароматические углеводороды оценивали путем культивирования на агаризованной МСР (30 г/л NaCl) при 28°С с добавлением моно( полихроматических углеводородов («Fluka», США) в качестве единственного источника углерода и энергии. Нафталин, бифенил, бензол, толуол, фенол и дибутилфталат помещали на крышку перевернутой чашки Петри; орто- фталевую кислоту (у-ФК), бензойную (БК), цйрт-гидроксибензойную кислоты (ПГБК) вносили в среду до конечной концентрации 1 г/л, салициловую кислоту⁷ - до 0.5 г/л. Рост колоний бактерий на агаризованных средах с углеводородами оценивали по сравнению с ростом на агаризованных средах того же состава без субстратов (контрольный вариант). Колонии диаметром менее 1 мм оценивали как «+». 1-2 мм - «++», более 3 мм - «+++».

Рост микроорганизмов при изменении осмолярности среды. Изучение устойчивости микроорганизмов к NaCl (0-200 г/л) проводили на ага-ризованной среде БСР. оценивая размер выросших колоний.

Рост при разных значениях pH определяли при концентрации Na' 0.8-0.85 М в буферных системах, приготовленных на основе БСР. Штаммы культивировались на чашках Петри на агаризо-ванной среде при pH 5.0, 6.0, 7.0. 8.0, 9.0. Рост учитывали на седьмой день культивирования [Герхардт и др.. 1983].

Рост при разных температурах. Штаммы культивировали на агаризованной БСР (30 г/л NaCl) при 10, 20. 28. 37 и 45°С. Рост учитывали на седьмой день культивирования.

ДНК-тонирование полученных бактериальных изолятов проводили методом ВОХ-ПЦР (полимеразная цепная реакция повторяющихся ВОХ-элементов) с использованием праймера BOXA1R (5 -CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’) в соответствии с методикой [Versalovic et al, 1994]. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1.5%-ном агарозном геле на 1 х ТВЕ буфере (89 мМ Трис-НО, 89 мМ борная кислота. 2,5 мМ ЭДТА, pH 8.2) в течение 2 ч. при напряжённости электрического поля 5.7 V/см и анализировали полученные фрагменты.

Филогенетический анализ полученных изо-лятов был основан на определении нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК с применением набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Se quencing Kit на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 3500XL («Applied Biosystems», США) в Пермском государственном национальном исследовательском университете (кафедра ботаники и генетики растений). Полученные нуклеотидные последовательности были проанализированы с использованием программ CLUSTAL W, Sequence Scanner v. 2.0. Mega v. 7.0. Поиск гомологичных последовательностей проводили по базам данных GenBank и EzTaxon (http://www. .

Результаты и их обсуждение

Методом прямого высева на агаризованную БСР с содержанием 50 г/л NaCl из образцов шламов было выделено 138 штаммов бактерий. Отбор осуществлялся на основе различий в морфологии колоний микроорганизмов, растущих на агаризованной среде. В результате были сформированы 34 морфологические группы, представители которых были взяты для проведения дальнейших исследований.

Проведена сравнительная характеристика представителей наиболее сходных морфогрупп с применением метода ВОХ-ПЦР. Анализ полученных ВОХ-ПЦР профилей фрагментов геномной ДНК исследуемых бактерий показал, что 22 штамма, близких по морфологическим признакам, принадлежат к 16 геномогруппам (рис. 1). Согласно полученным результатам, выделенные штаммы бактерий были объединены в 28 морфогеномогрупп, далее обозначенных как репрезентативные операционные таксономические единицы (ОТЕ).

М12345678 9 10 11 М 12 13 14 15 16 17 18 19 20 М 21 22

'—у—' 4—у—'

1 11 111 II 1 IV 1 V VI Vil VIII IX X XI XII XIII XIV XV XIII XVI

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ВОХ-ПЦР штаммов бактерий, изолированных из образцов шламов:

М - маркер O’GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder («Fermentas», Литва), 7 - ВОЮ; 2 - ВОН; 3 - ВО 14: 4 - ВО22; 5 - ВО26: 6 - ВО36; 7 - ВО23; 5 - ВО8; 9 - ВОЮ; 10 - ВО34-1; 7 7 - ВО25; 7 2 - ВО9: 13 - ВО20; 14 - ВО35; 75 - ВО13; 16 - ВО27; 17 - ВО28; 719 - ВОЗО; 20 - ВОЗ 1; 21 - ВО 1; 22 - Rhodococcus sp. КТ723 (штамм-деструктор нафталина из рабочей коллекции Лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ИЭГМ УрО РАН)

Была проведена статистическая оценка альфа-разнообразия представленных микробных сообществ с использованием индесов Шеннона-Уивера (придает большее значение уникальным ОТЕ) и Симпсона (общим ОТЕ), показавшая примерно равные показатели биоразнообразия и выравнен-ности сообществ в исследуемых пробах. Однако, согласно проведенному анализу, образец шлама № 5 характеризуется гораздо большим биоразнообразием уникальных ОТЕ по индексу Шеннона-Уивера (Н'=1.316) и меньшим значением общих ОТЕ (D=0.319) при сравнении с пробами № W. Большое количество морфогеномогрупп, низкая численность изолированных бактерий и высокий уровнь минерализации (43000 мг/кг) данной пробы могут быть непосредственно связаны с присутст вием галотолерантных и галофильных форм микроорганизмов (табл. 1). Расчет плотности видов (видового богатства) в сообществе по индексу Менхиника (DMn) показал, что наибольшее значение данного параметра выявлено в образце шлама № 2, в котором, в свою очередь, была обнаружена высокая численность бактерий (7.84 хЮ1) и малое количество представленных морфотипов (табл. 2). Вероятно, что такие особенности связаны с параметрами данной пробы, а именно с отбором с глубины 0.5 м. на котором воздействие неблагоприятных биотических факторов снижается (в том числе вымывание бактерий из образца шлама атмосферными осадками), что обусловливает высокую численность обнаруженных бактерий

Таблица 2

Анализ разнообразия микробных сообществ образцов шламов

Номер образца	Количество ОТЕ	Общая численность бактерий, КОЕ/1 г шлама	Индекс Менхиника (Dwn)	Индекс 111енно-на-Уивсра (1Г)	Индекс Симпсона (D)
1	13	6.35*10°	0.005	0.839	0.463
2	10	7.84*10"	0.011	1.077	0.469
3	15	7.35*10°	0.006	1.047	0.475
4	13	2.72*10°	0.008	0.996	0.482
5	14	2.27*10°	0 009	1.316	0.319

В результате сравнения последовательностей гена 16S рРНК (у 28 изолятов. представителей каждой морфогеномогруппы) с типовыми видами из базы данных EzTaxon (http://www.ezbiocloud. net) установлено, что 7 культур являются представителями класса Bacilli, 8 штаммов относятся к классу

Crnnmuproteobcctenck 11 штаммов - к классу А cli-nobacteria и 2 штамма - к классу' Alphaproteobac-lena. Уровень сходства 16S рДНК изолятов с типовыми штаммами узаконенных видов находился в пределах 98.1-100% (табл. 3).

Таблица 3

Анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изолированных бактерий

№ штамма	Типовой штамм	№ GenBank	Сходство, %	Количество нуклеотдов
ВО1	Rhodococcus wradslaviensisMCMB 13082^т	Z37138	99.9	800
ВО2	Rhodococcus fascians DSM 20669^т	X79186	100	819
ВОЗ	Bacillus pumilus ATCC 7061^T	ABRX01000007	99.9	1426
ВО4	Bacillusfmrms NCIMB 9366^T	X60616	99.3	908
ВОЗ	Bacillus thiiringiensis AICC 10792¹	ACNF01000156	100	915
ВО6	Bacillus safens is РО-ОЗбЬ¹	AF234854	99.9	935
BOS	Pseudomonas xanthomarina KMM 1447¹	.ABI 76954	987	1401
ВО9	Dietzia mans DSM 43672¹	X79290	99 8	904
BOI 1	Pseudomonas xanthomarina KMM I447¹	AB 176954	990	1434
BOIS	Stenotrophomonas maltophiho ATCC 13637¹	AB008509	100	930
BOIS	Bacillus safensis FO-ОЗбЬ¹	AF234854	100	923
BO19	ArthrobacTer oxydans DSM 20119¹	X83408	100	1233
BO20	DiOzia mans DSM 43672¹	X79290	99.9	887
BO21	Anhrobacter oxydans DSM 20119¹	X83408	99.2	1388
BO22	Pseudomonas xanthomanna KMM 1447¹	AB 176954	99.0	1438
BO23	Pseudomonas xanthomarbta KMM 1447¹	AB 176954	99.2	1404
BO24	Pseudomonas xauthomanna KMM 1447¹	AB 176954	99.2	1421
BO25	Arthrobacter nicotianae DSM 20123^T	X80739	99.1	1387
BO27	Stenotrophomonas maiiophdia ATCC 13637¹	AB008509	99.2	769
BO28	Paracoccus beibnensrs ЛЛ’1284^Т	EU65OI96	98.1	1330
возо	Paracoccus beibnensis JI Л 1284^T	EU650196	98.2	1330
BO32	Pseudomonas mon lei Id CIP 104883^T	AF064458	99.5	927
возз	Bacillus vietnamensis 15-l^T	AB099708	99.0	604

Окончание табл. 3

№ штамма	Типовой штамм	№ GenBank	Сходство, %	Количество нуклеотидов
ВО34-1	Arthrobacter oxydems DSM 20119 ¹	X83408	100	1401
ВО35	Kocuria rosea DSM 20447¹	X87756	99 7	972
ВО37	Micrococcus luteus NCTC 2665¹	CP001628	100	414
ВО38	StrepTomyces somaiiensis NBRC 12916¹	AB 184243	100	1392
ВО141	Bacillus plexus IFO 15715¹	AB021185	100	722

Согласно полученным результатам, преимущественным значением среди выделенных бактериальных штаммов обладали представители классов Aciinobacieria и Gammaproieobacteria, а именно -бактерии родов Dietzia (31.77%) и Stenotrophomo-nas (46Л%), соответственно (рис. 2). Что характерно. наибольшим многообразием таксономических групп характеризовались микроорганизмы класса Actinobacteria. среди которых доминирующее положение занимали изоляты, филогенетически близкородственные к бактериям рода Dietzia. Менее многочисленными были бактерии родов Аг-throbactey Кос uh а, Micrococcus, Rhodococcus и Streptomyces (в порядке уменьшения количества КОЕ/1 г шлама).

7, RhodOCOCCHS sp.

«BociHus sp.

’frSfenotrophomcmfis sp.

■ №№ sp.

Arthrobader sp.

Pseudomonas sp.

■ Porncoccus sp.

• Micrococcus sp.

•Streptomyces sp.

* Kocuria sp.

Рис. 2, Относительное содержание различных филогенетических групп (родов) бактерий классов A ct / по ba с ten а ,А Iphaproteob ас teri а.

Bacilli и Gammaproteobacteha

В результате изучения биодеградационных свойств 28 штаммов (представителей сформированных ОТЕ) было выявлено семь наиболее активных штаммов-деструкторов VArthrobacter spp. BOI 9, BO25_t Bacillus spp. BO4, BO33, Kocuria sp. BO35, Paracoccus sp. BO28 и Rhodococcus sp. BOI), обладающих широкой субстратной специфичностью и способных использовать в качестве единственного источника углерода и энергии такие соединения, как нафталин, бифенил, орто- фталевую. бензойную, и^^-гидроксибензойную. салициловую кислоты, а также фенол, толуол и бензол. Стоит отметить, что большинство штаммов росли на моно- и полиароматических соединениях, но были также обнаружены бактерии (штаммы Rhodococcus sp. BOL Dietzia sp. BO9, Arthro-bacter spp. БО25, BO34-1, Bacillus sp. ВОЗЗ). использующие в качестве субстрата широко используемое в химической промышленности, труднораз-лагаемое и токсичное соединение - дибутилфталат (табл. 4).

Кроме того, было установлено, что все изолированные бактериальные культуры способны к росту на агаризованной среде как без добавления NaCl, так и с повышенной концентра дней соли (30-150 г/л), т.с. являются галотолсрантными организмами [Кашнер, 1981]. Среди них присутст-в>ют штаммы, обладающие способностью к росту при особенно высоких концентрациях хлорида натрия -до 150 г/л, а именно спорообразующис бактерии рода Bacillus (табл. 5).

Таблица 4

Рост бактерий на ароматических углеводородах на агаризованной МСР

Штамм	Субстрат
Штамм	Фен.	Бен,	Тол.	Наф,	Биф,	О-ФК	БК	СК	ПГБК	ДБФ
Rhodococcus sp. BOI	+++	++	+	+++	++	+44	+	++	++4	++
Rhodococcus sp. BO2	-	+++	++	++	++	44	+	++	++4	4
Bacillus sp. BO3	+	+	+	+	4	44	+	+	4	+
Bacillus sp. BO4	+++	++	+4	+++	444	+44	++	+++	++	—
Bacillus sp. BO5	+	+	—	+	4	4	—	—	—	—
Bacillus sp. BO6	44	+	+	4	4	44	4	4		—
Pseudomonas sp. BOS	+	++		4	4	4	4	4	4
Dictzia sp. BO9		+	-И-	4	4	+44	4+4	4		++
Pseudomonas sp. BO11	44	++	+	++	++	+44	4+4	++
Stenotrophomouas sp. BO 13	44	+	—	++	++	44	4	++
Bacillus sp. BOIS	4	+	+	++	++	44	4	4
Arthrobacter sp. BOW	44	+	+	++	4	+44	++	++	++
Dietzia sp, BO20	44	++	+	4	4		4+4	++		4
Arthrobacter sp. BO21	44	++	+	4	44	4	4+4	4+	4+	—

Окончание табл. 4

Штамм	Субстрат
Штамм	Фен.	Бен,	Тол.	Наф.	Биф.	о-ФК	БК	СК	ПГБК	ДБФ
Pseudomonas sp. БО22	++		—	+	++	+4-	+	++	+	—
Рдегк/утунил’ sp. BO23	+	++	—	++	++	—	+++	+	+	—
Pseudomonas sp. BO24	+	++	—	4-4-	4-	—	+4-4-	4+	+	—
Arthrobacter sp. BO25	+++	+++	+++	+++	++4-	+4-	+++	++	+++	+++
Sfenotraphomonas sp. BO27	-н-	++	+	4-	4-	4-	+	+	+	—
Paracoccus sp. B02S	+++	+++	+	-Н-	-Н-	+4-	4-Н-	4-Н-	+	+
Paracoccus sp. BO 30	+	+	+	4-	+	4-		+	+	—
Pseudomonas sp. BO32	-н-	++		-Н-	-Н-	4-	+	+	4-Н-	—
Bad Hus sp. BO33	-н-	+++	+	4-	4-	-Н-	+	+	+	+++
Arthrobacter sp. BO34-1	—	+		4-	-Н-	+4-	+	+	4-Н-	+++
Коси ria sp, BO35	+++	++	++	-Н-	-Н-	+4-	+	+	+	—
Micrococcus sp, BO37	+++	+		-Н-	-Н-	+4-	+	+	+	—
Streptomvces sp, B03S	+++	+		-Н-	-Н-	+4-	4-Н-	++	-н-	—
Bacillus sp. BO141	++	—	—	4-4-	-НН-	4-Н-	++	++	-н-	—

Примечание. Фен. - фенол; Бен. - бензол; Тол. - толуол; Наф. - нафталин; Биф. - бифенил; о-ФК - орто- фталевая кислота; БК - бензойная кислота; СК - салициловая кислота; ПГБК - нстрл-гидрокеибензойная кислота; ДБФ - дибутил фталат.

Таблица 5

Рост бактерий в присутствии различных концентраций NaCl

Штамм	Концентрация NaCl (г/л)_} среда БСР
Штамм	Без NaCl	30	50	60	70	S0	90	100	120	150
Rhodococcus sp. BOI	+++	+++	+++	+++	+++	++	++	+
Rhodococcus sp. BO2	++	+++	+	+	—	-	—	—	-	-
Bacillus sp. BO3	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+
Bacillus sp. BO4	+++	+++	+++	+++	++	++	+	++	+	-
Bacillus sp. BO 5	+++	+++	+++	+++	+	-	—	—	-	-
Bacillus sp. BOO	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	++	+
Pseudomonas sp. BOS	+++	+++	++	+	+	+	+	—	-	-
Dietzia sp. BO9	+	4-Н-	++	++	4-Н-	+	+	—
Pseudomonas sp. BO 11	-НН-	4-Н-	-НН-	-НН-	+4	4-4	+	+
Stenotrophomonas sp. BO13	-НН-	4-Н-	-нн-	+	+	+	+	—
Bacillus sp. BOIS	-НН-	4-Н-	-нн-	-нн-	4-Н-	4-Н-	4-Н-	4-Н-	-НН-	+
Arthrobacter sp. BO 19	-НН-	4-Н-	++	+	+	+	+	—
Dietzia sp BO20	4-	4-Н-	-н-	-н-	+	+	+	—
Arthrobacter sp. BO2 1	-нн-	4-Н-	++	+				—
Pseudomonas sp, BO22	-н-	4-Н-	++	++	+	+	+	—
Pseudomonas sp, BO23	-н-	4-Н-	++	++	+4	4-4	+	+
Pseudomonas sp, BO24	-н-	4-Н-	++	++	+4	4-4	+	+
Arthrobacter sp, BO25	-нн-	4-Н-	-нн-	-нн-	4-Н-	4-Н-	4-Н-	4-Н-	4-+	—
Stenotrophomonas sp. BO27	+++	+++	+	—	—	—	—	—	—	—
Patacoccus sp. BO28	+++	+++	++	++	++	+	+	—	—	—
Paracoccus sp. BO30	+++	+++	+	+	—	-	—	—	-
Pseudomonas sp, BO32	+++	+++	++	+	—	-	—	—	-
Bacillus sp, BO33	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+
Arthrobacter sp. BO34-1	+++	+++	++	+	—	-	—	—	-	-
Kocuria sp. BO35	+++	+++	+++	+++	+++	++	+	+	-	-
Micrococcus sp. BO37	+++	+++	+++	+++	+++	++	+	+	+	-
Streptomvces sp. BO38	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	++	-
Bacillus sp. BO141	+++	+++	+++	+++	+++	++	++	++	++	-

Примечание. «+» - слабый роет, «++» - средний рост; «+++» - хороший рост; «-» - отсутствие роста бактерий,

Также был исследован диапозон роста бактерий при различных значениях pH в среде культивирования и при различной температуре. Установлено, что значительная часть изолятов (Bacillus spp.

ВОЗ? ВО4, ВОЗ, ВО IX, Rhodococcus Sp, ВО2, Arthrobacter sp, BO25, Pseudomonas sp. BO32) способна к эффективному росту при pH среды от 6,0 до 9,0. Штамм Rhodococcus sp. ВО1 характерно- вался ростом в более широком диапазоне значений pH среды (от 5,0 до 9,0).

У ряда исследуемых штаммов (Bacillus spp. ВОЗ. ВО18, ВО141, Pseudomonas spp. BOIL BO14, BO26, Paracoccus sp. ВОЗО и Kocuria sp. BO35) была отмечена способность к росту в диапазоне температур от +10°С до 45°С (с оптимумом роста 28°С). относящая их к термотолерантным микроорганизмам. При температуре ниже 10°С рост культуры не наблюдался или был незначительным.

Интересен тот факт, что среди изолированных бактерий встречаются штаммы, сходные по филогенетическому положению с одним и тем же типовым штаммом бактерий, но отличающиеся по ВОХ-ПЦР профилям фрагментов геномной ДНК. субстратной специфичности, а также способности к росту на средах с различными значениями pH и концентрации NaCL Так, например, выявлено 5 штаммов (ВО8. BOIL ВО22. ВО23. ВО24). которые имеют наибольший процент сходства по нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК с типовым видом Pseudomonas xanthomarina КММ 1447Т. но при этом существенно различаются по утилизации ароматических соединений (табл. 4), а штамм Pseudomonas sp. ВОН может эффективно использовать в качестве единственного источника углерода орто-фталевую кислоту.

Заключение

В результате исследования микробного сообщества образцов глинисто-солевых шламов из шла-мохранилища БКПРУ-2 ПАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край) получены новые данные по филогенетическому разнообразию культивируемых бактерий района Верхнекамского месторождения солей. Выделено 138 штаммов бактерий-деструкторов различных ароматических углеводородов, в том числе фталатов филогенетический анализ показал принадлежность изо лированных штаммов к трем классам: Alphaproteobacteria. Gammaproteobacteria и Actinobacteria: десяти родам: Arthrobacter. Bacillus. Dietzia, Kocuria. M i crococcus, Pa racoccus, Pseudomona s. Rhodococcus, Stenotrophomonas и Streptomyces. При изучении их биодеградационных свойств выявлено семь наиболее активных штаммов-деструкторов, способных использовать в качестве ростового субстрата различные углеводороды: нафталин, бифенил. фенол, толуол и бензол, бензойную . пара -гидроксибензойную, салициловую кислоты, а также ([палаты (орто-фталат, дибутил-фталат), Кроме того, показано, что все изоляты являются галотолерантами (растут в присутствии 100-150 г/л NaCl), а ряд из них - алкалафилами (растут в диапазоне значений pH до 9.0).

Таким образом. установлено, что в районах шламохранилищ сформированы уникальные мик робные сообщества, в состав которых входят солеустойчивые бактерии-деструкторы ароматических соединений, являющихся одними из характерных экотоксикантов отходов калийного производства. Выявленные активные галотолерантные бактерии-деструкторы фталатов, моно(поли)ароматических углеводородов перспективны для дальнейшего изучения и использования при создании новых биотехнологий ремедиации территорий с высокой минерализацией и контаминацией стойкими органическими загрязнителями.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16-44-590968 р_а и Программами УрО РАН «Молекулярная и клеточная биология» (проект №15-4-4-13) и «Фундаментальный базис инновационных технологий оценки, добычи и глубокой комплексной переработки стратегического минерального сырья» (проект №15-11-5-24).

Список литературы Микробное разнообразие в глинисто-солевых шламах калийного предприятия (г. Березники, Пермский край)

Бачурин Б.А. Эколого-геохимическая характеристика отходов калийного производства//Горный журнал. 2008. Т. 10. С. 88-91
Бачурин Б.А. Эколого-геохимические аспекты выщелачивания техногенно-минеральных образований горного производства//Материалы Всероссийской конференции с участием иностранных ученых «Геологическая эволюция взаимодействия воды с горными породами». 2012. С. 199-202
Бачурин Б.А., Одинцова Т.А. Органическая геохимия техногенеза горнопромышленного профиля//Минералогия техногенеза. 2006. Т. 7. С. 265-284
Бачурин Б.А., Одинцова Т.А. Отходы горнообогатительного производства как источники эмиссии органических поллютантов//Горный информационно-аналитический бюллетень. 2009. Вып. 7. С. 374-380
Бачурин Б.А., Одинцова Т.А., Первова Е.С. Эколого-геохимическая характеристика флотореагентов//Материалы II-й Всероссийской научной виртуальной онлайн-конференции «Химическая наука: современные достижения и историческая перспектива». 2014. С. 17-22
Бачурин Б.А., Сметанников А.Ф., Хохрякова Е.С. Эколого-геохимическая оценка продуктов переработки глинисто-солевых шламов калийного производства//Современные проблемы науки и образования. 2014. № 6. С. 1-8
Герхардт Ф. и др. Методы общей бактериологии. М.: Мир. 1983. Т. 1-3
Кандаурова Ю.М., Ястребова О.В., Плотникова Е.Г. Бактерии-деструкторы орто-фталевой кислоты, выделенные из района добычи и переработки калийных солей (г. Березники, Пермский край)//Материалы ХIV Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Биодиагностика состояния природных и природно-техногенных систем». Киров, 2016. С. 329-332.
Кашнер Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях. М.: Мир. 1981. 365 с
Корсакова Е.С., Пьянкова А.А., Плотникова Е.Г. Бактерии-деструкторы стойких органических загрязнителей -эфиров фталевой кислоты, как основа для создания новых экобиотехнологий//Известия Самарского научного центра РАН. 2013. Т. 15, № 3 (5). С. 1633-1636
Методы почвенной микробиологии и биохимии: учеб. пособие/под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1991. 304 с
Орлова Ю.С. Использование индексов биологического разнообразия для анализа альгофлоры бассейна р. Алатырь//Вестник Мордовского университета. 2013. Т. 3/4. С. 53-57
Пастухова Е.С. и др. Бактерии-деструкторы ортофталевой кислоты, выделенные из отходов калийного производства//Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2010. Вып. 3. С. 24-29
Плотникова Е.Г. и др. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработок//Микробиология. 2001. Т. 70, № 1. С. 61-69
Плотникова Е.Г. и др. Галотолерантные бактерии рода Arthrobacter -деструкторы полициклических ароматических углеводородов//Экология. 2011. № 6. С. 459-466
Реутских Е.М. Саралов А.И. Exiguobacterium sp. RS34 -галоалкалотолерантная факультативно анаэробная неспорообразующая бактерия порядка Bacillales из шламохранилища калийного рудника//Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2012. Вып. 3. С. 49-53
Саралов А.И. и др. Arhodomonas recens sp. nov. -умеренно галофильная гаммапротеобактерия из рассолов флотационного обогащения калийных минералов//Микробиология. 2012а. Т. 81, № 5. C. 630-637
Саралов А.И. и др. Halarchaeum solikamskense sp. nov. -термо-толерантный нейтрофильный галоархаеон из пенных продуктов флотационного обогащения калийных минералов//Микробиология. 2012б. Т.81, № 5. C. 638-644
Широких И.Гидр. Численность и структура комплексов почвенных актиномицетов в районе возможного влияния химически опасного объекта//Почвоведение. 2013. Т. 7. С. 860-866
Ястребова О.В. и др. Разнообразие бактерий, выделенных из района разработок месторождения калийных солей Верхнекамья//Bестник Пермского университета. 2009. Вып. 10 (36). Биология. С. 124-129
Raymond R.L. Microbial oxidation of nparaffinichydrocarbons.//Developments in Industrial Microbiology. 1961. Vol. 2, № 1. P. 23-32
Saralov A.I. et al. Haloferax chudinovii sp. nov., a halophilic archaeon from Permian potassium salt deposits//Extremophiles. 2013. Vol. 17(3). P. 499-504
Versalovic J. et al. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction//Methods in Molecular and Cellular Biology. 1994. Vol. 5(1). P. 25-40

Еще