Микроклональное размножение некоторых сортогрупп лилий

Среди цветочных культур лилии занимают одно из ведущих мест в мире. Такие декоративные качества, как чистота окраски, разнообразие форм, аромат цветков неизменно привлекают внимание, а потенциальные генетические возможности делают виды, разновидности и гибриды ценным материалом для селекции [Пугачева, 2005].

За последние 200 лет в мире создано около 10 тыс. сортов лилий. Международный регистр лилий (The International Lily Register and Checklist) включает 9 разделов. Все лилии, в зависимости от происхождения, классифицированы на 8 основных разделов (сортогрупп), а виды и внутривидовые таксоны выделены в девятый [Отрошко, 2016].

В качестве объектов исследования выбраны сорта из четырех сортогрупп: восточные («Мона Лиза», «Диззи»), трубчатые («Сноу квин » , « Пинк Перфекшн»), азиатские («Эмилия», «Волхова», «Розовая дымка», «Дабл Плеже») и лонгифлорум-азиатские («Глоуб», «Самур»).

Достоинством восточных гибридов (The Oriental Hybrids) являются крупные размеры цветков (15–25 см) и цветоносов. Все сорта теплолюбивы, зацветают поздно, во второй половине лета. Это

одни из лучших выгоночных растений, их можно использовать в контейнерной культуре [Баранова, 1990].

Трубчатые гибриды (Тhe Trumpet Hybrids) включают сорта, представленные сильными и рослыми (до 180 см) растениями с ароматными крупными цветками, которые хорошо размножаются семенами. Следствием этого является неоднородное потомство [Киреева, 1984].

Азиатские гибриды (Lilium Asiatic Hybrids) являются наиболее разнообразными по окраске цветков, неприхотливы, отличаются зимостойкостью и интенсивным вегетативным размножением, сравнительной устойчивостью к болезням [Иванов, 2004].

Лонгифлорум-азиатские гибриды (The Longi-florum and Asiatic hybrids) неприхотливы в выращивании, легко размножаются, устойчивы к бо-тритису [Завадская, 2008].

Большинство культивируемых в настоящее время сортов размножается только вегетативно. Луковички возникают на материнских луковицах или на побеге в небольших количествах [Пинаев, Блинова, Николаенко, 2011]. По данным Р.Г. Бутенко [1999], метод микроклонального размножения позволяет получить из одной чешуи луковицы за 6 месяцев 105 новых растений.

Цель работы – оптимизация этапов микрокло-нального размножения 10 сортов, относящихся к четырем сортогруппам.

Материалы и методы исследований

Исследования были проведены в 2017 ‒ 2019 гг. в лаборатории микроклонального размножения кафедры ботаники и генетики растений Пермского государственного национального исследовательского университета. Эксплантами для введения в культуру изученных сортов лилий стали наружные и внутренние чешуи луковиц размером 0.5‒1.5 см². Апикальная часть чешуй удалялась, так как она обладает низкой способностью к регенерации. Всего было высажено 960 эксплантов.

Стерилизацию эксплантов проводили в три этапа: престерилизация – нейтральный детергент 40‒60 мин. и проточная вода 10 мин.; стерилизация – 7%-ный раствор гипохлорита натрия («Белизна») 20 мин. и 70%-ный этиловый спирт 10 сек. или 12%-ный раствор перекиси водорода 15 мин.; постстерилизация – три смены стерилизованной дистиллированной воды по 5 мин. в каждой. Стерилизация питательной среды в пробирках проводилась в автоклаве Sanyo MLS-3780 при температуре 120ºC под давлением 1 атм. в течение 15 мин. Все этапы микроразмножения проводились в стерильных условиях в ламинар-боксе.

Экспланты высаживались на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга (MS) с повышен- ным содержанием сахарозы (60 г/л). В качестве регуляторов роста использовались ауксины – β-индолилуксусная кислота (ИУК), α-нафтилуксусная кислота (НУК) и цитокинин – 6-бензиламинопурин (6-БАП) в концентрации по 1 мг/л. Также в среду были добавлены такие витамины, как пиридоксин, тиамин и никотиновая кислота в концентрации по 1 мг/л каждый. Всего было использовано 4 варианта среды. Растения выращивались в условиях искусственного освещения в климатической камере «Binder KBF LQC 240» при температуре +22 ± 2°С и освещении 14/10. Через 10‒14 дней проводилась выбраковка материала, который имел признаки инфицирования. Подсчитывалось число стерильных эксплантов к общему числу объектов, подвергнутых стерилизации. Определялась жизнеспособность материала как процент стерильных эксплантов с признаками регенерации.

Для переноса растений, выращенных на твердой питательной среде MS, в условия закрытого грунта, была использована почва, содержащая дерновую землю, речной песок, торф, комплекс минеральных удобрений, вермикулит, дренаж керамзитовый. Растения выращивались в условиях естественного освещения при температуре 20‒24ºС. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием стандартного пакета анализа Microsoft Office Excel. Различия по критериям Фишера и Стьюдента считали статистически значимыми при p < 0.05. По Г.Н. Зайцеву [1973] были приняты уровни варьирования признаков: Cv < 10% – низкий, Cv = 11‒20% – средний, Cv > 20% – высокий.

Результаты и их обсуждение

Определяющую роль на первом этапе микро-клонального размножения играет стерильность культуры. Для сортогруппы азиатские гибриды использовался один режим стерилизации, при котором основными стерилизующими агентами были 7%-ный раствор гипохлорита натрия с экспозицией 20 мин. и 70%-ный этиловый спирт с экспозицией 10 сек. Для остальных исследуемых сорто-групп применялось два режима стерилизации, которые отличались по одному стерилизующему агенту – при втором режиме этиловый спирт был заменен на 12%-ный раствор перекиси водорода с экспозицией 15 мин.

Установлено, что высокий процент выхода стерильной культуры наблюдается только при первом режиме стерилизации. Он составил у сортов: «Самур» – 91 и «Глоуб» – 82 (ЛА-гибриды), «Эмилия» – 90, «Розовая дымка» – 88, «Волхова» – 81, «Дабл Плеже» – 81 (азиатские гибриды), «Сноу квин» – 85 (трубчатый гибрид). По данным работы В.В. Французенка [1997], высоким процентом вы- хода стерильной культуры можно считать, если результат отклоняется на 10–20% от 100. При втором режиме стерилизации получены низкие показатели по выходу стерильной культуры у всех изученных сортогрупп. Процент варьировал от 32 до 44.

Статистически значимых различий не выявлено между сортами внутри сортогруппы (p = 0.21, p < 0.05) и между сортогруппами при втором режиме стерилизации (p = 0.33, p < 0.05). При первом режиме стерилизации статистически значимые различия (р не превышает 0.04, p < 0.05) наблюдаются между сортами разных сортогрупп: «Мона Лиза» (восточный гибрид) и «Пинк Перфекшн» (трубчатый гибрид) / «Самур» (ЛА-гибрид); «Диззи» (восточный гибрид) и «Пинк Перфекшн», «Сноу квин» (трубчатые гибриды) / «Глоуб», «Самур» (ЛА-гибриды) / «Дабл Плеже» (азиатский гибрид); «Пинк Перфекшн» (трубчатый гибрид) и «Волхова», «Розовая дымка» (азиатские гибриды); «Сноу квин» (трубчатый гибрид) и «Самур» (ЛА-гибрид) / «Волхова» (азиатский гибрид); «Глоуб» (ЛА-гибрид) и «Волхова» (азиатский гибрид); «Самур» (ЛА-гибрид) и «Розовая дымка» (азиатский гибрид).

В работе М.А. Соколовой и Г.М. Пугачевой [2010] по микроклональному размножению трубчатых гибридов лилий, при использовании для стерилизации раствора гипохлорита натрия выход стерильной культуры составил 73%, что согласуется с нашими данными: средний процент выхода стерильной культуры по всем сортогруппам составил 79.70±4.56.

Процесс развития эксплантов лилий на твердой питательной среде MS начинается через 3–4 недели после посадки. В это время отмечается появление первых новообразовавшихся луковичек (деток)

Таблица 1

Выход жизнеспособных эксплантов лилий на твердой питательной среде Мурасиге и Скуга, %

Сортогруппа	Сорт	Варианты среды
		I	II	III	IV
Восточные гибриды	«Мона Лиза»	45.0	77.5	55.0	32.5
	«Диззи»	30.0	65.0	67.5	40.0
Трубчатые гибриды	«Пинк Перфекшн»	52.5	90.0	47.5	52.5
	«Сноу Квин»	47.5	85.0	42.5	65.0
ЛА-гибриды	«Глоуб»	50.0	72.5	85.0	35.0
	«Самур»	42.5	65.0	80.0	60.0
	«Эмилия»	41.5	77.0	—	64.5
Азиатские гибриды	«Волхова»	49.0	74.0	—	59.0
	«Розовая Дымка»	53.0	78.0	–	61.5
	«Дабл Плеже»	46.0	72.5	–	48.5

Примечание. I – с витаминами и ИУК (1 мг/л), II – с витаминами и НУК (1мг/л), III – с витаминами и 6-БАП (1 мг/л), IV – без витаминов и фитогормонов; прочерк означает отсутствие данных.

В работе Н.В. Ивановой [1983], для сортогрупп трубчатые и азиатские гибриды на твердой питательной среде MS выявлен наиболее эффективный регулятор роста – НУК в концентрации 1 мг/л, что на экспланте. Формирование листьев происходит через 5–6 недель после посадки (рис. 1).

а               б             в

Рис. 1 . Формирование луковичек на экспланте сорта «Пинк Перфекшн»: а – чешуя луковицы на момент посадки, б – через 3 недели после посадки, в – через 5 недель после посадки

Данные по жизнеспособности эксплантов представлены в табл. 1, из данных которой можно сделать заключение, что для сортогрупп восточные, трубчатые и азиатские гибриды высокий процент выхода жизнеспособных эксплантов отмечается на твердой питательной среде MS с добавлением фитогормона НУК (1 мг/л). Для группы восточные гибриды процент выхода жизнеспособных эксплантов составил у сортов «Мона Лиза» – 77.5, «Диззи» – 65.0; для трубчатых гибридов: «Пинк Перфекшн» – 90.0, «Сноу квин» – 85.0; для азиатских гибридов: «Эмилия» – 77.0, «Волхова» – 74.0, «Розовая Дымка» – 78.0, «Дабл Плеже» – 72.5. Для ЛА-гибридов высокий процент выхода жизнеспособных эксплантов отмечается на питательной среде MS с добавлением фитогормона 6-БАП (1 мг/л): «Глоуб» – 85.0, «Самур» – 80.0.

соответствует полученным нами результатам.

Различия между сортогруппами по выходу жизнеспособных эксплантов на разных вариантах среды MS представлены в табл. 2. Статистически значимых различий между сортами в пределах сортогруппы не выявлено (p = 0.44, p < 0.05).

Таблица 2

Достоверность различий по выходу жизнеспособных эксплантов в зависимости от варианта среды Мурасиге и Скуга

Сортогруппа		Варианты среды                   1
		I	II	III	IV
Восточные гибриды	Трубчатые гибриды	0.33	0.01*	0.06	0.00*
Восточные гибриды	ЛА-гибриды	0.34	0.07	0.00*	0.12
Восточные гибриды	Азиатские гибриды	0.32	0.11	–	0.21
Трубчатые гибриды	ЛА-гибриды	0.31	0.00*	0.00*	0.15
Трубчатые гибриды	Азиатские гибриды	0.35	0.00*	–	0.08
ЛА-гибриды	Азиатские гибриды	0.30	0.09	–	0.00*

Примечание. I – с витаминами и ИУК (1мг/л), II – с витаминами и НУК (1мг/л), III – с витаминами и 6-БАП (1 мг/л), IV – без витаминов и фитогормонов; прочерк означает отсутствие данных; * отмечены значения, достоверные при p < 0.05.

Таким образом, для трех сортогрупп наиболее высокий выход жизнеспособных эксплантов наблюдается на питательной среде MS с добавлением витаминов и фитогормона НУК в концентрации 1 мг/л, средний процент выхода эксплантов с признаками регенерации для восточных гибридов составил 71.50±8,83, для трубчатых гибридов – 87.50±3,53, для азиатских гибридов – 77.50±0,70. Для сортогруппы ЛА-гибриды высокий процент выхода эксплантов с признаками регенерации отмечается на варианте MS с добавлением витаминов и фитогормона 6-БАП (1 мг/л). Он составил в среднем 82.50±3,53.

При размножении лилий in vitro на одной чешуе луковицы можно получить несколько луковичек (деток), что значительно увеличивает коэффициент размножения (табл. 3).

Таблица 3

Коэффициент размножения десяти сортов лилий

Сортогруппа	Сорт	Число деток (шт./эксплант)
		min	max	M±m	cv, %
Восточные гибриды	«Мона Лиза»	4	13	8.3±3.1	38
	«Диззи»	6	11	8.1±1.8	22
Трубчатые гибриды	«Пинк Перфекшн»	3	12	7.2±2.7	38
	«Сноу Квин»	5	10	7.5±1.8	24
ЛА-гибриды	«Глоуб»	2	9	5.5±2.6	40
	«Самур»	5	14	8.7±3.2	37
Азиатские гибриды	«Эмилия»	5	12	8.4±2.5	30
	«Волхова»	3	7	5.0±1.5	31
	«Розовая дымка»	4	8	5.9±1.5	25
	«Дабл плеже»	2	11	7.1±3.0	43

Из данных, приведенных в табл. 3, видно, что самый высокий коэффициент размножения у сортов «Самур» (ЛА-гибрид) – 14 шт./эксплант, «Мона Лиза» (восточный гибрид) – 13 шт./эксплант, «Пинк перфекшн» (трубчатый гибрид) и «Эмилия» (азиатский гибрид) – 12 шт./эксплант. Коэффициент вариации (cv) находится в пределах от 22 до 43 в зависимости от сорта, что свидетельствует о сильном разбросе признака. Для сортогрупп восточные, трубчатые и азиатские гибриды наиболее высокий коэффициент размножения наблюдается на питательной среде MS с добавлением витаминов и ауксина НУК (1 мг/л), для сортогруппы ЛА-гибриды – на среде MS с добавлением витаминов и цитокинина 6-БАП (1 мг/л).

В.В. Французенок [1997] в своей работе отмечает, что наличие фитогормона НУК в твердой питательной среде MS способствовало формирова- нию крупных, хорошо сформированных луковичек с корнями и листьями. При этом коэффициент размножения колебался от 3.9 шт./эксплант у сорта «Медуница» до 11.8 у сорта «Эмилия», что согласуется с нашими данными.

Статистически значимых различий между сортами по коэффициенту размножения не наблюдается (t ср = 1.973, n = 191). Таким образом, для всех изученных сортов любой сортогруппы коэффициент размножения может варьировать от 2 до 14 шт./эксплант.

Растения сортогруппы азиатские гибриды, полученные в культуре in vitro, имеющие ширину листа 0.1‒0.5 мм в мае 2017 г., и растения из сорто-групп трубчатые, восточные и ЛА-гибриды, имеющие ширину листа 0.3‒0.7 мм, в октябре 2018 г., были перенесены в условия закрытого грунта, где выращивались при температуре 20‒24оС. Всего было высажено 131 растение. Через 2 недели после посадки у растений увеличивалась ширина листа до 1‒1.3 см и появлялся третий лист. Выход адаптированных растений из сортогруппы азиатские гибриды составил 67.8%. Данные по выходу адаптированных растений из других сортогрупп представлены на рис. 2.

Рис. 2 . Процент выхода адаптированных растений исследованных сортов лилий

Из гистограммы видно, что выход адаптированных растений у всех изученных сортов составляет 60% и выше. Самый высокий процент отмечается у сорта «Дабл Плеже» – 69, низкий – у сорта «Сноу квин» (60). Статистически значимых различий между сортами не наблюдается (p = 0.26, p < 0.05).

Заключение

Для получения стерильной культуры лилий рекомендуется использовать первый режим стерилизации, при котором основными стерилизующими агентами являются 7%-ный раствор гипохлорита натрия с экспозицией 20 мин. и 70%-ный этиловый спирт с экспозицией 10 сек. Средний процент выхода стерильной культуры для сортогруппы восточные гибриды составил 66.00±7,07, для трубчатых гибридов – 81.00±5,65, для ЛА-гибридов – 87.00±6,36, для азиатских гибридов – 85.00±4,69.

При микроклональном размножении можно использовать твердую питательную среду Мураси-ге и Скуга с добавлением фитогормона НУК в концентрации 1 мг/л – для сортогрупп восточные, трубчатые и азиатские гибриды; с добавлением фитогормона 6-БАП в концентрации 1 мг/л – для ЛА-гибридов. Приживаемость растений, переведенных из условий in vitro в in vivo, составляет 60% и выше.