Микробные препараты на основе эндофитных и ризобактерий, которые перспективны для повышения продуктивности и эффективности использования минеральных удобрений у ярового ячменя (Hordeum vulgare L.) и овощных культур

Современное высокоэффективное сельскохозяйственное производство невозможно без применения удобрений и средств защиты растений. Так, широкое использование минеральных удобрений, в первую очередь азотных, позволило за последние 50 лет более чем в 5 раз поднять урожайность основных сельскохозяйственных культур в развитых странах. Однако процесс получения и применения минеральных азотных удобрений наиболее энергоемкий — на него расходуется от 30 до 50 % всей энергии, потребляемой в сельскохозяйственном производстве. Последствия приме-

Работы по выделению эндофитных и ризобактерий, изучению их фунгицидных свойств, способности продуцировать ауксины и различные ферменты, а также эффективности эндофитных и ризобактерий в вегетационных опытах выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 1416-00146), работа по изучению эффективности эндофитных и ризобактерий в полевых опытах с яровым ячменем выполнена при государственной финансовой поддержке ведущих университетов Российской Федерации (субсидия 074-U01).

нения минеральных азотных удобрений негативны для здоровья человека, биоразнообразия почвенных микроорганизмов, при этом ухудшается плодородие почв, растет выброс парниковых газов, и только в Европе все это ежегодно требует компенсационных затрат в объеме от 70 до 320 млрд евро (1). Альтернативный дешевый и безопасный источник азота для сельскохозяйственного производства — биологический азот. Для России это особенно актуально, так как за последние 20 лет применение минеральных удобрений снизилось в 3-5 раз. При этом ситуация усугубляется тем, что производители сельскохозяйственной продукции не способны в достаточном количестве приобретать дорогостоящие минеральные удобрения и вынуждены использовать запасы азота, фосфора и калия в почве без их восполнения, что ведет к потере плодородия почв. Таким образом, научно обоснована необходимость обеспечить современное земледелие высокоэффективными микробными препаратами для обработки не менее 20 млн га, что определяется структурой посевных площадей Российской Федерации и результатами многолетних испытаний эффективности микробных препаратов (2-5).

Внимание ученых привлечено к ассоциациям растений с полезными микроорганизмами с точки зрения не только изучения фундаментальных основ их взаимодействия, но и возможного использования таких взаимодействий в практике экологически ориентированного адаптивного растениеводства. Большинство работ направлено на изучение ризосферных микроорганизмов (6-8). Однако имеются микроорганизмы, существующие внутри растения, включая надземную часть и семена, так называемые эндофитные бактерии. Эндофитными могут называться бактерии, которые способны колонизировать внутренние ткани растения, не оказывая отрицательного влияния на его развитие и не вызывая заболеваний (9, 10). Из существующих на земле 300 000 видов растений каждый служит хозяином для одного и более видов эндофитных бактерий (11). Однако в настоящее время всего несколько видов растений достаточно полно изучены в отношении содержания в них эндофитных бактерий. Открываются большие перспективы по поиску, выделению и изучению видов эндофитных бактерий, положительно влияющих на развитие растений, с целью создания все более эффективных микробиологических препаратов для адаптивного растениеводства (12). Бактериальные эндофиты колонизируют в растении те же экологические ниши, что и фитопатогенные микроорганизмы, поэтому их также рассматривают в качестве перспективных агентов биоконтроля фитопатогенов (8, 12).

Использованный нами подход, предполагающий сочетание эндофитных и ризобактерий при разработке микробных препаратов для растениеводства, позволяет формировать самодостаточные растительно-микробные системы, повышая эффективность сельскохозяйственного производства и снижая экологическую нагрузку на окружающую среду.

Целью представляемой работы стало изучение хозяйственно ценных свойств эндофитных и ризобактерий из корней и внутренних тканей культурных и диких растений, создание образцов микробных препаратов на основе штаммов и сравнение действия перспективных и существующих микробных препаратов на ячмене и овощных культурах в вегетационных и полевых опытах для выявления эффективных вариантов.

Методика. При выполнении микробиологических исследований использовали приемы общей и технической микробиологии (13, 14).

Ризобактерии выделяли из корней растений томата (Solanum lycopersicum L.) сорта Белла. Корни промывали в проточной воде, помещали в колбы с 300 мл стерильной воды и встряхивали в течение 2 ч на качалке (200 об/мин). Отбирали по 1 мл из каждой колбы для приготовления серийных разведений (до 10^-5), по 100 мкл из каждого разведения высевали 336

на триптон-соевый агар (TSA, «Sigma», США), разведенный в 20 раз (0,5х TSA). Чашки культивировали 3 сут при 28 °С. Для выделения эндофитных бактерий из внутренних тканей стебля борщевика (Heracleum sphondylium L.) использовался метод поверхностной стерилизации. Очищенный образец стебля промывали 10 мин в 70 % этаноле, 5 мин — в 10 % гипохлорите натрия и 5 раз — в стерильной водопроводной воде. После стерилизации образец асептически разрушали, используя стерильные пестик и ступку. Для подтверждения успешности стерилизации делали смывы с поверхности тканей и высев полученных проб на агаризованную картофельную среду (PDA, «Sigma», США). Из сока борщевика готовили ряд последовательных разведений и высевали на картофельную среду в чашки Петри (в 3 повторностях).

Протеазную активность выделенных штаммов эндофитных и ризо-бактерий изучали на чашках со средой 0,5х TSA, обогащенной 5 % молока. Липазную активность определяли на чашках с 0,5х TSA с добавлением 2 % Tween 80, глюканазную активность — на 0,5х TSA с лихенаном, целлюлазную — на 0,5х TSA с Na-карбоксиметилцеллюлозой, хитиназную — на чашках с хитином (15). Продукцию ауксинов определяли колориметрическим методом (16). Исследуемые штаммы вносили в жидкую среду Кинга («Sigma», США), содержащую триптофан (250 мкг/мл), и инкубировали 4 сут при 28 °С на качалке (150 об/мин). Выросшие культуры центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин, 1 мл супернатанта добавляли в пробирку с 2 мл реактива Сальковского и 25 мкл ортофосфорной кислоты. Смесь оставляли на 30 мин при комнатной температуре и измеряли интенсивность развившегося розового окрашивания на спектрофотометре Specord S100 («Analytik Jena AG», Германия) при X = 530 нм. Содержание индол-3-уксус-ной кислоты (ИУК) определяли по градуировочному графику.

При видовой идентификации изучаемых штаммов эндофитных и ризобактерий определяли нуклеотидные последовательности гена 16S-рPHК (17). Для ПЦР-амплификации фрагментов использовали универсальные эубактериальные праймеры FD1 и RD1 (18). Амплифицированные фрагменты ДНК выделяли из агарозного геля (19), затем определяли их нуклеотидные последовательности с использованием автоматического секвенатора CEQ2000 XL («Beckman Coulter», США) в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями базы данных GeneBank с помощью программы BLAST (20).

Общий титр штаммов эндофитных и ризобактерий учитывали методом серийных разведений на чашках со средой TSA («Sigma», США). Для мониторинга хозяйственно ценных свойств у перспективных штаммов эндофитных и ризобактерий использовали биотесты по стимуляции роста проростков у кукурузы (Zea mays L.) и пшеницы (Triticum aestivum) согласно описанию (18), а также по подавлению развития фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (FORL), F solani и Phy-tium ultimum LBOP17 (определение зон задержки роста методом лунок при диффузии в агаре).

Эффективность микробных препаратов в вегетационных и полевых опытах изучали по общепринятой методике (19).

В вегетационных опытах использовали среднеспелый сорт салата (Lactuca sativa L.) Ералаш и раннеспелый сорт редиса (Raphanus sativus L.) Дуро. При подготовке субстрата дерново-подзолистую супесчаную почву, взятую на опытном поле Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ), смешивали с торфяным грунтом марки Терравита (ЗАО «МНПП Фарт», Россия) (20 % + 80 %) и добавляли раствор азофо- ски (NPK 16:16:16, ОАО «Акрон», Россия) из расчета 100 % NPK. Вегетационные сосуды объемом 3 л с помещенным в них субстратом (по 5 кг) однократно проливали водопроводной водой (700 мл). Семена редиса проращивались в течение 48 ч при температуре 28 °С. Непосредственно перед посадкой проростки салата на 15 мин замачивали в суспензии ризо- и эндофитных бактерий (107 КОЕ/мл). Семена салата (без проращивания) непосредственно перед посадкой замачивали на 15 мин в бактериальной суспензии (107 КОЕ/мл) следующих штаммов: Bacillus subtilis 4-13 (стандарт, продуцент микробного препарата экстрасол), B. subtilis B2G (стандарт, продуцент микробного препарата Z24), B. subtilis TR6, B. subtilis НС8, Azoto-bacter chroococcum Az7. В контроле семена замачивали в стерильной воде. В подготовленный субстрат семена высаживали на глубину 1,5 см (по 2 шт. в лунку). Лунки располагались конвертом (по 5 лунок на сосуд). После посадки проводили однократный полив (500 мл). После появления всходов салата и редиса в сосуде оставляли по три растения. В процессе вегетации полив осуществляли каждые 3 сут по 100 мл. Урожай салата (надземная часть растений) учитывали через 44 сут, редиса (корнеплоды) — через 35 сут вегетации (собранные образцы взвешивали на электронных весах с точностью до 0,1 г).

Полевой опыт (Рязанская обл., 2013-2014 годы) по выращиванию ячменя (Hordeum vulgare L.) сорта Данута (по озимой пшенице сорта Мироновская 808 как предшественнику) проводили по общепринятой методике (19) в 4-кратной повторности на общей площади 460,8 м² (площадь одной делянки 9,6 м²). Почва участка серая лесная тяжелосуглинистая с высоким содержанием элементов питания. Анализ почвы осуществляли согласно ГОСТ 26483-85, ГОСТ 26213-19, ГОСТ 25336, ГОСТ 26207-91. Агротехника соответствовала общепринятой для культуры в южной части Нечерноземной зоны РФ. Фоновые удобрения вносили весной перед посевом поверхностно вразброс (по действующему веществу, кг/га: диаммофоска — 23, аммиачная селитра — 37). Микробные препараты применяли согласно рекомендациям разработчика. Схема опыта: 1-й вариант — без удобрений (контроль); 2-й вариант — Ne₀P6₀Ke₀ (фон); 3-й вариант — экстрасол (Bacillus subtilis 4-13, стандарт; разработчик — ВНИИСХМ; замачивание семян в 10 % растворе препарата); 4-й вариант — экстрасол + Ng₀P6₀K6₀; 5-й вариант — B. subtilis TR6; 6-й вариант — B. subtilis TR6 + N₆₀P₆₀K₆₀; 7-й вариант — B. subtilis НС8; 8-й вариант — B. subtilis НС8 + Ng₀P6₀Kg₀. Почвенные образцы отбирали с каждой делянки (по 5 разовых проб, из которых составлялся средний образец). Эффективность использования минеральных удобрений определяли разностным методом (5).

Достоверность различий оценивали по Б.А. Доспехову (21).

Результаты. Всего из корней томатов выделили семь штаммов ри-зобактерий, из борщевика — штамм эндофитных бактерий НС8. Определение нуклеотидных последовательностей гена 168-рРНК у изолятов позволило идентифицировать штаммы TR6 и НС8 как B. subtilis (23).

При анализе фунгицидной активности методом лунок было показано, что только штамм TR6 активен против всех тестируемых фитопато-генных грибов Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (Forl), F solani, Pythium ultimum. Диаметр зоны подавления роста составлял 17,4-48,2 мм.

Изучение энзиматической активности ризобактерий показало, что пять из семи изучаемых штаммов (кроме TR9 и TR1) обладали протеазной активностью, два (TR5 и TR6) — липазной, три (Tr10, TR7 и TR6) — глюканазной активностью. Только у двух штаммов (TR7 и TR6) наблюдалась целлюлазная активность и ни один не проявлял хитиназную активность. Изучение продукции ИУК в присутствии триптофана как прекур-338

сора ИУК подтвердило, что практически все исследуемые штаммы (кроме TR7) были способны выделять ауксины. Наибольшую продукцию ауксинов отмечали у штаммов TR9 и TR1 (соответственно 12,3 и 20,1 мкг/мл среды). По хозяйственно ценным свойствам (биоконтроль, стимуляция роста, ферментативная активность) для дальнейших исследований отобрали штамм TR6, идентифицированный как B. subtilis.

Ранее было показано, что штамм эндофитных бактерий B. subtilis НС8, выделенный из внутренних тканей растений борщевика, обладал комплексом хозяйственно ценных свойств и представлял интерес для использования в качестве микробного препарата, увеличивающего продуктивность культурных растений (23-25).

В этой связи мы изучили влияние отобранных ранее пяти перспективных штаммов эндофитных и ризосферных бактерий из родов Bacillus и Azotobacter на продуктивность редиса и салата. На растениях редиса наибольшую достоверную прибавку показали штаммы B. subtilis 4-13 (стандарт, продуцент препарата экстрасол) и B. subtilis. НС8 (эндофит борщевика) — соответственно 27,7 и 42,1 % (табл. 1). Штамм B. subtilis TR6, ранее отобранный как продуцент антифунгальных и ростстимулирующих веществ, достоверно (на 23,9 %) снизил урожай корнеплодов редиса. Другие исследованные штаммы A. chroococcum AZ7, B. subtilis B2G (стандарт, продуцент иностранного препарата Z24) недостоверно (соответственно на 15,3 % и 11,9 %) снижали урожай корнеплодов редиса.

1. Продуктивность редиса (Raphanus sativus L.) и салата (Lactuca sativa L.) при инокуляции перспективными штаммами эндофитных и ризосферных бактерий (вегетационный опыт)

Редис (сорт Дуро)				Салат (сорт Ералаш)
Вариант          масса кор неплода, г		прибавка урожая		урожай биомассы растений, г	прибавка урожая
		г	%		г	%
Контроль	9,91			65,0
Bacillus subtilis 4-13 (продуцент
препарата экстрасол)	12,66*	2,75	27,7	71,5	6,5	10,0
Bacillus subtilis B2G (продуцент
препарата Z24)	8,73	- 1,18	- 11,9	75,9*	10,9	16,8
Bacillus subtilis TR6 (ризобактерия)	7,54	- 2,37	- 23,9	70,6	5,6	8,6
Bacillus subtilis НС8 (эндофит)	14,08*	4,17	42,1	74,9*	9,9*	15,2
Azotobacter chroococcum AZ7
(ризосферная бактерия)	8,39	- 1,52	- 15,3	87,2*	22,2	34,2
НСР 05	1,90			9,3
* Различия с контролем достоверны при Р < 0,05.

Выбранный нами сорт салата оказался более отзывчивым на инокуляцию исследуемыми перспективными штаммами эндофитных, ризосферных и ризобактерий. Так, три из пяти исследуемых (НС8, B2G и AZ7) достоверно увеличивали (на 15,2-34,2 %) биомассу у салата. Штаммы B. subtilis 4-13 и B. subtilis TR6 недостоверно увеличивали урожай зеленой массы салата. Среди изученных штаммов следует отметить штамм B. subtilis НС8, который достоверно увеличивал (на 15,2-42,1 %) урожай редиса и салата в вегетационных опытах.

Таким образом, вегетационные опыты на овощных культурах (салат и редис) показали, что штаммы эндофитных, ризосферных и ризобактерий, ранее отобранные по комплексу хозяйственно ценных свойств, не всегда достоверно влияют на продуктивность сельскохозяйственных культур.

Продолжение изучения их эффективности в полевых мелкоделяноч-ных опытах с ячменем сорта Данута (2-летние опыты, Рязанская обл.) показало, что перспективные штаммы эндофитных и ризобактерий B. subtilis НС8 и B. subtilis TR6, как и стандартный штамм B. subtilis 4-13, достовер- но увеличивали урожайность ячменя (на 13,1-17,6 %) (табл. 2).

Интересно отметить, что от всех исследуемых штаммов эффект был выше, чем от минеральных удобрений (КбоРбоКбо) в рекомендованной дозе. Так, при использовании перспективных штаммов эндофитных и ризо-бактерий, относящихся к B. subtilis, урожайность зерна у ячменя достоверно увеличилась на 23,8-43,9 % относительно контроля и на 11-29 % — по сравнению с вариантом, где вносились только минеральные удобрения. Таким образом, подтверждается, что применение микробных препаратов для обработки семян ячменя — перспективный элемент технологий его выращивания, особенно с учетом расходов на минеральные удобрения.

2. Урожайность ячменя (Hordeum vulgare L.) сорта Данута в полевом мелко-деляночном опыте при инокуляции перспективными штаммами эндофитных и ризосферных бактерий (Рязанская обл., среднее за 2013-2014 годы)

Вариант	Урожайность зерна, т/га	Прибавка, т/га
		к контролю I	к фону
Без удобрений (контроль)	2,44
N 60 P 60 K 60 (фон)	2,72	0,28
Bacillus subtilis 4-13, микробный
препарат экстрасол (стандарт)	2,76	0,32	0,04
B. subtilis 4-13 + N 60 P 60 K 60	3,51	1,07	0,79
B. subtilis TR6 (ризобактерия)	2,87	0,43	0,15
B. subtilis TR6 + N 60 P 60 K 6 0	3,28	0,84	0,56
B. subtilis HC8 (эндофит)	2,80	0,36	0,08
B. subtilis HC8 + N 60 P 60 K 6 0	3,02	0,58	0,30
HCP 05	0,26

Возникает естественный вопрос о механизмах действия перспективных штаммов эндофитных и ризобактерий на растения ячменя. Ранее мы показали, что исследуемые штаммы этих бактерий способны продуцировать ряд фитогормонов (22, 23), которые могут стимулировать развитие корневой системы растений и особенно корневых волосков. Развитие корневой системы инокулированных растений и собственно корневых волосков способствует существенному улучшению поглотительной способности и, соответственно, приводит к улучшению использования применяемых минеральных удобрений. Это было подтверждено в наших полевых мелкоделяночных опытах при подсчете коэффициента использования минеральных удобрений, проведенном разностным методом (табл. 3). Так, эффективность использования азота из минерального удобрения при инокуляции семян ячменя перспективными штаммами эндофитных и ризобактерий увеличивалась на 11,7-22,1 %, фосфора — на 5,1-10,3 %, калия — на 10,2-19,4 %. Отсюда становится понятно, за счет чего достоверно увеличился урожай зерна ячменя в полевом опыте.

3. Эффективность использования питательных веществ из удобрений растениями ячменя (Hordeum vulgare L.) сорта Данута в полевом мелкоделя-ночном опыте при инокуляции перспективными штаммами эндофитных и ризосферных бактерий (Рязанская обл., среднее за 2013-2014 годы)

НагХТЛОТЛ'Г	Коэффициент использования, %
вариант	N |      P 2 O 5      |       K 2 O

N 60 P 60 K 60 (фон)	12,9	5,7	11,4
Bacillus subtilis 4-13 (микробный препарат экстрасол) (стандарт) + N 60 P 60 K 60	35,0	15,4	30,8
B. subtilis TR6 + N 60 P 60 K 6 0	27,9	12,3	24,6
B. subtilis HC8 + N 60 P 60 K 6 0	24,6	10,8	21,6

Итак, выполненное в вегетационных и полевых опытах сравнение эффективности разработанных ранее и предлагаемых микробных препаратов на основе выделенных из корней культурных и диких растений эндофитных и ризобактерий указывает на перспективность совместного применения этих двух групп бактерий в современных биологизированных техноло- гиях выращивания ячменя и овощных культур (салат и редис). Сочетание эндофитных и ризобактерий при разработке микробных препаратов для растениеводства позволяет формировать самодостаточные растительно-микробные системы, снижая себестоимость производства и повышая коэффициент использования минеральных удобрений при возделывании культуры.