Микроразмножение in vitro субтропических, декоративных культур и эндемиков Западного Кавказа: оригинальные и оптимизированные протоколы

В современном цветоводстве и садоводстве прослеживается четкая тенденция повышения требований к качеству посадочного материала и его сортименту, что связано с необходимостью использовать высокие технологии оздоровления и тестирования. Кроме того, сокращение сроков получения генотипов с хозяйственно ценными свойствами, ускорение их внедрения в производство, создание и содержание коллекций ценных форм также приоритетны для сельскохозяйственной науки (1).

Решению этих проблем может способствовать применение биотехнологических приемов, с помощью которых становится возможным в широких масштабах получать посадочный материал, свободный от вирусных, грибных и бактериальных болезней, вегетативное потомство у растений, которые трудно размножить в обычных условиях, быстро «тиражировать» ценные клоны сортов и гибридов, длительно хранить растительный материал в контролируемых лабораторных условиях (без контакта с экологическими факторами), осуществлять его международный обмен без риска занести карантинных вредителей, получать формы с измененной плоидно- стью, сомаклональные варианты и трансгенные растения, поддерживать существующее биоразнообразие редких и исчезающих видов, занесенных в Красные книги (2, 3).

К таким эффективным биотехнологическим приемам получения, оздоровления, ускоренной репродукции сортов и гибридов цветочно-декоративных и плодовых растений относится микроразмножение. Однако для многих из них, в частности для субтропических плодовых культур, редких исчезающих видов дикой флоры пока что не предложены методы надежного получения и размножения растений-регенерантов in vitro из изолированных тканей и органов (4, 5).

В СССР работы по использованию клонального микроразмножения для оздоровления растений чая как одной из важнейших субтропических культур были начаты еще в 1980-х годах (6). Подобный подход становится все более актуальным в связи с сокращением сельскохозяйственных площадей, кроме того, впервые появляется возможность для сохранения уникальных генотипов чая в депонированной коллекции в условиях лаборатории. Следует отметить, что в отношении древесных видов сохраняется проблема культивирования in vitro в стерильных условиях. Например, у растений чая основное препятствие в получении асептической культуры — большое количество фенольных соединений (7, 8), содержащихся в молодых побегах, которые используются как экспланты. Еще одна проблема при клональном микроразмножении чая — получение активно растущей стерильной культуры (9).

Среди субтропических культур важное место занимают цитрусовые (10). В нашей стране первые работы по культивированию цитрусовых in vitro проводились также в 1980-х годах (11-13). Несмотря на то, что за рубежом работы по оптимизации протоколов культивирования цитрусовых in vitro многочисленны, до сих пор так и не удалось разработать эффективную методику микроразмножения сортового материала в культуре вегетативных почек (14-16).

Применение биотехнологических методов в отношении декоративных кустарников часто обусловлено тем, что они плохо размножаются вегетативно вследствие очень низкого процента укоренения черенков. В частности, подобное относится к высокодекоративным (имеющим махровые цветки) сортам камелии Camellia japonica L., произрастающим в условиях субтропиков России (17). На территории Большого Сочи одна из самых представительных коллекций высокодекоративных сортов камелии японской произрастает в Субтропическом ботаническом саду Кубани (г. Сочи), основой которой стали растения, привезенные из различных ботанических садов России и из-за рубежа (18).

Все шире применяются биотехнологии для сохранения флористического биоразнообразия, в частности для поддержания растений, численность популяций которых резко падает, а также уникальных слабоизучен-ных форм, способных в будущем расширить и улучшить сортимент возделываемых культур. Созданием коллекций in vitro исчезающих и редких видов занимаются в Индии (19), США (20), Великобритании (21-24), Австралии (25) и в ряде других стран. С 2003 года во Всероссийском НИИ цветоводства и субтропических культур разрабатываются приемы для клонального микроразмножения некоторых уникальных для мировой флоры видов — местных эндемиков Campanula longistyla Fomin., C. alliari-folia Willd., C. latifolia L., C. taurica Juz., C. bzybica (26), Crocus speciosus Bieb. (27). К одному из видов таких редких эндемиков Западного Кавказа, требующих сохранения, относится Lilium caucasicum Miscz. ex Grossh.

( Liliaceae ) (27).

Цель проводимых нами исследований — разработка и совершенствование методов клонального микроразмножения и регенерации субтропических культур, декоративных растений и редких исчезающих представителей местной дикой флоры для ускорения селекции, производства оздоровленного посадочного материала и сохранения биоразнообразия.

Методика . Объектами исследования были растения чая Camelia sinensis (L.) Kuntze сорта Колхида и местной популяции, Citrus limon (L.) Burm сортов Новоафонский, Ударник, Бесколючий, Camelia japonica (L.) сортов Reine des Beautes, David Boschi и Duc de Bretagne, а также эндемичный вид флоры Западного Кавказа Lilium caucasicum Miscz. ex Grossh.

Эсплантами для введения в культуру in vitro у Camelia sinensis служили апикальные и пазушные почки, отобранные на молодых активно растущих побегах текущего года в период с апреля по октябрь. На этапе пролиферации морфогенных структур чая были испытаны три варианта минеральных питательных сред — Мурасиге-Скуга (MS) (28), Гамборга В₅ (29) и WPM (Woody Plant Medium) (30). Микроразмножение C . sinensis (проводили адвентивными побегами и частью побега с пазушной почкой на питательной среде WPM, дополненной 6-бензиламинопурином (6-БАП, 3 мг/л) и аденином (0,9 мг/л).

Для получения стерильной культуры Camelia japonica из апикальных и пазушных почек, также отобранных на молодых активно растущих побегах текущего года в период с апреля по октябрь, было испытано шесть вариантов обработки эксплантов. Варианты различались по набору и концентрации стерилизующих агентов, а также времени их воздействия: 1-й — 70 % этанол (1 мин), 20 % хлорная известь (5 мин), 15 % пероксид водорода (5 мин); 2-й — 70 % этанол (1 мин), 20 % хлорная известь (5 мин), 8,5 % пероксид водорода (3 мин); 3-й — 0,5 % новодез эком-50м (действующие агенты — 25 % хлорид алкилдиметилбензиламмония и поверхностно-активное вещество; производитель ОАО НПО «Новодез», г. Москва) (30 мин); 4-й — 0,2 % новодез (20 мин); 5-й — К₂МпО₄ (30 мин) + 70 % этанол (1 мин) + 0,2 %-й новодез (20 мин) + 5 % пероксид водорода (1 мин); 6-й — K₂MnO₄ (40 мин) + 96 % этанол (1 мин). После каждого стерилизующего раствора образцы трижды промывали дистиллированной водой в течение 10 мин. На этапе введения в культуру in vitro экспланты C . japonica культивировли на питательной среде WPM c фитогормонами 6-БАП (2,0 мг/л) и а -нафтилуксусной кислотой (НУК, 0,5 мг/л). Через 22,5 мес микропобеги пересаживали на питательную среду со следующим содержанием фитогормонов: 6-БАП — 2,5 мг/л, НУК — 0,5 мг/л и гибберелловая кислота (ГК₃) — 1,0 мг/л.

Получение микропривитых растений Citrus limon включало три этапа: выращивание привоев из пазушных почек, выращивание подвоев из сеянцев лимона Мейера ( Citrus х meyeri Meyer) и собственно прививка меристем, полученных от введеных в стерильную культуру пазушных почек. Пазушные почки цитрусовых стерилизовали в течение 25 мин 0,3 % велто-леном (ООО «НПО «ВЕЛТ», Россия); действующее вещество — клатрат четвертичного аммониевого соединения (дидецилдиметиламмоний) с карбамидом. Для получения привоя при культивировании пазушных почек C . limon использовали питательную среду MS с добавлением 6-БАП (0,1 мг/л) и НУК (0,5 мг/л). Культивирование подвоев и микропривытых растений осуществляли на питательной среде WPM, дополненной БАП (1 мг/л) и ГК₃ (2 мг/л). Микропрививки лимона проводили на подвой лимона Мейера ( Citrus х meyeri Meyer) по методике L. Navarro (31) c модификациями

(4). У микропривитых растений динамику приживаемости тканей контролировали микроскопированием («ЛОМО», Россия).

В качестве эксплантов Lilium caucasicum использовали различные части чешуй луковиц, которые стерилизовали в 96 % этаноле 1 мин и далее в 2 % велтолене 10 мин. В качестве первичных питательных сред использовали прописи MS и MS с половинным количеством минеральных солей ( 1 / 2 MS) и различными сочетаниями фитогормонов НУК, 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) (в концентрациях 1,0-2,0 мг/л) и 6-БАП (3 мг/л).

При подготовке питательных сред рН доводили до 5,7, после чего их автоклавировали в течение 20 мин при температуре 120 ° C. Первичные экспланты и микропобеги культивировали при интенсивности освещенности до 5000 лк, 16-часовом фотопериоде и температуре 24±1 ° C.

Полученные данные обрабатывали по Б.А. Доспехову (32) с использованием программного обеспечения MS Office Excel.

Результаты . Основным этапом введения эксплантов в культуру in vitro была отработка режимов стерилизации растительных объектов. Для растений чая сорта Колхида и местной популяции из девяти протестированных вариантов эффективной оказалась ступенчатая стерилизация (последовательная обработка 20 % гипохлоритом натрия, 70 % этиловым спиртом и 0,2 % раствором диацида в течение соответственно 20, 30 и 25 мин).

Применение питательной среды MS (6) с добавлением 6-БАП (2,0 мг/л) и тетрациклина (1000 мг/л) оказалось наиболее эффективным для введения эксплантов чая в культуру in vitro. При культивировании растительных тканей на питательной среде Гамборга В5 с гибберелловой кислотой (ГК3 — 2,0 мг/л) происходило образование витрифицированных (сверховодненных) микропобегов.

Пассирование эксплантов на среде WPM с концентрацией цитокининов 6-БАП 3,0 мг/л и аденина 0,9 мг/л способствовало активной индукции микропобегов растений чая, высота которых достигала в среднем 25,7 мм (табл. 1, рис. 1).

1. Влияние питательных сред и фитогормонов на рост и развитие Camelia sinensis (L.) в культуре in vitro

Питательная среда	Регулятор роста (концентрация)	Формирование микропобегов		Продолжительность культивирования, мес
		число, шт.	| высота, мм
MS	6-БАП (2,0 мг/л) Зеатин (0,5 мг/л) Аденин (0,5 мг/л) ПУК (0,5 мг/л)	22	23,8±0,3	1,5-2
Среда Гамборга (Г 5 )	6-БАП (2,5 мг/л) ГК3 (2,0 мг/л) НУК (0,5 мг/л)	5	18,4±0,2	2-2,5
WPM	6-БАП (3,0 мг/л) Аденин (0,9 мг/л)	32	25,7±0,4	1

Примечание. MS — среда Мурасиге-Скуга, WPM — Woody Plant Medium (см. раздел «Методика»), 6-БАП — 6-бензиламинопурин, ПУК — а -нафтилуксусная кислота, ГК 3 — гибберелловая кислота.

2. Влияние фитогормонов на рост и укоренение микрорастений чая Camelia sinensis (L.) в культуре in vitro

Среда (фитогормон)	Формирование микрорастений	Частота %
	число, шт. | высота, мм	контаминации | ризогенеза

MS (ИМК 1,0 мг/л)	60	10,0±0,5	3,3	0
1 / 2 MS (ИМК 1,0 мг/л, ИУК 0,5 мг/л)	60	60,0±0,9	6,7	0
1 / 2 MS (ИМК 1,0 мг/л, НУК 2,0 мг/л)	60	20,5±0,8	3,3	81,0

Примечание. MS и V2MS — среда Мурасиге-Скуга соответственно с полным и половинным набором минеральных солей, ИМК, ИУК и НУК — соответственно индолил-3-масляная, индолил-3-уксусная и а -нафтилуксусная кислота.

Коэффициент размножения с 3-го составил 1:4.

пассажа возрастал. В среднем он

3,0 мг/л) и аденином (0,9 мг/л) (слева — сорт Колхида, справа — местная популяция).

Рис. 1. Развитие микропобегов чая Camelia sinensis (L.) через 1 мес культивирования in vitro на питательной среде WPM (Woody Plant Medium) с 6-бензиламинопурином (6-БАП,

Оптимальной для укоренения размноженных микрорастений чая (независимо от сортовых особенностей) была питательная среда 1 / 2 MS (с половинным набором минеральных солей), дополненная фиторегуляторами индолил-3-масляной кислотой (ИМК, 1,0 мг/л) и а -нафтилуксусной кислотой (НУК, 2,0 мг/л) (табл. 2, рис. 2).

Рис. 2. Ризогенез у микрорастений чая Camelia sinensis (L.) in vitro на полной питательной среде Мурасиге-Скуга (MS) с добавлением индолил-3-масляной (1,0 мг/л) и а -нафтилуксусной кислоты (2,0 мг/л) (слева — сорт Колхида, справа — местная популяция).

На этой питательной среде через 2,5 мес растения-регенеранты достигли в среднем высоты 20,5±0,8 мм, при этом было получено до 81,0 % укорененных микрорастений чая. Наличие в питательной среде повышенной концентрации ауксинов (ИМК 1,0 мг/л и НУК 2,0 мг/л) способствовало развитию мощной корневой системы. От базального каллуса отрастали 2-3 основных корня длиной 2,5-3,0 см, от которых отходили боковые проводящие корни длиной 1,5-2,0 см с множеством корневых волосков. Весь процесс микроразмножения (от высадки первичного экспланта на питательную среду до укоренения микрорастений) занимал 6 мес.

Известно, что культивирование in vitro вегетативных органов древесных плодовых культур сопряжено с рядом проблем, таких как сложность получения стерильной культуры, низкие коэффициенты размноже- ния и укоренения, низкая жизнеспособность микропобегов (33-36). Повышение эффективности размножения и надежности сохранения in vitro сортов коллекции цитрусовых возможно за счет оптимизации состава питательных сред и использования техники микропрививки. Исследования по оптимизации протоколов микроразмножения и сохранения генетических ресурсов цитрусовых культур выполняются в институте с 2009 года.

При анатомическом контроле приживаемости тканей у микропри-витых растений исследования показали, что через 10-20 сут между микропривоем и подвоем образовывалась общая сосудистая система и меристемы трогались в рост (рис. 3). У таких сортов, как Ударник, Бесколю-чий, Новоафонский, Мейер, приживаемость меристем составила соответственно 65,8; 73,3; 75,2 и 81,6 %. По результатам дисперсионного анализа, доля влияния сорта на приживаемость полученных от него меристем составила лишь 4,8 %, в то время как на влияние источника привоя приходилось 92,4 %; представленные данные достоверны (F ф _акт > F₀₅).

А                        Б                        В

Рис 3 . Приживаемость микропривоя (отмечены стрелками) при микропрививке лимона Citrus limon (L.) Burm сорта Новоафонский на лимон Мейера ( Citrus х meyeri Meyer) in vitro: А, Б — образование общей проводящей системы (через 10 сут), В — начало роста (через 20 сут). Увеличение х400 (Б).

Рис. 4. Коэффициент размножения микропобегов лимона Citrus limon (L.) Burm in vitro в зависимости от их источника и цикла субкультивирования: а — побеги из почек, б — микро-привитые побеги, в — сеянцы.

В целом микропобеги привоя характеризовались более быстрым ростом, чем побеги, полученные из почек взрослых растений. После 3-го цикла микропрививки коэффициент размножения микрочеренков в 2 раза превышал аналогичный показатель для микропобегов из пазушных почек растений-доноров и составил 4,6 шт/побег (рис. 4). При этом коэффициент размножения микропобегов из почек взрос- лых растений после 3-го пассажа существенно не повышался. Таким образом, при перепрививках активируются ростовые процессы благодаря фи- энологическому омоложению. Следовательно, подобный характер морфогенеза открывает большие возможности для массового размножения и оздоровления генотипов лимона.

При отработке этапов клонального микроразмножения высокодекоративных сортов C . japonica одной из наиболее сложных задач (как и для многих других древесных растений) было получение стерильной культуры. Из шести испытанных протоколов лучшие результаты давало последовательное применение K₂MnO₄ (насыщенный раствор), 70 % этанола, 0,2 % новодеза и 5 % пероксида водорода в течение соответственно 30, 1, 20 и 1 мин (37). В этом случае на начальном этапе доля стерильных эксплантов составила 40-42 %, то есть оказалась на 10-15 % выше, чем в других вариантах. Кроме того, при первичном культивировании отмечали положительное действие тетрациклина в концентрации 500-1000 мг/л, добавление которого в питательную среду WPM обеспечивало более высокий (от 29,9 до 45,4 %) выход сохранившихся в культуре in vitro стерильных эксплантов (38). Для пазушных и апикальных меристем C. japonica оптимальным сроком введения в культуру in vitro был конец марта—середина мая, для побегов с пазушными и апикальными почками — конец мая— начало сентября.

При культивировании C . japonica на WPM с высокой концентрацией 6-БАП (2,5-3,0 мг/л) в основании микрочеренков и микропобегов формировался компактный светло-зеленый каллус. Помещая его фрагменты на питательную среду с пониженным содержанием 6-БАП (2 мг/л) и ИУК (0,5 мг/л), через 30 сут наблюдали появление морфогенных зон в каллусной ткани. На такой же питательной среде культивировали микропобеги камелии. Их активный рост происходил у 54,5 % эксплантов. Необходимо отметить, что в культуре ткани C . japonica адвентивные побеги, как, например, у C . sinensis , не развивались . Как следствие, клональное микроразмножение было возможно только за счет увеличения числа междоузлий. У C . japonica коэффициент размножения составил 1:3.

При культивировании in vitro различных частей чешуи луковицы у эндемика L . caucasicum показали, что индукция морфогенеза была неодинакова: через 48 сут в стерильных условиях из базальной и медиальной частей развивались преимущественно адвентивные побеги, реже происходил каллусо- и ризогенез, тогда как в апикальных частях преобладал каллусогенез (табл. 3).

3. Развитие эксплантов Lilium caucasicum Miscz. ex Grossh. из разных частей чешуи луковицы на полной среде MS с добавлением НУК (1 мг/л) и 6-БАП (3 мг/л) через 48 сут после введения в культуру in vitro

Использованная часть чешуи	Число эксплантов, шт. ( X ± х )
	всего	с ризогенезом	с индукцией адвентивных почек	с каллусогенезом	без развития
Базальная           45        13,0±1,07           20,0±0,53          12,0±0,92             0 Медиальная         45        13,0±1,92           15,0±1,60           9,0±0,92          8,0±1,07 Апикальная         45         2,0±0,53            3,0±0,92           7,0±1,07         33,0±0,92 Примечание. MS — среда Мурасиге-Скуга, НУК — а -нафтилуксусная кислота, 6-БАП — 6-бен-зиламинопурин.

Медиальные части чешуй формировали корни с той же частотой, что и базальные, тогда как развитие по интересующему нас типу (с образованием адвентивных почек и каллусов) отмечалось значительно реже (рис. 5). Реакция апикальных частей на индукцию была менее выраженной, причем изменения эксплантов происходили в их базальной части и проявлялись преимущественно дедифференцировкой клеток и развитием каллусной ткани. Впоследствии при переносе каллусов на среду MS с ауксином 2,4-Д (2 мг/л) наблюдали формирование морфогенных зон и развитие микролуковичек в очагах интенсивного органогенеза (см. рис. 5).

Рис. 5. Адвентивные побеги (слева) и каллусогенез (справа) у эксплантов эндемика Lilium caucasicum Miscz. ex Grossh., полученных из медиальной части чешуи луковицы, на полной среде Мурасиге-Скуга с добавлением а -нафтилук-сусной кислоты (1 мг/л) и 6-бен-зиламинопурина (3 мг/л) .

Итак, для клональ ного микроразмножения Camelia sinensis (L.) Kuntze в качестве эксплантов лучше использовать апикальные и латеральные меристемы размером 0,30,5 см, отобранные с мая по октябрь. Пассирование эксплантов на среде WPM (Woody Plant Media) с цитокининами 6-бензиламинопурином (6-БАП, 3,0 мг/л) и аденином (0,9 мг/л) способствовало индукции многочисленных адвентивных микропобегов. При этом коэффициент размножения составил 1:4. Активный рост микропобегов у C. japonica L. также отмечали на питательной среде WPM с фиторегуляторами — 6-БАП (2 мг/л) и индо-лил-3-уксусной кислотой (ИУК, 0,5 мг/л) при коэффициенте размножения 1:3. У сортов Citrus limon (L.) Burm in vitro целесообразно использовать микропрививку, обеспечивающую надежное сохранение генотипов и увеличение коэффициента размножения в 2 раза. У лилии кавказской Lilium caucasicum Miscz. ex Grossh. (эндемик) индукция адвентивных почек активно происходила из базальной части чешуи луковицы и составила 44,5 %. Проведенное изучение факторов, влияющих на органогенез в культуре in vitro у субтропических и декоративных растений, пополняет знания о морфогенезе в целом и позволяет разработать биотехнологическую методоло гию получения, сохранения и размножения ценных генотипов.