Микроклональное размножение Gladiolus х hybridus сорта ‘пермский сувенир’ селекции Учебного ботанического сада ПГНИУ

Одним из современных методов размножения растений является клональное микроразмножение, позволяющее круглогодично и в короткие сроки получать большое количество посадочного материала. Кроме того, метод in vitro позволяет с высокой эффективностью размножать редкие и плохо поддающиеся размножению в обычных условиях виды растений, а также единично полученные уникальные мутанты и гибридные экземпляры [Бабикова, Горпеченко, Журавлев, 2007].

Активная селекционная работа с гладиолусами ведется уже более ста лет и интерес к этим растениям неизменно растет. Появляются новые сорта, которые особенно нуждаются в массовом размножении. Методы клонального микроразмножения позволяют значительно сократить селекционный процесс [Шипунова, 2003]. Исследования последних лет направлены на изучение биологических особенностей различных типов эксплантов, оптимизацию минерального и органического состава питательных сред, повышение коэффициента размножения в культуре in vitro, получение здорового

посадочного материала [Ахмед, 2000; Мокшин, 2005; Prasad, Gupta, 2006; Осипова, 2008; Ruffoni, 2008].

Цель данной работы – оптимизация этапов микроклонального размножения новых сортов Gladiolus × hybridus селекции Учебного ботанического сада Пермского государственного национального исследовательского университета (ПГНИУ) на примере сорта ‘Пермский Сувенир’ (365-ОР-18 Черткова, Шумихин).

Материалы и методы исследований

Исследования проводились в 2018 г. в лаборатории микроклонального размножения кафедры ботаники и генетики растений и в Учебном ботаническом саду ПГНИУ. Сорт ‘Пермский сувенир’ был получен в результате скрещивания сортов ‘Si Foam’ (500-РС-80) и ‘Медовый Спас’ (327-С-97). Высота растений в период массового цветения составляет 105‒120 см, длина соцветия – 58‒61 см. Цветок светло-сиреневый с ярким желтомалиновым пятном на нижних долях околоцветника, имеет ровный с небольшими защипами край. Соцветие плотное, содержит 14‒17 цветков, из которых одновременно раскрыты 7–8. Оценка декоративных признаков составляет 97 баллов, оценка хозяйственно-ценных качеств – 44 балла [Пат. РФ …, 2018].

В качестве первичных эксплантов использованы клубнепочки и апикальные или пазушные почки клубнелуковиц. Всего было высажено 130 клубнепочек и 126 фрагментов клубнелуковиц. Стерилизацию материала проводили несколькими способами. Для клубнепочек применяли один режим стерилизации: раствор нейтрального детергента – 40 мин.; промывка проточной водой – 10

Таблица 1

Варианты питательной среды Мурасиге и Скуга для микроклонального размножения сорта гладиолуса ‘Пермский Сувенир’

Номер	Витамины, мг/л	Фитогормоны
		Ауксины, мг/л	Цитокинины, мг/л
1	+	ИУК – 0.5	–
2	–	–	–
3	0.1 – тиамин	–	–
4	+	ИУК – 1	6-БАП – 0.5
5	+	НУК – 1	6-БАП – 2
6	+	ИУК – 0.1	–
7	+	НУК – 1	6-БАП – 2
8	+	–	–
9	+	НУК – 10	6-БАП – 0.5

Примечание. + витамины по Р.Г. Бутенко 0.1 мг/л тиамин, 0.5 мг/л пиридоксин, 0.5 мг/л никотиновая кислота; прочерк означает отсутствие витаминов и/или регуляторов роста.

Клубнепочки высаживали на первые пять вариантов питательной среды MS, фрагменты клубнелуковиц – на все варианты. Клубнепочки брали самой мелкой категории (менее 4 мм), не рекомендуемые для посадки в открытый грунт [Громов, мин.; 7%-ный раствор гипохлорита натрия – 15 мин., 96%-ный этанол – 30 сек., с последующей промывкой в трех порциях стерилизованной дистиллированной воды по 5 мин. в каждой.

Для клубнелуковиц применяли 4 режима стерилизации, отличающиеся по времени нахождения в нейтральном детергенте и стерилизующем агенте, особенностям выделения почек. Стерилизация клубнепочек и I режим стерилизации клубнелуковиц были аналогичными. II и III режимы стерилизации: раствор нейтрального детергента – 50 мин.; промывка проточной водой – 15 мин.; 7%-ный раствор гипохлорита натрия – 20 мин., 96%-ный этанол – 60 сек.; IV режим стерилизации: раствор нейтрального детергента – 60 мин.; промывка проточной водой – 15 мин.; 7%-ный раствор гипохлорита натрия – 25 мин., 96%-ный этанол – 60 сек. Разделение клубнелуковиц на фрагменты и вычленение почек при I и II режимах проводили после стерилизации, при III и IV – до стерилизации.

Простерилизованный материал и экспланты, полученные при последующих пассажах, высаживали в пробирки на наиболее часто используемую для культуры растительных тканей твердую питательную среду с минеральной основой по Т. Murashige и F. Skoog (MS) [1962], 3%-ной сахарозой, 0.7%-ным агар-агаром. Исследовали влияние на культуру гладиолуса витаминов по Р.Г. Бутенко [1964], а также регуляторов роста: β-индолилуксусной кислоты (ИУК) в концентрациях 0.1; 0.5; 1 мг/л; α-нафтилуксусной кислоты (НУК) в концентрациях 1 и 10 мг/л; 6-бензиламинопурина (6-БАП) в концентрациях 0.5 и 2 мг/л. Всего использовано 9 вариантов среды с разным соотношением витаминов и фитогормонов (табл. 1).

Ардабьевская, 2002].

Питательную среду стерилизовали паром при температуре +120°С под давлением 1.1 атм. в течение 15 мин. Стерилизацию культуральных сосудов, инструментов и оборудования осуществляли согласно общепринятым методикам [Бутенко, 1964]. Процесс высадки эксплантов на питательную среду производили в ламинар-боксе в соответствии с правилами работы со стерильным материалом. Экспланты содержали в климатической камере Binder KBF LQC 240 с фотопериодом 14/10, при температуре +20±2°С.

Через 10‒14 дней после очередного пассажа выбраковывали материал, имевший признаки инфицирования. Одновременно вычисляли отношение числа стерильных объектов к общему числу эксплантов, подвергнутых стерилизации. Жизнеспособность стерильного материала определяли в процентах как число стерильных объектов с признаками регенерации. Часть растений, полученных в культуре in vitro , переносили в Учебный ботанический сад ПГНИУ, где выращивали в условиях открытого грунта. Почва экспериментального участка имеет искусственное происхождение, темно-гумусовая, влагоемкая, хорошо структурированная. Агрофон участка является выровненным. Реакция рН приближается к нейтральной (6.6‒7.2). Содержание органических веществ высокое (17.2– 23.8 мг на 100 г почвы).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета анализа Statistica 5.5. Для сравнения средних значений количественных признаков применяли t-критерий Стьюдента, для сравнения качественных показателей – критерий χ2.

Результаты и их обсуждение

Микроклональное размножение гладиолусов проводится в три этапа, выделение которых является общепринятым [Высоцкий, 1986]. Первый этап включал стерилизацию эксплантов и их посадку на твердую питательную среду MS. В дальнейшем проводилось микроразмножение. Заклю- чительный этап состоял в укоренении растений in vitro и перевод их in vivo.

Определяющую роль на первом этапе микро-клонального размножения играет стерильность культуры, которая для клубнепочек при выбранном режиме была 76.92%. В исследовании Н.Л. Шибановой, М.А. Чертковой, Т.В. Мельниковой [2017] по микроклональному размножению некоторых сортов гладиолуса гибридного клубне-почками с применением аналогичного режима стерилизации, выход стерильной культуры составил более 87%. Клубнелуковицы по-разному реагировали на стерилизацию. Наименьший процент стерильной культуры наблюдался при применении I режима (17.14%), а наибольший – при III (81.25%). II и IV режимы показали средние результаты (68.75 и 56.25% соответственно).

В результате анализа данных по выходу стерильной культуры можно сделать заключение, что клубнелуковицы и клубнепочки сорта ‘Пермский Сувенир’ по-разному реагируют на выбранный режим стерилизации. Стерильность культуры при использовании одинакового способа стерилизации для клубнепочек и клубнелуковиц (I режим) достоверно выше для первого типа экспланта (χ2 = 69.91, р<0.001). Выход стерильной культуры клубнелуковиц после применения I режима стерилизации достоверно ниже, чем при других способах (χ2 = [14.02; 42.71], р<0.001). Разница между II, III, IV режимами стерилизации клубнелуковиц и режимом стерилизации клубнепочек оказалась недостоверной (χ2 = [0.28; 3.38], р>0.001).

Развитие эксплантов начинается через 7 дней после посадки на твердую питательную среду MS, что представлено на рисунке. Результаты по развитию апикальных и пазушных почек клубнелуковиц гладиолуса на твердой питательной среде MS представлены в табл. 2.

Клубнепочки

а                         б

Клубнелуковицы

б

Развитие клубнепочек и клубнелуковиц гладиолуса на питательной среде MS: а – на момент посадки, б – через 21 день после посадки

Таблица 2

Развитие почек клубнелуковиц сорта ‘Пермский Сувенир’ на твердой питательной среде Мурасиге и Скуга

№ варианта среды	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Выживаемость, %	66.67	50.00	0.00	100.00	0.00	81.82	16.67	33.33	21.43
Коэффициент размножения, M±m	3.00±0.00	3.00±0.00	-	2.00±0.71	-	2.00±0.35	3.00±1.00	1.50±0.50	2.00±0.47

Примечания: 1 - с витаминами и ИУК (0.5 мг/л), 2 - без витаминов и фитогормонов, 3 - с тиамином (0.1 мг/л), без фитогормонов, 4 - витаминами, 6-БАП (0.5 мг/л) и ИУК (1 мг/л), 5 - с витаминами, 6-БАП (2 мг/л) и НУК (1 мг/л), 6 - с витаминами, ИУК (0.1 мг/л), 7 - с витаминами, 6-БАП (2 мг/л) и НУК (1 мг/л), 8 - с витаминами, без фитогормонов, 9 - с витаминами, 6-БАП (0.5 мг/л) и НУК (10 мг/л).

Анализ данных по развитию апикальных и пазушных почек клубнелуковиц на твердой питательной среде MS показал, что состав среды влияет на выживаемость эксплантов. Установлена достоверная разница между выходом жизнеспособного материала и составом среды. По критерию х2 экспланты на 4 и 6 вариантах среды были более жизнеспособны, чем на 7, 8 и 9 (х2 = [4.00; 9.76], р<0.05). Между 1-, 2-, 4- и 6-й средами достоверной разницы не обнаружено (х2 = [0.32; 1.88], р>0.05), так же как между 7-, 8- и 9-м вариантами среды (х2 = [0.32; 1.88], р>0.05). Возможно, это связано с тем, что в 1-, 4- и 6-м вариантах пита тельной среды из фитогормонов применили ИУК, более естественный для растений, чем НУК. Между формированием побегов на всех использованных питательных средах статистически достоверной разницы не наблюдалось (t = [0.00; 1.34]

Результаты по развитию эксплантов клубнепо-чек гладиолуса на твердой питательной среде MS представлены в табл. 3.

Таблица 3

Развитие эксплантов клубнепочек сорта ‘Пермский Сувенир’ на твердой питательной среде Мурасиге и Скуга

№ варианта среды	1	2	3	4	5
Выживаемость, %	92.31	95.65	100.00	95.24	82.35
Количество побегов, M±m	2.04±0.07	1.09±0.06	1.00±0.00	1.00±0.00	1.86±0.18
Количество корней, M±m	3.25±0.35	2.91±0.21	3.29±0.26	1.80±0.35	2.57±0.21

Примечания: 1 - с витаминами и ИУК (0.5 мг/л), 2 - без витаминов и фитогормонов, 3 - с тиамином (0.1 мг/л), без фитогормонов, 4 - с витаминами, 6-БАП (0.5 мг/л) и ИУК (1 мг/л), 5 - с витаминами, 6-БАП (2 мг/л) и НУК (1 мг/л).

Анализ данных по развитию клубнепочек гладиолуса на твердой питательной среде MS показал, что состав среды не влияет на выживаемость эксплантов. Статистически достоверной разницы между выходом жизнеспособного материала и составом среды по критерию х2 не выявлено (х2 = [0.01; 3.29], р>0.05). Возможно, это связано с изначальным выбором типа экспланта - клубнепоч-кой, которая в своем составе содержит все вещества, необходимые для прорастания. Однако количество побегов, образовавшихся на клубнепочках на 1 варианте среды, было достоверно больше, чем на других вариантах (t = [4.68; 186.27] >t05 = 1.96). По количеству корней, образовавшихся на клубне-почках, наблюдается похожая картина (t = [2.00; 13.94] >t05 = 1.96), только с 3-м вариантом среды нет достоверной разницы (t = 0.23

В мае-июне 2018 г. 75 растений, выращенных in vitro, и 100 клубнепочек, рекомендуемых для посадки размером более 4 мм, полученных in vivo, были перенесены в условия открытого грунта Учебного ботанического сада ПГНИУ. Приживаемость растений из культуры in vitro в условиях открытого грунта составила 70%, «всхожесть» клубнепочек in vivo - 90%. В конце вегетационного периода 2018 г. был определен диаметр ювенильных клубнелуковиц, который для растений из культуры in vitro составил 2.26±0.38 см и незначительно уступал клубнепочкам, посаженным in vivo - 2.44±0.08 см. Разница по этому показателю оказалась статистически незначимой (t = 1.2205 = 1.96).

Среднее количество образовавшихся клубнепо-чек на одно растение, полученное в культуре in vitro, составило 5.25±1.77, что согласуется с литературными данными [Калинин, Кушнир, Сарнац- кая, 1992], в которых отмечается, что растения, перенесенные с корнями из пробирок в открытый грунт, через 4‒6 месяцев формировали клубнелуковицы с клубнепочками. У растений in vivo образовалось 9.22±0.56 клубнепочек на клубнелуковицу. Однако достоверной разницы между ними не обнаружено (t = 1.16

Заключение

В качестве первичных эксплантов рекомендуется использовать как клубнепочки, так и фрагменты клубнелуковиц, содержащие апикальные и пазушные почки. Для получения хорошо растущей стерильной культуры клубнелуковиц необходимо увеличить время нахождения в нейтральном детергенте с 40 до 50 мин. и в стерилизующем агенте ‒ с 15 до 20 мин. (7%-ный раствор гипохлорита натрия) и с 30 до 60 сек. (96%-ный этанол). Для изученных эксплантов на этапе микроразмножения рекомендуется использовать вариант твердой питательной среды MS с добавлением ИУК в концентрации 0.1–1 мг/л и витаминов – 0.1 мг/л тиамин, 0.5 мг/л пиридоксин, 0.5 мг/л никотиновая кислота. Выход адаптированных растений к условиям открытого грунта составляет 70%.