МикроРНК в мониторинге эволюции глиальных церебральных опухолей

Глиальные церебральные опухоли (ГЦО) – первичные опухоли центральной нервной системы, развивающиеся из глиальной ткани. По данным центрального регистра новообразований головного мозга США, они встречаются примерно в 26 % всех первичных опухолей центральной нервной системы. Среди всех злокачественных опухолей головного мозга доля глиом доходит до 81 % [1]. Согласно классификации опухолей центральной нервной системы, опубликованной Всемирной организацией здравоохранения в 2016 г. [2], к диффузным глиомам взрослых относятся астроцитарные опухоли, олигодендроглиомы и глиобластомы (ГБ). Встречаемость ГБ составляет 47,7 % среди злокачественных опухолей головного мозга и 56,6 % всех случаев глиом. Средний возраст пациентов с ГБ на момент постановки диагноза составляет 60–65 лет [3]. Стандартная терапия ГБ подразумевает комбинированное применение хирургических методов, лучевой терапии и химиотерапии с использованием базового препарата темозоломида. Тем не менее общая медиана выживаемости таких пациентов составляет 4,9 мес [2, 4]. Для наиболее часто поражаемых возрастных групп (55–64 и 65–74 года) показатели 1-годичной выживаемости составляют 45,6 % и 28,7 % соответственно, снижаясь до 4,6 % и 2,4 % через 5 лет после установления диагноза [5].

Такое положение дел объясняется высокой степенью злокачественности, агрессивным характером роста и высокой инвазивностью ГЦО и особенно ГБ, что делает прогноз течения заболевания крайне неблагоприятным [6]. Кроме того, ухудше- нию прогноза способствуют: наличие «функционально значимых вариантов» локализации ГЦО, что затрудняет возможность максимально полного удаления опухоли; высокая склонность к рециди-вированию; развитие осложнений комбинированного лечения, включая постлучевой патоморфоз; а также нередко малая эффективность химиотерапии [7–9]. Все это заставляет вести поиск новых маркеров для ранней диагностики, мониторинга течения и прогноза ГЦО.

МикроРНК – это большой класс эндогенных малых молекул РНК длиной 20–25 нуклеотидов [10], которые регулируют экспрессию генов, приводя к прямому разрушению целевых мРНК или ингибируя трансляцию посредством комплемен-тарности к целевым мРНК [11]. Эти целевые гены контролируют множественные биологические процессы, включая патологические, такие как онкогенез [12].

В литературе активно обсуждается роль различных микроРНК, участвующих в эволюционировании ГЦО. Было показано, что микроРНК-21 обладает антиапоптотической и проинвазивной функцией, способствуя росту и пролиферации опухолевых клеток посредством сайленсинга онкосупрессора PTEN [13, 14]. Напротив, микроРНК128 может активировать ряд генов, отвечающих за механизмы подавления опухолевого роста, ингибирование ангиогенеза глиальных клеток, их самообновление и пролиферацию [15, 16], а микроРНК-342, модулируя экспрессию гена PAK4, участвует в контроле пролиферации клеток ГЦО, инвазии и апоптоза [17]. Не вызывает сомнения тот факт, что клетки ГЦО являются активными и преимущественными продуцентами указанных микроРНК. Так, повышенная экспрессия микроРНК-21 в клетках глиомы была подтверждена исследованиями in vitro [18] и на клеточной линии глиобластомы T98G. Подобные исследования проведены также в отношении микроРНК-128 [19] и микроРНК-342 [17]. Таким образом, микроРНК в качестве маркеров могут не только отражать состояние опухоли в целом, но и быть использованы для мониторинга ГЦО на фоне комплексного лечения.

Однако большинство исследований посвящено лишь некоторым аспектам значения уровней экспрессии различных микроРНК при глиомах без сопряжения с общей клинической характеристикой пациентов на различных этапах комплексного лечения ГЦО [20, 21].

Цель исследования – изучить возможности клинического использования оценки экспрессии микроРНК-21, -128 и -342 в плазме крови и слюне пациентов для оперативного мониторинга течения ГЦО на стадии их прогрессирования или стабилизации на фоне использования комбинированного лечения.

Материал и методы

Основную группу составили 56 пациентов (34 мужчины и 22 женщины) в возрасте от 25 до 72 лет (средний возраст – 48,5 лет) в процессе комплексного лечения супратенториальных ГЦО.

Всем больным основной группы на начальном этапе лечения ГЦО произведено хирургическое вмешательство с использованием интраоперационной компьютерной нейронавигации, интраоперационного электрофизиологического и последующего нейровизуализационного контроля головного мозга в динамике. В зависимости от резектабельности новообразования у 81,6 % пациентов выполнено тотальное и субтотальное удаление ткани новообразования (не менее 75 % объема опухолевой ткани), а у 10,4 % – парциальное (не менее 50 % объема опухоли). Стереотаксическая биопсия применена у 8 % больных. Согласно гистотипу [2], церебральные опухоли распределились следующим образом: анапластическая астроцитома (n=28), пилоцитарная астроцитома (n=11), глиобластома (n=17). Чаще опухоль была расположена в лобной (36,3 %) и височной (32,4 %), реже в теменной (24,6 %) и затылочной (4,7 %) долях головного мозга, мультифокальный рост встречался в 2 % случаев. Через 2–4 нед после операции назначалась дистанционная лучевая терапия (ЛТ) в режиме стандартного фракционирования в разовой дозе 1,8–2,0 Гр 5 раз в неделю, СОД 55–60 Гр. Комбинированное химиолучевое лечение проводили при злокачественных (Grade IV) ГЦО в виде ежедневного приема темозоломида в течение курса ЛТ. В последующем периоде проводили поддерживающую цикловую монохимиотерапию темозоломидом или полихимиотерапию с применением препаратов нитрозометилмочевины (по схемам PCV, CV).

Клинические данные пациентов, а также результаты позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), МРТ и компьютерной томографии были изучены в контексте исследования уровней экспрессии микроРНК-21, -128, -342 в плазме крови и слюне на различных этапах комплексного лечения ГЦО.

Группу контроля составили 50 человек, из них 45 потенциально здоровых волонтёров и 5 нейрохирургических больных c экстрацеребраль-ными опухолями (конвекситальными и парасагиттальными менингиомами). В контрольной группе во всех случаях оценивался уровень экспрессии микроРНК-21, -128, -342 в плазме крови и слюне.

Исследование относительной экспрессии микроРНК-21, -128 и -342 проводили по полуко-личественному протоколу, используя в качестве референц-гена малую РНКU6 [22]. Тотальную РНК выделяли из биоматериала (слюна, кровь) с помощью реактива ExtractRNA (Евроген, Москва) в соответствии с инструкцией. Для приготовления копийной ДНК (кДНК) и полимеразной цепной

Таблица 1/Table 1

микроРНК/ microRNA	Последовательности праймеров/ The sequence of primers
микроРНК-21/ microRNA-21	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAAC
микроРНК-128/ microRNA-128	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAGAG
микроРНК-342/ microRNA-342	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACGGGT
РНК U-6/ RNA U-6	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAATATG

Таблица 2/Table 2

Последовательности праймеров для ПЦР

The sequence of primers for PCR

микроРНК/ microRNA	Последовательности праймеров/ The sequence of primers
микроРНК-21 (прямой)/ microRNA-21 (forward)	GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG
микроРНК-128 (прямой)/ microRNA-128 (forward)	GCCCGCTCACAGTGAACCGGTC
микроРНК-342 (прямой)/ microRNA-342 (forward)	GCCCGCTCTCACACAGAAATCGCA
РНК U6 (прямой)/ RNA U6 (forward)	GCGCGTCGTGAAGCGTTC
Общий обратный/ Common reverse	GTGCAGGGTCCGAGGT

Последовательности праймеров для обратной транскрипции

The sequence of primers for reverse transcription

реакции (ПЦР) использовались оригинальные праймеры (табл. 1 и 2). Для приготовления кДНК была использована технология StemLoop со специфическими праймерами, раздельно для каждой микроРНК с использованием набора для обратной транскрипции «ОТ-1» (Синтол, Москва) согласно инструкции. Температурный профиль реакции был следующий: 16 ºС – 30 мин, 42 ºС – 30 мин, 85 ºС – 5 мин. В качестве ПЦР смеси была использована 2,5× реакционная смесь с интекали-рующим красителем EVA Green (Синтол, Москва). Амплификацию проводили в режиме RealTime на приборе DTLite-4 (ДНК-Технология, Москва) по стандартной двухпраймерной схеме по полуколи-чественному протоколу.

Температурный профиль амплификации: 95 ºС – 5 мин, затем 45 циклов (95 ºС – 15 сек и 60 ºС – 1 мин). Оценка относительного уровня экспрессии генов микроРНК проводилась по протоколу ΔСt и рассчитывалась по формуле 2(-(А-В)), где А – Ct гена микроРНК, а В – Ct гена U6 [23]. Полученный результат выражали в условных единицах экспрессии (УЕ).

Сравниваемые группы были статистически сопоставимы. Полученную в процессе исследования информацию обрабатывали c использованием компьютерной программной системы Statis-tica for Windows. Критерием статистической достоверности считали величину p<0,05.

Результаты и обсуждение

В контрольной группе экспрессия исследуемых микроРНК была принята за лабораторный референт. Данные, полученные при обследовании пациентов в основной группе в зависимости от биологического материала, представлены в табл. 3.

В основной группе обращало на себя внимание частое несоответствие между степенью нейро-визуализационных изменений и клиническим статусом пациентов, т.е. нередко наблюдалась нейровизуализационная прогрессия заболевания при клинической стабилизации. У 70 % пациентов при наличии прогрессии по МРТ не наблюдалось значимых изменений общемозговой и очаговой неврологической симптоматики. В то же время уровень экспрессии микроРНК-21 превосходил значения референта как в плазме крови, так и в слюне. Напротив, экспрессия микроРНК-128 и -342 была сниженной в 32 % наблюдений.

В основной группе распределение показателей микроРНК по квартилям представлено в табл. 4. Распределение степеней экспрессии микроРНК21 по квартилям было сопряжено со степенью злокачественности глиом (Grade I–IV): r = +0,94, а микроРНК-128 и -342: r = +0,65.

При скрининге с учетом данных экспрессии микроРНК контрольной группы была построена модель с итоговой точностью различий, равной 74 % (между контрольной и основной группами).

Таблица 3/Table 3

микроРНК/ microRNA	Группы/Groups
	Контроль/Control	Пациенты/Patients
микроРНК-21 (плазма)/ microRNA-21 (plasma)	0,06 ± 0,041*	3,56 ± 0,654
микроРНК-21 (слюна)/ microRNA-21 (saliva)	0,05 ± 0,039*	2,45 ± 0,731
микроРНК-128 (плазма)/ microRNA-128 (plasma)	2,33 ± 0,033*	0,01 ± 0,002
микроРНК-128 (слюна)/ microRNA-128 (saliva)	0,13 ± 0,042*	0,04 ± 0,004
микроРНК-342 (плазма)/ microRNA-342 (plasma)	1,32 ± 0,021*	0,31 ± 0,027
микроРНК-342 (слюна)/ microRNA-342 (saliva)	0,09 ± 0,018*	0,04 ± 0,003

Примечание: * – различия между группами статистически значимые (p<0,001).

Note: * – differences between the groups is a statistical significance (p<0.001).

Таблица 4/Table 4

Квартили, микроРНК/ Quartiles, microRNA	I квартиль 0–25 % экспрессии/ I quartile 0–25 % expression	II квартиль 25–50 % экспрессии/ II quartile 25–50 % expression	III квартиль 50–75 % экспрессии/ III quartile 50–75 % expression	IV квартиль 75–100 % экспрессии/ IV quartile 75–100 % expression
микроРНК-21 (плазма)/	0,057 ± 0,033 –	0,32 ± 0,02 –	1,45 ± 0,08 –	1,79 ± 0,67 –
microRNA-21 (plasma)	0,32 ± 0,02	1,45 ± 0,08	1,79 ± 0,07	3,56 ± 0,65
микроРНК-21 (слюна)/	0,037 ± 0,053 –	0,1 ± 0,014 –	0,28 ± 0,077–	1,6 ± 0,4 –
microRNA-21 (saliva)	0,1 ± 0,014	1,28 ± 0,077	1,6 ± 0,04	2,45 ± 0,73
микроРНК-128 (плазма)/ microRNA-128 (plasma)	>0,07	0,008 ± 0,002	<0,07	Не выявляются/ no detected
микроРНК-128 (слюна)/ microRNA-128 (saliva)	>0,01	0,04 ± 0,004	<0,01	Не выявляются/ no detected
микроРНК-342 (плазма)/ microRNA-342 (plasma)	>0,31	0,31 ± 0,027	<0,31	Не выявляются/ no detected
микроРНК-342 (слюна)/ microRNA-342 (saliva)	>0,01	0,04 ± 0,0034	<0,01	Не выявляются/ no detected

Данные экспрессии по группам (УЕ)

Groups expression data (UE)

Распределение УЕ микроРНК в группе пациентов по квартилям

The distribution of UE microRNAs in a group of patients by quartiles

Уровни экспрессии микроРНК-21, -128 и -342 не выходили за рамки референтных значений, высоко коррелируя со стабилизацией ГЦО.

Более чем у половины больных (55 %) основной группы нарастание размеров опухоли при нейровизуализации сопровождалось увеличением индекса накопления (ИН) радиофармакологического препарата 11С метионина при ПЭТ, что отражало рост метаболической активности ГЦО. Средний ИН при прогрессии ГЦО составил 2,5 ± 0,41 и значимо отличался от такового в группе больных со стабилизацией и высокой стабилизацией опухоли: ИН=1,42 ± 0,16 (p=0,02).

Прогрессия ГЦО, выявленная при нейровизуа-лизационном (МРТ) и ПЭТ исследованиях, также коррелировала со степенью экспрессии микроРНК-

21(r=+0,74), -128 и -342 (r=+0,69). Однако при наличии сопутствующего церебрального лучевого поражения после проведенной лучевой терапии ГЦО, наоборот, повышалась до r=+0,78. Данное обстоятельство, возможно, объясняется массивным разрушением клеток опухоли, которые являются основными продуцентами микроРНК-21, что может компенсаторно модулировать экспрессию микроРНК-128 и -342. Для более полного освещения этого вопроса нами планируется дальнейшее расширение диагностической панели микроРНК.

Диагностическая значимость для ГЦО микроРНК-128, -342 на фоне дополнительной верификации статистических методов исследования составила 69 %, что предполагает использование этих микроРНК в клинической практике.

Заключение

Таким образом, результатом проведенного исследования является получение данных по уровням экспрессии микроРНК-21, -128 и -342 в контрольной группе. В качестве референтных эти данные можно использовать для оценки уровней микроРНК в группе пациентов с ГЦО. Показано, что уровень экспрессии проопухолевой микроРНК-21 значимо повышался при прогрессировании ГЦО и нормализовался при стабилизации опухолевого процесса. Однако при возникновении у пациентов сопутствующего лучевого церебраль- ного поражения диагностическая значимость микроРНК-21 снижалась. Уровни экспрессии микроРНК-128 и -342 имели обратную корреляцию с прогрессированием ГЦО. Причем эти уровни были статистически значимы при исследовании как плазмы крови, так и слюны пациентов, что дает возможность валидизации малоинвазивного мониторинга процессов эволюции глиом. Для увеличения клинической информативности разработанная панель планируется к расширению с добавлением как про-, так и антиопухолевых микроРНК.