Микроорганизмы цикла метана в естественных торфяных почвах и гидрологических элементах осушенных торфяников

на торфяные почвы за счет проведения осушительной мелиорации.

Материалы и методы.

Образцы почв. Образцы торфяных почв для исследования были отобраны в октябре 2010 г. в Дубненском болотном массиве Талдомского района Московской области (56°42' с.ш. 37°50' в.д.), который был частично осушен в 1979 г. для добычи торфа и сельскохозяйственного использования. Исследования разнообразия метанокисляющих и метаногенных микроорганизмов проводили в горизонтах 0-10 см торфяной почвы естественного болота и в минеральной почвы соседнего леса, а также в донных отложениях и воде дренажной канавы.

Выделение ДНК. Выделение ДНК из исследуемых торфяных почв проводили с помощью коммерческого набора реактивов PowerSoil DNA Kit (MO BIO, США) в соответствии с рекомендациями производителя.

Амплификация генов pmoA бактерий. Препараты ДНК, выделенные из торфяных почв, были использованы в качестве матрицы для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации с помощью системы вырожденных праймеров A189F –A682R [4] фрагмента гена pmoA. Этот ген кодирует синтез β-субъеди-ницы метанмонооксигеназы (ММО), ключевого фермента ме-танокисления. Амплификацию проводили на приборе MyCycler (BioRad, США). Для эффективного последующего разделения смеси полученных продуктов с помощью денатурирующего градиентного гель-электро-фореза (ДГГЭ) мы использовали так называемую «вложенную» (nested) ПЦР, при которой в качестве матрицы использовали ПЦР- продукт, полученный при первичной амплификации. Второй раунд ПЦР проводили с праймерами mb661R и A189F-GC, к последнему был прикреплён GC-кламп для обеспечения разделения смеси ампликонов в полиакриламидном геле [5].

Амплификация генов mcrA и 16S рРНК ар-хей. Для изучения состава архейных сообществ была выбрана система праймеров 344F-915R, разработанная в 2000 г. [6], которая позволяет амплифи-цировать фрагмент гена 16s РНК архей длиной около 570 пар нуклеотидов. Для оценки разнообразия метаногенных архей был применен анализ фрагмента гена mcrA , кодирующего α-субъединицу метил-коэнзим М редуктазы, предложенной в качестве маркёра на метаногенов [7]. Этот фермент катализирует восстановление метильной группы, связанной с коферментом М, с высвобождением метана. Для постановки ПЦР на mcrA использовали праймеры и протокол, описанные в работе [7].

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез и секвенирование. Разделение ампликонов pmoA бактерий, mcrA и 16S рРНК архей проводили с помощью системы DCode для DGGE ( BioRad, США) в 0,5 TAE буфере, нагретом до 60°С в течение 6 часов при 200 V. Использовали полиакриламидный гель с 8% содержанием акриламида и градиентом денатуранта 50-80%, 30-70% и 4060% соответственно. Окрашивание проводили бромистым этидием, после чего гель отмывали дистиллированной водой и фотографировали с помощью системы Gel Doc( BioRad, США). Выбранные полосы вырезали стерильным скальпелем и элюировали ДНК в стерильной деионизованной воде в течение 24 часов. Воду с ДНК использовали как матрицу для постановки реамплификации, после чего ПЦР-продукт очищали через агарозный гель и секвенировали в сервисной лаборатории с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3 sequencing kit (Applied Biosystems Inc., United States). Полученные последовательности были проанализированы с помощью программного пакета BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, ).

Депонирование последовательностей. Все нуклеотидные последовательности метаногенных и метанотрофных организмов, полученные в даной работе, депонированы в базе данных GenBank под номерами JF965494-JF965498 (метаногены) и JF965499-JF965504 (метанотрофы).

Результаты и обсуждение.

Состав метанотрофных сообществ. В торфяной почве естественного болота (peat Т5) и минеральной почве леса Дубненского болотного массива (soil Т6) преобладали метанотрофы II типа, относящиеся к Alphaptroteobacteria (рис. 1).Однако полученные последовательности значительно отличалась от культивируемых организмов этой группы. Ближе всего к метанокисляющим бактериям естественного болота оказались некультиви-руемые организмы, обнаруженные в заболоченном участке финского озера Кеватон [8] и кислых болотах Северной Англии [9]. Также относительно высокую степень сходства к фрагментам последовательностей гена pmoA из исследованных образцов продемонстрировал некультивируемый клон Methylocystis sp . GSC357, обнаруженный в лесной почве с помощью метагеномного анализа [10].

»UT6DGGE band 3

-----------Metbylosarcina lacue(AAGl 3081)

Me tHylovuham tn tyah onrnxfBAJ 17641)

------Mctbylomtcibbium pe|»pcum (U3I6>2)

----M*thylob»c|^ipgyrhi^phd»i.?rAAX487 7^

^—^——^^^— M cthylom one a m ethanic» (U 31653) tan cultured melharxolropti.c proteoba cterium (ABR0099 9)

p- unctiltute

|— uncultured bacterium (ABV25580) U unculturedbaetenum ^СВ162765) I uncultured bectenum ССЭ162723)

uncultu«»4M*tJ»yIocyrtteR> QSC357 САВЮЛТ^ uncultured ba ct?num (CBI62768)

uneulturedbaclenum

■       Methyl© «mu» Uichoapoaum

----------------------------- Metbylocapsa

— MethylohaIob»uscnmeenas(AJ581 836)

Methyl»<;pGcu#cepwletw*f BatbfNCJQ03977) — Mallxylocbldwm facile (U89301)

anculturcd gamrn a prateoba cterium (ABW?5343) - Metbylbbecter tun-inpnhiHum SV 96 (ZPj07656 563) uncultured bacterium (AAY68466)

96 p water Tl DGGE 6 a nd

1--------petlll DGGE band i^losorna chniale^D^ i 19047^

CASr»5788J)

Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное на основе аминокислотных последовательностей фрагментов pmoA. Последовательности, полученные в данной работе, выделены жирным шрифтом. Номера базы данных GenBank использованных последовательностей фрагментов генов указаны в скобках. Масштаб соответствует 10 аминокислотным заменам на 100 аминокислотных остатков. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap”-анализа 100 альтернативных деревьев (значимыми являются значения более 50).

Таким образом, впервые было установлено, что при осушительной мелиорации торфяников кардинально изменяется состав метанотрофных сообществ. В гидрологических элементах (осушительные канавы) происходит вытеснение метано-трофов II типа метанотрофами I типа. Аналогичные изменения были выявлены нами ранее при анализе лесных и сельскохозяйственных минеральных почв [13], поэтому выявленные закономерности можно рассматривать как индикатор антропогенных нарушений природных экосистем.

Метаногенные сообщества торфяников. Метаногенные археи не были обнаружены в верхнем биогеохимически активном слое торфяной почве естественного болота и лесной почвы ни с праймерами, специфичными для 16s RNA архей, ни с праймерами на функциональный ген метаногенов. Возможно, это связано с тем, что в этих почвами не складываются условия, благоприятные для развития этих организмов, которые являются строгими анаэробами. Другое возможное объяснение – присутствие метаногенов, последовательности 16s RNA и mcrA которых не амплифициру-ются при помощи использованных в данной работе праймеров.

Таблица 1. Сиквенс-анализ полос, вырезанных из полиакриламидного геля

Напротив, в торфяной почве дренажной канавы было обнаружено значительное разнообразие метаногенных архей. Метаногены были обнаружены как с помощью праймеров, специфически связывающихся 16s RNA архей (табл. 1), так и с α-субъединицей метил-коэнзим М редуктазы (рис. 2). Метаногенные археи из торфяной почвы дренажной канавы проявили наибольшее сходство с не-культивируемыми представителями порядков Methanosarcinales и Methanomicrobiales, из почвы рисовников Италии [14] и почвы кислого болота.

Данные, полученные после анализа последовательностей 16s RNA, хорошо дополняются анализом функционального гена метаногенов, так как организмы порядка Methanobacteriales были обнаружены только при ДГГЭ на mcrA. В целом, появление дренажной канавы в естественном болоте привело к развитию широкого спектра метаногенных архей, что, скорее всего, вызвало усиление потока метана из почвы в атмосферу, зафиксированное в полевых исследованиях [15].

1 f--------------Methanogeniwn otganophiluin (BAF74553)

*       Methmomicrobwm mobile BP (AAL2P293)

- Me

—— MelhenocMileusthefmophilvsCAAKIbS^O

----------Methanospinllum hungateiJF.l (AAK16835^)

^— Melhenocotpvscvfum q? TQ8 fBAF46716)

Me than о corp use uhuu parvum (AAP2C906)

— WKultwejaKh4eon(CAQC3314)

------uncultured methanogenic ar«haeon(ABl 18460)

!------ band 4

MethanohneetdickHOBM (BAF5644!)

• •• ।         Methenobwtenum congohns» (BA167W7)

• •-----------Methanob»eirtbactergottschalfcu(AC?K56066>

  —— Mvthenothttmwso

— MethanotomsrpieusKolS (AAL29288)

— MethanocafclococcyfjannwdutDSM266l (NP_247840>

-----Methanosphaera stadtmanae DSM 3091 (AAL29296)

— Methanpbaclcnutr» lYatM»W(PAJ67108)

------Methanobactenum fonexicum | AAL29300)

MethenothenttobetterthennoflexvsCAACZl !W)

-----------------------------------Went I

--------uncult ur e d m ethane genic ar chae on(C AN9 ^767)

— Methanosweimacilme (AAC43419)

Methanern HhyltwwerehuUandita (AAP2O897>

- Methanocoocadee 4kfkense(BAF745?X>

--------Methanelobustindanus(AAC43425^

^^— Metheny и burn ihilmecDSM 4017

।-------------Methanohalophikism ahir(AAC434l 1)

| 84 r Methenohtiobnxn evert4gatum(AAC43408)

Methermi

^^^^^^^^^— M ethe no Met a he runcina cee (AAX5 5 506) ce^eusshengienns (ABK1 5646^

Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе аминокислотных последовательностей фрагментов mcrA. Жирным шрифтом выделены последовательности, полученные в данной работе. В скобках указаны номера GenBank последовательностей, использованных для построения дерева. Масштаб соответствует 10 аминокислотным заменам на 100 аминокислотных остатков. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap”-анализа 100 альтернативных деревьев (значимыми являются значения более 50)

Антропогенное воздействие на торфяные болота нарушает равновесие процессов, определяющих поглощение и эмиссию метана. Вопрос о причине аномально высокого выделение СН4 из элементов дренажной сети до настоящего времени остается дискуссионным. Согласно нашей гипотезе основной причиной является изменение в составе метанотрофных и метаногенных сообществ и, как результат, дисбаланс между микробиологическими процессами образования и окисления метана. Проведенные молекулярно- биологические исследования наглядно продемонстрировали, что в антропогенно нарушенных торфяниках происходят кардинальные перестройки в составе метанотрофных и метаногенных сообществ. Согласно современным представлениям в кислых сфагновых болотах умеренной зоны доминируют метанотрофы II типа (Methylocystis, Methylocella) и гидрогенотрофные метаногены, относящиеся к семейству Methano-microbiales. Антропогенное воздействие, связанное с изменениями гидрологических условий, рН, растительности, содержания доступных ми- 7. неральных соединений углерода и азота приводит к увеличению разнообразия метаногенов и появлению в составе сообществ ацетокластиче-  8

ских метаногенов семейств Methanosarcinales,^. доминирующих, например, в почвах рисовников. Для метанотрофных сообществ наблюдается замена метанотрофов II типа на метанотрофов I типа. Выявленные закономерности могут быть ^9. использованы в мониторинге антропогенного воздействия на болотные экосистемы.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 09-05-01113.                        ₁₀